UJI BIOAKTIFITAS EKSTRAK LIPID DALAM Zymomonas mobilis DENGAN METODE BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) Oleh ELOK WIDAYANTI 1406 201 808 PROGRAM MAGISTER KIMIA FMIPA ITS Surabaya 2008
Divisio Sub Divisio Kelas Famili Genus Spesies : Bacteria : Proteobacteria : Alpha Proteobacteria : Sphingomonadaceal : Zymomonas : Zymomonas mobilis Klasifikasi Zymomonas mobilis Kelebihan Zymmomonas mobilis mampu bertahan hidup pada lingkungan dengan kadar alkohol yang tinggi (Herman, dkk; 1991)
Zymomonas mobilis
Zymomonas mobilis o Sahm,1991 Total hopanoid pada Zymomonas mobilis ATCC 29191 adalah 30 mg/g berat sel kering o Flesch dan Rohmer 1989 Hopanoid dalam Z.mobilis yang terdeteksi : diplopten (0,2 mg/g berat sel kering), diplopterol (0,8 mg/g), bakteriohopanotetrol (1 mg/g), bakteriohopanotetrol eter (1,7 mg/g) o Nagumo, 1991 Bacteriohopane-32-ol mempunyai efek citotoxic dengan mencegah dua lines sel leukemia o Chen, 1994 Bakteriohopan-32,33,34,35-tetrol (Tetrol), bakteriohopan-32-ol, diplopten, diplopterol dan bakteriohopan-32-ol terasetilasi yang diisolasi dari bakteri Acetobacter aceti mempunyai efek citotoksik terhadap sel leukemia L1210 dan P388. o Diharapkan dapat digunakan sebagai sumber bioaktif
Bioaktif dapat dapat diuji melalui aktifitas ekstrak lipid uji pendahuluan dengan BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) (Meyer dan Ferrigini,1982) Keunggulan BSLT : perkembangbiakannya cepat, harganya murah, metode percobaannya mudah, sampel yang diperlukan sedikit, tidak memerlukan laboratorium yang khusus dan hasilnya dapat dipercaya (Steven dan Russel, 1993).
RUMUSAN MASALAH Bagaimana efek ekstrak lipid Zymomonas mobilis terhadap pertumbuhan Artemia salina (BSLT)? Tujuan Penelitian Untuk memperoleh LC50 ekstrak lipid pada Artemia salina Senyawa-senyawa yang terdapat dalam ekstrak lipid
Metodologi Penelitian P P R O S E D U R Pembuatan kurva pertumbuhan Produksi Biomassa Ekstraksi lipid total Uji toksisitas dengan metode BSLT Skrining Hopanoid
Hasil dan Pembahasan Ekstrak lipid yang diperoleh adalah sebesar 0,37 g atau 19,47% terhadap berat sel kering. Menurut Ketchum (1988) kandungan lipid total dari sebagian spesies-spesies bakteri berkisar 1%-10%. Dengan demikian kandungan lipid pada bakteri Zymomonas mobilis tergolong cukup besar, hal ini kemungkinan disebabkan adanya lipid membran seperti hopanoid, glikolipid, fosfolipid, dan asam lemak
Jumlah rata-rata udang laut (Artemia salina L) yang mati pada larutan uji ekstrak lipid Konsentrasi (ppm) Hidup Rata-rata hidup Mati Rata-rata mati 500 0 0 0 0 10 10 10 10 250 5 0 0 2 5 10 10 8 125 6 5 5 5 4 5 5 5 62,5 5 7 7 6 5 3 3 4 31,25 6 7 8 7 4 3 2 3
Perhitungan % mortalitas udang laut (Artemia salina L) pada larutan uji ekstrak lipid Konsentrasi (ppm) Log Konsentrasi Mati Akumulasi (A) Hidup Akumulasi (C) Ratio Mati total Mortalitas (%) 500 2,6990 30 0 1 100 250 2,3979 20 2 0,9090 90,9 125 2,0969 12 7 0,6316 63,2 62,5 1,7959 7 13 0,35 35 31,25 1,4949 3 20 0,1304 13,0
Ratio Mati Total = A B D A= jumlah Artemia salina yang mati pada larutan uji B= jumlah Artemia salina yang mati pada kontrol D= jumlah Artemia salina total (A+C)
log konsentrasi vs %m ortalitas %mortalitas 120 100 80 60 40 20 0 y = 76.346x - 99.672 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 log konsentrasai Grafik hubungan antara konsentrasi ekstrak lipid dengan % mortalitas larva udang (Artemia salina L)
Regresi linier y = 76,346x 99,672 50 = 76,346x 99,672 x = 1,96 x = log c c = 91,2 ppm LC 50 = 91,2 ppm
Ekstrak lipid memiliki nilai LC 50 sebesar 91,2 ppm. Suatu senyawa dikatakan aktif jika memiliki harga LC 50 250 ppm dan dikatakan tidak aktif jika memiliki harga LC 50 > 250 ppm (Meyer dan Ferrigini,1982). Nilai LC 50 untuk ekstrak lipid adalah 91,2 ppm, hal ini menunjukkan bahwa senyawa tersebut bersifat aktif dan memiliki sifat bioaktifitas tinggi, yang artinya pada konsentrasi yang kecil sudah bersifat toksik dan mematikan terhadap larva udang.
