BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan dari bulan September 2007 sampai dengan bulan April 2008. Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler Seluler Tanaman, dan Laboratorium BIORIN (Biotechnology Research Indonesian-The Netherlands), Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB. Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah kedelai kultivar Slamet yang toleran terhadap cekaman Al sebagai bahan tanaman yang diambil ujung akarnya. Kit TRIzol (Invitrogen) digunakan untuk isolasi RNA. Untuk mengetahui keberhasilan terbentuknya cdna dan kemurnian cdna dari kontaminasi DNA genom, digunakan primer spesifik gen aktin yang didesain dari Glycine max (telah didepositkan di GenBank dengan nomor akses V00450). Primer ActF (ATGGCAGATGCCGAGGATAT) dan ActR (CAGTTGTGCGACCACTTGCA) akan mengamplifikasi cdna ekson1-ekson2 dari β aktin. Primer spesifik MF (TCGAGAAAAATGTCTTGCTGTG) dan M7R (CCTTGCACCTGCAAGTGAAG) yang didesain berdasarkan cdna dari Arabidopsis thaliana, yaitu AtMt2 (nomor akses EM_PL: AY037263) digunakan untuk mengisolasi fragmen penyandi MT2 dari kedelai (GmMt2). Plasmid pgem T Easy (Promega) digunakan sebagai vektor pengklonan (Gambar 2). Escherichia coli galur DH5α digunakan sebagai sel inang dari plasmid rekombinan. Gambar 2 Vektor pengklonan pgem T Easy
13 Metode Penelitian Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahapan, yaitu isolasi RNA total, sintesis cdna total melalui transkripsi balik (RT = reverse transcription), isolasi fragmen cdna Mt2, pengklonan fragmen cdna dari gen Mt2 yang telah diisolasi dengan PCR menggunakan primer spesifik MF dan M7R ke dalam plasmid pgem T Easy dan introduksi pgem T Easy rekombinan ke dalam E. coli DH5α, seleksi E. coli pembawa plasmid rekombinan, analisis sisipan, pengurutan nukleotida, dan analisis dan karakterisasi fragmen cdna GmMt2. Tahapan penelitian dilakukan seperti yang disajikan pada Gambar 3. Isolasi RNA total Verifikasi cdna Sintesis cdna total Isolasi fragmen cdna Mt2 dengan PCR Desain primer Mt2 Pengklonan fragmen cdna GmMt2 Seleksi E.coli pembawa plasmid rekombinan Analisis cdna sisipan Isolasi plasmid rekombinan Pengurutan fragmen GmMt2 Analisis dan karakterisasi fragmen GmMt2 Kesimpulan Gambar 3 Tahapan isolasi, pengklonan dan karakterisasi fragmen GmMt2 dari kedelai kultivar Slamet
14 Isolasi RNA Total Ujung akar kedelai sebanyak 1 g digerus sampai halus dengan menambahkan nitrogen cair ke dalam mortar. Bubuk dicampur dengan 800 µl TRIzol (Invitrogen) untuk membentuk suspensi sel, kemudian dipindahkan ke dalam tabung ependorf, dan diinkubasikan pada suhu ruang selama kurang lebih 5 menit. Ke dalam ependorf tersebut ditambahkan lagi 200 µl kloroform kemudian divortex sampai tercampur rata. Campuran diinkubasikan pada suhu ruang selama 3 menit. Selanjutnya ependorf tersebut disentrifugasi (Jouan BR4i) dengan kecepatan 9000 rpm (38000xg) pada suhu 6 C selama 15 menit. Fase cairan bagian atas (supernatan) diambil minimal sebanyak 60% dari volume TRIzol. Supernatan kemudian dipindahkan ke dalam ependorf baru, dan ditambah dengan 500 µl isopropyl alkohol lalu diinkubasikan pada suhu ruang selama 10 menit. Setelah disentrifugasi pada kecepatan 9000 rpm 6 C selama 10 menit, cairan dibuang, dan endapannya ditambah 500 µl ethanol 75%. Ependorf kembali disentrifugasi dengan kecepatan 5700 rpm (22000xg) pada suhu 6 C selama 5 menit. Cairan dibuang, endapan dikeringkan dengan menggunakan vakum. Setelah kering, endapan RNA total disuspensikan dalam 30 µl H 2 O-DEPC. Kuantitas dan kualitas RNA total ditentukan dengan spektrofotometer UV-VIS (Cecil CE 2020) pada panjang gelombang 260 (λ 260 ) dan 280 (λ 280 ). Konsentrasi RNA ditentukan dengan asumsi satu satuan absorban pada panjang gelombang 260 nm setara dengan 40 µg/ml RNA. Kemurnian RNA total dari kontaminan protein ditentukan melalui nilai perbandingan absorban pada