UJI KUANTITATIF DNA Oleh : Nur Fatimah, S.TP PBT Ahli Pertama A. PENDAHULUAN Asam deoksiribonukleat atau lebih dikenal dengan DNA (deoxyribonucleid acid) adalah sejenis asam nukleat yang tergolong biomolekul utama penyusun berat kering setiap organisme. Di dalam sel, DNA umumnya terletak di dalam inti sel. Tetapi ada pula DNA yang terdapat di mitokondria, oleh karena itu disebut DNA mitokondria. Secara garis besar, peran DNA di dalam sebuah sel adalah sebagai materi genetik. Artinya, DNA menyimpan cetak biru bagi segala aktifitas sel. Dan ini berlaku umum bagi setiap organisme (Anonim, 2011). Keberadaan DNA dalam suatu organisme dapat diketahui dengan 2 cara yaitu secara kualitatif dengan metode Elektroforesis Gel Agarose dan secara kuantitatif dengan metode spektrofotometri. Uji kuantitatif DNA adalah analisis untuk menentukan kandungan/jumlah DNA yang terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam larutan contoh dengan cara uji kualitatif (Larasati, 2011). Pengujian kuantitatif DNA dapat dilakukan dengan menggunakan metode spektrofotometri. Terdapat beberapa cara yaitu spektrofotometri Vis (visible), spektrofotometri UV (ultra violet), Spektrofotometri UV-Vis (ultra violet visible) dan Spektrofotometri Infra Red (Riyadi, 2009). Dalam tulisan ini, hanya akan dijelaskan mengenai spektrofotometri Vis dan UV Vis. B. TUJUAN Uji kuantitatif DNA dengan metode spektrofometri ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan dan jumlah DNA di dalam suatu larutan contoh uji dan untuk memahami penggunaan dan perbedaan spektrofotometer Vis dan UV-Vis. C. UJI KUANTITATIF DNA Uji kuantitatif DNA diawali dengan isolasi DNA. Hal ini bertujuan untuk mengeluarkan DNA yang berada dalam inti sel dari organisme. Kemudian dilakukan dengan uji kualitatif DNA dengan metode
elektroforesis gel agarosa. Uji ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan DNA dalam larutan contoh. Setelah itu dilanjutkan dengan uji kuantitatif DNA dengan metode spekrofotometri. Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis untuk mengukur konsentrasi suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Alat ini terdiri dari spektrofotometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu, sementara fotometer adalah pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi (Riyadi, 2009). Uji kuantitatif DNA dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain : 1. Spektrofotometri Vis (Visible) Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang cahaya tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua cahaya yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, atau warna apapun selama ia dapat dilihat oleh mata, maka cahaya tersebut termasuk ke dalam cahaya tampak (visible). Sumber cahaya tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia dengan simbol W dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 ºC) dibanding logam lainnya. karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu. Alat ini bekerja berdasarkan hukum Lambert-beer. Jumlah radiasi yang diserap proporsional dengan ketebalan sel (b), konsentrasi analit (c), dan koefisien absorptivitas molekuler (a) dari suatu spesi (senyawa) pada suatu panjang gelombang Logika prinsip dari alat spektro-vis adalah intensitas warna dari suatu larutan sebanding dengan jumlah cahaya yang diserap. Semakin pekat warna, semakin banyak cahaya yang diserap. Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memiliki warna. Hal ini menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible.
Oleh karena itu, untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan menggunakan reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang digunakan harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan dianalisa. Selain itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan harus benar-benar stabil (Riyadi, 2009). Berikut adalah sifat-sifat yang harus dimiliki oleh reagen pembentuk warna (chromogenik reagent): 1. Kestabilan dalam larutan. Pereaksi-pereaksi yang berubah sifatnya dalam waktu beberapa jam, dapat menyebabkan timbulnya semacam cendawan bila disimpan. Oleh sebab itu harus dibuat baru dan kurva kalibarasi yang baru harus dibuat saat setiap kali analisis. 2. Pembentukan warna yang dianalisis harus cepat. 3. Reaksi dengan komponen yang dianalisa harus berlangsung secara stoikiometrik. 4. Pereaksi tidak boleh menyerap cahaya dalam spektrum dimana dilakukan pengukuran. 5. Pereaksi harus selektif dan spesifik (khas) untuk komponen yang dianalisa, sehingga warna yang terjadi benar-benar merupakan ukuran bagi komponen tersebut saja. 6. Tidak boleh ada gangguan-gangguan dari komponen-komponen lain dalam larutan yang dapat mengubah zat pereaksi atau komponen komponen yang dianalisa menjadi suatu bentuk atau kompleks yang tidak berwarna, sehingga pembentukan warna yang dikehendaki tidak sempurna. 7. Pereaksi yang dipakai harus dapat menimbulkan hasil reaksi berwarna yang dikehendaki dengan komponen yang dianalisa, dalam pelarut yang dipakai. Setelah ditambahkan reagen atau zat pembentuk warna maka larutan tersebut harus memiliki lima sifat di bawah ini : 1. Kestabilan warna yang cukup lama guna memungkinkan pengukuran absorbansi dengan teliti. Ketidakstabilan, yang mengakibatkan menyusutnya warna larutan (fading), disebabkan oleh oksidasi oleh udara, penguraian secara fotokimia, pengaruh keasaman, suhu dan jenis pelarut. Namun kadang-kadang dengan mengubah kondisi larutan dapat diperoleh kestabilan yang lebih baik.