Analisis Hopanoid Terasetilasi dengan KG-MS
Kromatogram SM puncak ke 28 Waktu retensi (t R ) 27,317 menit
Spektra Massa puncak ke 28 dengan waktu retensi 27,317 menit merupakan spektra dari asam palmitat mempunyai peak dasar m/z 43 yang merupakan ciri dari fragmen asetil. Fragmen yang lain merupakan rantai alkil, yaitu m/z 115, 171, 185. Fragmen dengan m/z 256 merupakan Mr dari asam lemak ini. Struktur asam palmitat ditunjukkan pada gambar berikut : O OH
Kromatogram SM puncak ke 30 Waktu retensi (t R ) 27,763 menit
Fragmen-fragmen ion yang muncul pada gambar di atas adalah m/z 83, 97, 55 dan 69 dimana fragmen ion ini khas dari alkilsikloheksana. dimana teridentifikasi m/z 196 sebagai massa molekul relatifnya. Berdasarkan identifikasi tersebut, maka senyawa pada puncak ke 30 adalah alkil sikloheksana dengan rumus molekul C 14 H 28. Struktur senyawanya dapat dilihat pada gambar berikut :
Kromatogram SM puncak ke 35 Waktu retensi (t R ) 28,944 menit % 100.0 43 75.0 50.0 25.0 0.0 57 69 55 83 84 97 111 Gambar 4.9 Kromatogram SM puncak ke 35 125 109 129 139 154 167 182 195 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 210
Beberapa fragmen ion yang muncul pada gambar di atas adalah m/z 83, 97, 55 dan 69 dimana fragmen ion ini khas dari alkilsikloheksana. Kemudian teridentifikasi m/z 210 sebagai massa molekul relatifnya. Berdasarkan identifikasi tersebut, maka senyawa pada puncak ke 35 adalah alkil sikloheksana dengan rumus molekul C 15 H 30. Struktur senyawanya dapat dilihat pada gambar berikut :
Kromatogram SM puncak ke 42 Waktu retensi (t R ) 31,486 menit 100.0 % 43 75.0 50.0 55 83 69 97 25.0 0.0 84 111 125 44 116 139 153 168 182 196 207 224 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0
Beberapa fragmen ion yang muncul pada gambar di atas adalah m/z 83, 97, 55 dan 69 dimana fragmen ion ini khas dari alkilsikloheksana. Kemudian teridentifikasi m/z 224 sebagai massa molekul relatifnya. Berdasarkan identifikasi tersebut, maka senyawa pada puncak ke 42 adalah alkil sikloheksana dengan rumus molekul C 16 H 32. Struktur senyawanya dapat dilihat pada gambar berikut :
Struktur teridentifikasi Asam Palmitat Alkil sikloheksan Asam Palmitat LC 50 Aktif pada uji BSLT Pernyataan ini didukung oleh penelitian yang telah dilakukan oleh Ratna Djamil dkk menyebutkan pada ekstrak metanol mempunyai nilai LC50 178,2 ppm. Dari ektrak metanol telah diisolasi tiga senyawa yaitu kolesta-2,4-dien- 3ol asetat (24-dehidrokolesterol asetat) atau desmosterol asetat, asam tetradekanoat (asam miristat) dan asam heksadekanoat (asam palmitat).
KESIMPULAN Ekstrak lipid pada Zymomonas mobilis memiliki nilai LC 50 sebesar 91,2 ppm dimana menunjukkan bahwa senyawa yang terkandung didalamnya bersifat aktif pada uji BSLT Senyawa yang terdeteksi pada ekstrak lipid adalah asam palmitat dan alkil sikloheksan
Produksi Biomassa 1 jarum ose Zymomonas mobilis dari biakan miring - diinokulasikan pada 10 ml media cair steril - diinkubasi 20 jam dengan dishaker kecepatan 120 rpm - ditambah media cair sampai volume 100 ml - diinkubasi 20 jam dengan dishaker kecepatan 120 rpm - disentrifuse pada 3000 rpm selam 30 menit Sel basah Sel kering - diliofilisasi
Ekstraksi Lipid Total 0,2 gr sel kering filtrat - diekstrak 2 kali dengan 50 ml kloroform/metanol (2:1 v/v) - disaring - dievaporasi Ekstrak Lipid Kloroform/metanol
Ekstrak Lipid - diambil 1 mg - ditambah etanol 100 µl - ditambah aquades sampai volume 1000 µl Larutan uji 1000 ppm - divariasi konsentrasi 500; 250; 125; 62,5; 31,25 ppm Larutan uji
1 mg telur Artemia salina - dibiarkan 48 jam Telur menetas - dimasukkan dalam 16 wadah masingmasing 10 ekor - ditambahkan larutan uji - diamati selama 24 jam Angka kematian artemia salina
Skrining Hopanoid Lipid total - dioksidasi dengan 300 mg H 5 IO 6 dalam THF/air (4:1 v/v) - distirer selama 1 jam, ditambah air 10 ml - diekstrak dengan n-heksan 3 kali Fasa organik (mengandung hopanoid) - ditambah Na 2 SO 4 anhidrat - didekantasi Fasa air - dibuang dekantir - dievaporasi residu Aldehid hopanoid n-heksan
Aldehid hopanoid - direduksi dengan 100 mg NaBH 4 dalam 5 ml etanol - distirer selama 1 jam, ditambah 15 ml 0,1 M KH 2 PO 4 - diekstrak dengan n-heksan 3 kali Fasa organik (mengandung alkohol hopanoid) Fasa air - ditambah Na 2 SO 4 anhidrat - didekantasi dekantir - dievaporasi residu Alkohol hopanoid n-heksan
Alkohol hopanoid - pemisahan dengan kromatografi kolom 20 ml kedua alkohol hopanoid 2 ml pertama asam lemak - diasetilasi hopanoid tersetilasi - dianalisa KGMS Kromatogram