94 ISSN 026-328 Gina Mondrida, dkk. OPTIMASI PENANDAAN CA 5.3 DENGAN NA I PRODUKSI PRR SEBAGAI PERUNUT KIT IRMA CA 5.3 Gina Mondrida, Puji Widayati, Siti Darwati, Sutari, Agus Ariyanto, V. Yulianti, W. Lestari. Pusat Radioisotop dan Radiofarmaka BATAN, Kawasan PUSPIPTEK Serpong ABSTRAK OPTIMASI PENANDAAN CA 5.3 DENGAN Na I PRODUKSI PRR SEBAGAI PERUNUT KIT IRMA CA 5.3. Perunut CA5.3 (CA5.3- I) merupakan salah satu pereaksi utama dalam Kit IRMA CA5.3 yang digunakan pada deteksi dini kanker payudara. Kanker payudara merupakan penyebab kematian nomor dua untuk perempuan di Indonesia. Sebenarnya, kanker payudara merupakan salah satu jenis kanker yang dapat dideteksi secara dini. Salah satu cara yang dapat digunakan untuk deteksi dini kanker payudara adalah dengan menggunakan kit IRMA (immunoradiometricassay) CA 5.3. Agar dapat memproduksi perunut CA5.3 (CA5.3- I) yang bermutu baik sebagai salah satu komponen pereaksi Kit IRMA CA5.3, pada penelitian ini telah dilakukan penandaan CA5.3 dengan Na I produksi PRR (hasil reduksi), menggunakan oksidator Kloramin-T. Terhadap masing-masing hasil penandaan dilakukan penentuan yield (% penandaan), aktivitas jenis, kemurnian radiokimia, dan immunologi (B/T). Perunut CA5.3 (CA5.3- I) yang didapat dari hasil penandaan monoklonal CA5.3 jenis M3790M dengan Na I PRR (hasil reduksi) mempunyai kualitas yang baik dengan yield (% penandaan) sebesar 47,03%, aktivitas jenis 22,57 µci/µg, kemurnian radiokimia 97,5% dan immunologi (B/T) sebesar 9,86% yang dapat digunakan sebagai perunut kit IRMA CA 5.3. Kata kunci: immunoradiometricassay, kanker payudara, tumor marker, CA-5.3, perunut.. ABSTRACT CA 5.3 LABELING OPTIMATION WITH Na I PRODUCTED BY PRR AS CA 5.3 IRMA KIT TRACER. CA 5.3 tracer (CA 5.3- I) is one of the main reagents in the CA 5.3 IRMA kit used in early detection of breast cancer. Breast cancer is the second cause of death for women in Indonesia. Actually, breast cancer is one type of cancer that can be detected early. One method that can be used for early detection of breast cancer is by using CA 5.3 IRMA (immunoradiometricassay) Kit. For producing a good quality CA5.3 tracer (CA 5.3- I) as one component of reagent CA 5.3 IRMA Kit, in this research the CA 5.3 are labeled with Na I produced by PRR (result of reduction) employing Cloramin-T oxidator. The yield of labeling process (%), specific activity radiochemical purity and immunological (B/T) of CA 5.3- I tracer were obtained from the results of labelling monoclonal CA5.3 of M3790M with Na I PRR (the reduction) have good quality, the yield (of labeling) was 47.03%, specific activity was 22.57 µci/µg, radiochemical purity was 97.5% and immunological (B/T = 9.86%) can be used as a tracer of CA 5.3 IRMA Kit. Key word: immunoradiometricassay, breast cancer, tumor marker, CA-5.3, tracer PENDAHULUAN B erdasarkan data dari Yayasan Kanker Indonesia (YKI), kanker payudara merupakan penyebab kematian nomor dua untuk perempuan di Indonesia, pada hal kanker payudara adalah salah satu jenis kanker yang dapat dideteksi secara dini. Namun tingkat kesadaran masyarakat yang rendah untuk