2. Warna larutan yang akan diukur harus mempunyai intensitas yang cukup tinggi (warna harus cukup tua) yang berarti bahwa absortivitas molarnya (ε) besar. Hal ini dapat dikontrol dengan mengubah pelarutnya. Dalam hal ini dengan memilih pereaksi yang memiliki kepekaan yang cukup tinggi. 3. Warna larutan yang diukur sebaiknya bebas daripada pengaruh variasi-variasi kecil kecil dalam nilai ph, suhu maupun kondisis-kondisi yang lain. 4. Hasil reaksi yang berwarna ini harus larut dalam pelarut yang dipakai. 5. Sistem yang berwarna ini harus memenuhi Hukum Lambert-Beer. (Wanibesak, E. 2011) Gb 1. Spektrofotometer Visible tipe spectronic-20 lama yang sudah jarang bahkan mungkin tidak diproduksi lagi Gb 2. Spektrofotometer Visible tipe Spectronic-20 terbaru
Untuk mengukur konsentrasi DNA digunakan rumus sebagai berikut : [DNA] = Å260 x 50 x Faktor pengenceran Keterangan : Å260 = nilai absorbansi pada 260 nm 50 = larutan dengan nilai absorbansi 1,0 sebanding dengan 50 ug untai ganda DNA per ml (dsdna) [RNA] = Å260 x 40 x Faktor pengenceran Keterangan : 40 = 40 ug/ml untai tunggal RNA (ssrna) (Fatchiyah, 2011). 2. Spektrofotometri UV- Vis (Ultraviolet Visible) Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan. Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sampel keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sampel harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi. Alat ini menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator. Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk sample tak berwarna (Riyadi, 2011) DNA yang mengandung basa-basa purin dan pirimidin dapat menyerap cahaya UV. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm, sedang kontaminan protein atau phenol dapat menyerap
cahaya pada 280 nm. Dengan adanya perbedaan penyerapan cahaya UV ini, sehingga kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi 280 (Å260/Å280), dan nilai kemurnian DNA berkisar antara 1.8-2.0 (Fatchiyah, 2011). Jika nilai melebihi 2,0 maka larutan yang diuji masih mengandung kontaminan dari protein membran / senyawa lainnya sehingga kadar DNA plasmid yang didapat belum murni. Jika kurang dari 1,8 maka ddh 2 O yang diambil terlalu banyak sedangkan DNA yang diambil terlalu sedikit (Larasati, 2011). Alat yang digunakan dalam uji ini dengan metode spektrofotometri UV-Vis antara lain : mikropipet, kuvet, nanodrop spektrofotometer dan seperangkat komputer. Bahan yang digunakan adalah isolat DNA dan aquadest sebagai blanko. Cara kerja pengujian kuantitatif DNA diawali dengan menghidukan alat nanodrop spektrofotometer. Kemudian melakukan uji blanko menggunakan aquadest. Setelah itu dilanjutkan dengan menguji isolat DNA dengan cara meneteskannya pada tempat sampel sebanyak 1 mikroliter. Kemudian mengukur kemurnian DNA dan baca hasil kemurnian DNA-nya. Gb. Nanodrop Spektrofotometer D. MANFAAT UJI KUANTITATIF DNA Pengujian DNA secara kuantitatif ini diharapkan dapat memberikan manfaat dalam penemuan materi genetik organisme, dimana selanjutnya tulisan ini dapat dijadikan acuan dalam pengujian DNA terutama komoditi tanaman perkebunan.
Sumber : Anonim, Asam Deoksiribonukleat. http://id.wikipedia.org/wiki/asam_ deoksiribonukleat. Diakses tanggal 24 September Fatchiyah, Modul Pelatihan Analisis Fingerprinting DNA Tanaman Dengan Metode RAPD. Laboratorium Sentral Ilmu Hayati Universitas Brawijaya, Malang. Larasati, P. Quantifikasi DNA dan Analisis Kualitas. http://puspalarasati.wordpress.com. Diakses tanggal 22 September Riyadi, W. 2009. Macam Spektrofotometri dan Perbedaannya (Vis, UV dan IR). http://wahyuriyadi.blogspot.com. Diakses tanggal 23 September Riyadi, W. 2009. Prinsip Dasar Spektrofotometer Visible. http://wahyuriyadi.blogspot.com. Diakses tanggal 23 September Wanibesak, E. Spektrofotometri Sinar tampak (Visible). http://wanibesak.wordpress.com. Diakses tanggal 22 September