panjang gelombang 260nm dan 280nm. Jika nilai λ 260 / λ 280 1.80 maka RNA mempunyai kemurnian yang tinggi (Saunders & Parker 1999). Kuantitas (konsentrasi) RNA dapat diduga dengan rumus berikut: [RNA] = OD 260nm x fp x 40 µg/ml dimana; fp = faktor pengenceran 40 = nilai satu satuan absorban pada panjang gelombang 260 nm (40 µg/ml) Keutuhan RNA total ditentukan dengan elektroforesis pada gel agarosa 1% (b/v) (FMC, USA) dengan larutan penyangga MOPS (4.2 g/l MOPS, 0.41 g/l Na-asetat, 0.37 g/l Na 2 -EDTA). Sebanyak 1 µl RNA total dicampur dengan 12 µl larutan premiks [MOPS, 50% (v/v) formamida,
15 17.5% (v/v) formaldehid dan 27.5% (v/v) air DEPC] dipanaskan pada suhu 65 C 10 menit, didinginkan di es selama 5 menit dan diberi 1/6 volume loading dye (0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol FF, 30% gliserol) dan dielektroforesis pada 100 volt 30 menit. Setelah diwarnai dengan EtBr (0.5 µg/ml) selama 30 menit, dan dibilas dengan H 2 O, visualisasi RNA di dalam gel dilakukan di atas transiluminator GelDoc (Labquip) dan difoto dengan kamera digital. Sintesis cdna total cdna total disintesis dari RNA total dengan menggunakan enzim Superscript III Reverse Transcriptase (Invitrogen). Komposisi sintesis cdna total adalah 5 µg RNA total, 4 µl (1x) RT buffer, 1 µl (20 pmol) oligo(dt), 2 µl (2 mm) dntp mix, 2 µl (10 mm) DTT, 0.2 µl (2 U) enzim SuperScript TM III RTase dan air DEPC dengan volume akhir reaksi 20 µl. Sintesis cdna dilakukan pada suhu 45 C 50 menit. Keberhasilan terbentuknya cdna dan kemurnian cdna diverifikasi menggunakan PCR dengan primer spesifik aktin. Komposisi PCR adalah 1 µl (10 ng) cdna total, 1 µl Buffer Taq (10x), 1 µl (2 mm) dntp mix, 0.5 µl (10 pmol) primer ActF, 0.5 µl (10 pmol) primer ActR, 0.4 µl (4%) DMSO, 0.1 µl (5 U) enzim Taq DNA polymerase (Fermentas) dan ddh 2 O dengan volume akhir reaksi 10 µl. PCR dilakukan dengan kondisi prapcr pada 95 C 5 menit, denaturasi pada 94 C 30 detik, penempelan primer pada 55 C 30 detik, dan pemanjangan pada 72 C 1.5 menit, dengan 37 siklus, dan pasca PCR pada 72 C 5 menit, diikuti dengan 15 C 5 menit. Isolasi putatif fragmen Mt2 Fragmen cdna Mt2 diisolasi dari cdna total dengan PCR menggunakan primer spesifik Mt2. Komposisi PCR adalah 2 µl cdna total, 2 µl Buffer Taq (10x), 2 µl (2 mm) dntp mix, 1 µl (20 pmol) primer MF, 1 µl (20 pmol) primer M7R, 0.8 µl (4%) DMSO, 0.2 µl (5 U) enzim Taq DNA polymerase (RBC) dan ddh 2 O dengan volume reaksi 20 µl. Kondisi PCR adalah prapcr pada 95 C 5 menit, denaturasi pada 94 C 30 detik, penempelan primer pada 58 C 30 detik dan pemanjangan pada 72 C 1.5 menit, 37 kali siklus, pasca PCR pada 72 C 5 menit diikuti 15 C 5 menit. Pengklonan fragmen putatif Mt2 Fragmen Mt2 hasil PCR diligasikan dengan pgem T Easy (Promega) mengikuti prosedur Promega Inc. yaitu dengan mencampurkan 3 µl (5 ng) hasil PCR, 1 µl (10 ng) pgem T Easy,
16 0.5 µl (1U) T4 DNA ligase (Promega), 1 µl 10x rapid buffer ligasi dan ddh 2 O sampai volume akhir 10 µl. Campuran diinkubasi pada 4 C selama semalam. Hasil ligasi diintroduksikan ke dalam E. coli galur DH5α mengikuti metode yang dipublikasikan Suharsono (2002). Seleksi E. coli yang mengandung vektor rekombinan E. coli galur DH5α yang mengandung vektor rekombinan diseleksi menggunakan seleksi resistensi terhadap ampisilin dan seleksi biru-putih. Koloni putih yang tumbuh di media yang mengandung ampisilin digunakan sebagai bahan cetakan untuk PCR untuk mendeteksi keberadaan Mt2. Untuk itu koloni putih diambil dengan tusuk gigi kemudian disuspensikan ke dalam 6.5 µl ddh 2 O dan dipanaskan di dalam waterbath 95 C 10 menit dan didinginkan di dalam es 5 menit. Suspensi ini dicampur dengan 1 µl Buffer Taq (10x), 1 µl (2 mm) dntp mix, 0.5 µl (20 pmol) primer MF, 0.5 µl (20 pmol) primer M7R, 0.4 µl (4%) DMSO, 0.1 µl (5 U) enzim Taq DNA polymerase (Fermentas) dengan volume akhir 10 µl. PCR dilakukan dengan kondisi