melakukan deteksi dini telah menyebabkan jenis kanker ini lebih sering ditemukan pada stadium lanjut yang sulit untuk ditangani []. Senyawa Carbohydrate Antigen 5.3 (CA 5.3) dengan berat molekul antara 300.000-450.000 dalton adalah gabungan glycoprotein heterogeneous. Senyawa ini ditemukan dalam serum individu normal dengan konsentrasi di bawah 35 U/mL, sedangkan pada penderita kanker konsentrasi senyawa ini meningkat lebih tinggi dibadingkan dengan individu normal. Senyawa ini dapat bereaksi dengan monoklonal antibodi CA 5.3. Oleh sebab itu senyawa CA 5.3 dapat digunakan sebagai tumor marker yang penentuan kadarnya dapat dilakukan dengan teknik IRMA (Immunoradiometricassay) [2,3]. Dalam IRMA hasil reaksi yang terjadi antara antigen dan antibodi diukur dari radiasi yang dipancarkan oleh radioisotop penanda antibodi [3]. Secara teoritis molekul yang ditandai akan mempunyai sifat immunoreaktif yang sama dengan molekul aslinya. Sebagai radioisotop penanda pada umumnya digunakan I yang mempunyai beberapa keuntungan, antara lain: mudah berikatan dengan molekul organik terutama yang mengandung gugus tirosil seperti protein maupun molekul yang lebih
Gina Mondrida, dkk. ISSN 026-328 95 kecil seperti tiroksin pada peptida dan hasil penandaan yang diperoleh dapat mempunyai kemurnian serta aktifitas jenis yang tinggi. Selain itu I merupakan pemancar γ berenergi rendah (35keV) yang dapat dideteksi dengan kebanyakan alat cacah dengan efisiensi tinggi, serta waktu paruhnya cukup panjang, yaitu 60 hari [4]. Penandaan CA5.3 dengan I dilakukan secara langsung dengan menggunakan oksidator kloramin-t. Pada iodinasi secara langsung dengan menggunakan oksidator tersebut akan terjadi oksidasi I - menjadi kation I +, yang dalam suasana basa lemah segera bereaksi dengan gugus tirosil pada rantai polipeptida. Atom iodium akan mengisi posisi orto dari gugus fenol pada gugus tirosil. I - I + + 2e Gambar. Reaksi radioiodinasi langsung. Kondisi oksidasi I - tidak boleh terlalu kuat karena beberapa ikatan asam amino akan turun teroksidasi dan rantai peptida terputus, sehingga perunut akan cepat rusak. Penambahan dapar diperlukan untuk menetralkan larutan Na I yang pada umumnya diberikan dalam larutan NaOH. Penggunaan salah satu oksidator pada penandaan mempunyai kelebihan atau kekurangan dari oksidator lain. Sebagai contoh oksidator iodogen mempunyai daya oksidasi lebih lemah dari kloramin-t[5]. Perlu diketahui bahwa iodium jarang terdapat secara alami dalam molekul protein, dan adanya sebuah atom iodium yang sama besar dengan satu cincin benzen dapat mempengaruhi sifat fisiologi dan imunologi dari protein tersebut. Dalam beberapa hal protein yang ditandai dengan iodium mempunyai kecendrungan kurang stabil bila dibanding dengan protein aslinya[5]. Kualitas dan stabilitas dari hormon / protein yang ditandai dengan I dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain kemurnian hormon / protein yang akan ditandai, kondisi pada waktu proses iodinasi, prosedur pemurnian setelah iodinasi dan penyimpanan hasil penandaan. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan perunut CA5.3 (CA5.3- I) sebagai salah satu komponen kit IRMA CA5.3 dengan mutu yang baik, yang dapat digunakan untuk deteksi dini kanker payudara. TATA KERJA Bahan dan peralatan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya adalah monoklonal CA 5.3 (Biodesign International USA), Human CA 5.3 antigen calibrator grade (Biodesign International USA), kit IRMA CA 5.3 (CIAE China), NaH 2 PO 4.H 2 O dan Na 2 HPO 4 (Merck), kolom kromatografi PD-0 (Pharmacia), Na I (PRR, BATAN), tabung reaksi polipropilen (NUNC Swedia) dan Bovin Serum Albumin, BSA ( Sigma ), Alat yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya adalah pencacah Gamma (600 Gammatec II The Nucleus dan Mini Assay tipe G 20), berbagai ukuran pipet (Eppendorf) beserta tipnya, ph meter (Fisher Accumet model 80), pengaduk (Vortex), incubator (Soft Incubator SL - 6000), timbangan analitik (Mettler AE 60) Penandaan monoklonal antibodi CA 5.3 dengan Na I menggunakan metode Kloramin-T. Optimasi penandaan CA 5.3 dilakukan dengan variasi jenis monoklonal yang digunakan (M37552M dan M3790M). Ke dalam tabung iodinasi yang berisi larutan 3,5 µl larutan monoklonal anti CA 5.3 ditambahkan 20 µl dapar fosfat 0,5 M ph 7,4 dan 3,3 µl Na I (aktivitas ~ 000 µci). Selanjutnya ditambahkan + H + 0 µl Kloramin-T ( mg dalam ml dapar fosfat 0, M ph 7,4). Campuran kemudian dikocok selama dua menit dengan vortex yang diikuti dengan penambahan 0 µl larutan Na 2 S 2 O 5 ( mg Na 2 S 2 O 5 dalam ml dapar fosfat 0, M ph 7,4). Selanjutnya campuran dikocok dengan vortex selama dua menit. Hasil penandaan kemudian dimurnikan dengan menggunakan kolom PD-0 yang telah dikondisikan dengan dapar fosfat 0,0 M ph 7,4 dan dijenuhkan dengan ml larutan BSA 0%. Produk monoklonal anti CA 5.3 bertanda I (selanjutnya disebut perunut ) dielusi dari kolom PD-0 dengan larutan dapar fosfat 0,0 M ph 7,4 dan fraksi eluat ditampung per fraksi dalam tabung reaksi masingmasing sebanyak 500 µl per fraksi ( fraksi). Tiap fraksi kemudian diukur radioaktivitasnya dengan alat pencacah Gamma (Gamma Management System, GMS).
96 ISSN 026-328 Gina Mondrida, dkk. Penentuan yield (rendemen hasil penandaan) Fraksi yang mengandung antibodi bertanda kemudian dikumpulkan dan dihitung rendemen penandaannya dengan rumus sebagai berikut: Uji kemurnian radiokimia () Uji kemurnian radiokimia antibodi bertanda ditentukan dengan kromatografi lapisan tipis (KLT) dengan fasa diam kertas whatman dan fasa gerak campuran Ethanol: Butanol: NH 4 OH dengan perbandingan 3:2:. Rf antibodi bertanda = 0,0. (2) Penentuan aktivitas jenis hasil penandaan Aktivitas jenis hasil penandaan ditentukan dengan cara sebagai berikut: Protocol Assay (3) Tabung coated tube (CT) diberi nomor dan ditambah pengencer standar CA 5.3 sebanyak 50 µl. Sejumlah 50 µl larutan standar 0, 5, 50, dan 0 miu/ml dan sampel ditambahkan ke masing masing tabung CT yang telah diberi nomor. Vortek hingga homogen dan diinkubasi dua jam pada temperatur 37 o C. Cairan dibuang dan dicuci dengan aquademin dua kali 000 µl. Sejumlah 200 µl larutan perunut dengan aktivitas ± 200.000 cpm ditambahkan ke masing-msing tabung CT, vortek hingga homogen dan diinkubasi 3 jam pada suhu ruangan. Cairan dibuang dan dicuci dengan aquademin dua kali 000 µl, kemudian didekantasi. Tabung diukur dengan alat pencacah Gamma selama menit HASIL DAN PEMBAHASAN Gambar 2. Kromatogram hasil penandaan monoklonal antibodi CA 5.3 M3790M dan Ca5.3 M37552M dengan Na I PRR (hasil reduksi) menggunakan oksidator kloramin-t dan kolom PD-0 serta eluen dapar fosfat 0,0M ph 7,4. Dari hasil penandaan monoklonal CA5.3 jenis M37552M dengan Na I PRR (belum direduksi) menggunakan oksidator kloramin-t, diperoleh hasil penandaan yang sangat rendah (gagal) dengan kemurnian radiokimia serta aktivitas jenis yang rendah juga, seperti yang terlihat pada Tabel. Hal ini disebabkan karena Na I yang digunakan masih mengandung iodat, periodat dan sangat encer (aktivitas 34,3 µci/µl). Sebaiknya dalam pembuatan perunut untuk Kit RIA/IRMA,
Gina Mondrida, dkk. ISSN 026-328 97 Na I yang digunakan untuk penandaan harus mempunyai kemurnian radiokimia yang tinggi dan tidak terlalu encer. Jadi untuk penandaan selanjutnya Na I digunakan, setelah melalui proses reduksi (peningkatan kemurnian kimia iodida) dan pemekatan. Dari hasil penandaan monoklonal CA5.3 jenis M3790M dengan Na I PRR (hasil reduksi) dengan menggunakan oksidator kloramin-t, diperoleh hasil penandaan tertinggi 47,03% dengan kemurnian radiokmia 97,5% serta aktivitas jenis 22,57%, seperti yang terlihat pada Tabel 2. Pada percobaan no. dan no.2 diperoleh hasil penandaan yang sangat rendah sebesar 2,2% dan 2,6%. Hal ini disebabkan karena Na I yang digunakan pada percobaan no. dan no.2 masih encer (aktivitas 30 µci/µl dan 34,3 µci/µl). Dari Tabel 2 terlihat, semakin pekat Na I yang digunakan, hasil penandaan akan semakin tinggi. Jadi dalam pembuatan perunut untuk Kit RIA/IRMA, sebaiknya volume Na I yang digunakan untuk penandaan <0 µl dengan aktivitas >00 µci/µl Dari hasil penandaan monoklonal anti CA5.3 jenis M3790M dan M37552M dengan Na I PRR (hasil reduksi) menggunakan oksidator kloramin-t seperti yang terlihat pada Tabel 3, diperoleh hasil penandaan tertinggi pada percobaan no.2 sebesar 47,03% dengan kemurnian radiokmia 97,5% dan aktivitas jenis 22,57 µci/µg serta uji immunologi (%B/T) = 9,86%. Pada percobaan no.4 diperoleh hasil penandaan sebesar 27,48% dengan kemurnian radiokmia 95,8% dan aktivitas jenis 3,9 µci/µg serta uji immunologi (%B/T) = 6,6%. Hasil penandaan no.4 lebih rendah dibanding dengan no.2, meskipun sudah menggunakan volume NaI yang sama sebesar 3 µl. Hal ini disebabkan percobaan no.4 menggunakan monoklonal anti CA5.3 jenis M37552M, yang mempunyai paring yang berbeda dengan monoklonal anti CA 5.3 jenis M3790M, dimana monoklonal jenis M37552M khusus untuk coated tube, sedangkan monoklonal jenis M3790M khusus untuk labelling, sehingga hasil penandaan tidak optimal. Tabel. Hasil Penandaan monoklonal anti CA 5.3 jenis (M37552M) dengan Na I PRR (belum direduksi) menggunakan Oksidator Kloramin-T dengan memvariasikan jumlah monoklonal anti CA 5.3 (M37552M). No CA 5.3 (µg ) 2 0 3 5 4 20 5 6 Na I µci (35µL) Hasil Penandaan (%) Aktivitas Jenis (µci/µgr) Kemurnian Radiokimia (%) 5 200 2,9 5,26 85,0 200 200 200 2,79 3,35 86, 2,65 2,2 87,3 2,6,56 9,99 200 2,39,5 90,8 30 200 2,4 0,86 90,44 Tabel 2. Hasil Penandaan monoklonal anti CA 5.3 jenis (M3790M) dengan,2 mci Na I menggunakan Oksidator Kloramin-T dengan memvariasikan konsentrasi Na I yang di gunakan. CA 5.3 VolumNa I Hasil Penandaan Aktivitas Jenis Kemurnian No (µg ) (µl ) (%) (µci/µgr) Radiokimia(%) 40 2,2,06 86,4 2 3 4 5 35 2,6, 87,6 5 6,0 7,68 89,7 6 39,3 8,86 95.2 3 47,03 22,57 97,5