yang sama dengan isolasi fragmen Mt2. Isolasi plasmid E. coli DH5α transforman rekombinan Isolasi DNA plasmid pgem T Easy rekombinan yang terdapat di dalam E. coli DH5α dilakukan dengan menggunakan prosedur Suharsono (2002). Satu koloni E. coli DH5α rekombinan dikulturkan di dalam 2 ml media LB yang mengandung 100 mg/l ampisilin dan diinkubasi pada suhu 37 o C didalam inkubator bergoyang (250 rpm) selama semalam. Kultur bakteri disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm pada suhu 4 o C selama 10 menit. Endapan bakteri kemudian disuspensikan dalam 300 µl larutan resuspensi sel [50 mm tris-hcl, ph 7.5 dan 10 mm EDTA] di homogenisasi dengan divorteks, tambahkan 300 µl larutan lisis sel [0.2 M NaOH, dan 1% SDS] dan dibolak-balik beberapa kali sampai menghasilkan lendir, yang berarti dinding sel telah pecah. Setelah lisis, tambahkan 300 µl larutan netralisasi sel [5 M Na-Asetat, asam asetat glasial dan H 2 O dengan perbandingan 60 : 11.5 : 28.5, ph 4.8] dan divorteks kembali sampai terhomogenisasi dengan baik. Campuran ini disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm pada suhu 4 o C selama 20 menit. Supernatan yang mengandung DNA plasmid diambil dan kemudian diekstraksi dengan 1 x volume fenol-kloroform-isoamil alkohol (PCI) (25:24:1), divorteks dan disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm pada suhu 20 o C selama 20 menit. Supernatan kemudian diambil dengan hati-hati dan dipresipitasi dengan menambahkan 0.1 x volume 2M sodium asetat (NaOAc) ph 5.2 dan 2 x volume etanol absolut. Selanjutnya
17 larutan diinkubasi pada suhu -35 o C selama 2 jam dan disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm pada suhu 4 o C selama 20 menit. Endapan (DNA plasmid) dibilas dengan 1 x volume etanol 70% dan dikeringkan dengan vakum selama 10 menit. DNA plasmid yang sudah kering dilarutkan di dalam 10-20 µl ddh 2 O. RNA didegradasi dengan menambahkan 0.2 x volume RNAse dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama semalam. Plasmid dielektroforesis di agarosa 1% (b/v) pada tegangan 100 volt selama 30 menit. Analisis cdna sisipan Untuk mengeluarkan cdna sisipan, DNA plasmid rekombinan hasil isolasi plasmid dipotong dengan enzim EcoR1 (Fermentas) yaitu dengan mencampur 200 ng DNA plasmid, 10 U enzim restriksi EcoR1, 1x Buffer restriksi dan ddh 2 O sampai volumenya 20 µl. Pemotongan dilakukan pada suhu 37 C selama 2 jam. Pengurutan dan analisis sekuen fragmen GmMt2 Pengurutan fragmen GmMt2 dilakukan di BPPT (Balai Penelitian dan Pengembangan Teknologi) dengan menggunakan DNA sequencer ABI Model 3100/3130 MERCIAN. Identifikasi urutan basa nukleotida dan deduksi asam amino hasil pengurutan fragmen cdna GmMt2 dilakukan dengan beberapa analisis. Analisis kesejajaran lokal (local alignment) GmMt2 berdasarkan urutan nukleotida dan asam amino dengan data yang ada di GenBank, dilakukan dengan program BLAST (Basic Local Alignment Search Tools) yang diakses dari NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Deduksi asam amino fragmen GmMT2 menggunakan program translation dari EXPASY (http://www.expasy.ch/tools/dna.htm). Analisis urutan nukleotida untuk mencari open reading frame (ORF) digunakan program BESTORF (http://www.softberry/bestorf/htm). Analisis situs restriksi (restriction site) fragmen cdna GmMt2 dilakukan dengan menggunakan program NEBCutter (http://www.firstmarket.com/cutter/cut2.html). Analisis similaritas dan filogenetik dari urutan nukleotida dan deduksi asam amino GmMT2 dengan MT2 dari berbagai spesies juga dilakukan dengan menggunakan program BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/treeview/htm). Daerah ekson dan intron dianalisis dengan program Genewise (http://www.ebi.ac.uk/tools/htm). Domain fragmen GmMt2 ditentukan dengan program InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/tools/htm) dan program motif scan (http://www.myhits/motifscan/htm).