98 ISSN 026-328 Gina Mondrida, dkk. Tabel 3. Hasil Penandaan monoklonal anti CA 5.3 M3790M dan CA 5.3 M37552M dengan,2 mci Na I PRR (hasil reduksi) menggunakan Oksidator Kloramin-T. Vol Na I Hasil Penandaan Aktivitas Jenis Kemurnian Immunologi No Jenis CA5.3 (µl) (%) (µci/µgr) Radiokimia(%) (%B/T) M3790M 35 2,60, 87,6 5,5 2 3 4 M3790M M37552M M37552M 3 47,03 22,57 97,5 9,86 35 2,39,4 85,9,09 3 27,48 3,9 95,8 6,6 KESIMPULAN Hasil penandaan monoklonal antibodi CA 5.3 jenis M3790M dengan Na I PRR (hasil reduksi) memberikan hasil yang baik, dengan rendemen hasil penandaan 47,03%, aktivitas spesifik 22,57 µci/µg, kemurnian radiokimia 97,5% dan uji immunologi 9,86%. Monoklonal antibodi CA 5.3 jenis M3790M merupakan bahan dasar yang baik untuk pembuatan perunut dibandingkan monoklonal jenis M37552M, yang hanya memberikan rendemen hasil penandaan 27,48%, aktivitas spesifik 3,9 µci/µg, kemurnian radiokimia 95,8% dan uji immunologi 6,6%. Perunut CA5.3 (CA5.3- I) yang didapat hasil dari penandaan CA 5.3 jenis M3790M dengan Na I PRR (hasil reduksi) yang telah dipekatkan dan dimurnikan mempunyai kualitas yang baik dan dapat digunakan sebagai perunut Kit IRMA CA 5.3. DAFTAR PUSTAKA. ANONIMOUS, Kurang kesadaran dan rendahnya kewaspadaan terhadap kanker payudara, Yayasan Kanker Indonesia (YKI), 2007. 2. G.BANFI, P. PARMA, M. PONTILLO, 997, Stability of Tumor Marker CA 9.9, CA, and CA 5.3 in Serum Obtained from plain Tubes and Tubes containing Thxotropic Gel Separator, Clinical Chemistry, 43: 2430-243. 3. DE LA LANDE B, HACENE K, FLOIRAS J L, at all, 2002, Prognotic value of CA 5.3 kinetic for metastatic breast cancer, Service de Radiotherapie, Centre Rene Huguenin de Luttle Contre le Cancer, saint-cloud, France, Oct- Dec:7(4):23-8. 4. WAYAN RADIATNING S, SUKIYATI DJ,2000, Immunoradiometricassay (IRMA) Dalam Deteksi Dan Pemantauan Kanker, Jurnal Radioisotop dan Radiofarmaka, P2RR-BATAN, Serpong, Vol.3, No, halaman 55-70. 5. R.S.WAYAN, Dasar - dasar RIA dan IRMA, Pusdiklat BATAN, Jakarta, 993. TANYA JAWAB Maiyesyi - PRR Parameter apa saja yang dioptimasi? Bagaimana dengan sebelum dioptimasi? Gina Mondrida Parameter yang dioptimasi adalah. Jumlah (µg) monoclonal CA 5.3 yang digunakan 2. Volume (µl)na I yang dipakai 3. Jenis monoclonal CA 5.3 yang digunakan Kondisi sebelum dioptimasi menghasilkan yield penandaan yang rendah (±2%) dengan kemurnian radiokimia yang rendah pula, sehingga perunut yang diperoleh tidak bisa digunakan. Setelah dioptimasi menghasilkan yield penandaan yang tinggi (47,03%) dan kemurnian radiokimia sebesar 97,5%. Perunut yang diperoleh setelah dioptimasi, dapat digunakan sebagai perunut Kit IRMA CA 5.3