Prosiding Semirata FMIPA Universitas Lampung, 2013 Optimasi Isolasi dan Amplifikasi ITS DNA Ribosomal Fungi Karbolitik Isolat Zona Inti Cagar Biosfer Giam Siak Kecil- Bukit Batu Titania Tjandrawati Nugroho 1), Evariati Rambe 1), Arfa Dewi 1), Reni M. Fitri 1), Harni Sepryani 1), Fajar Restuhadi 2), Yuli Haryani 1) 1)Jurusan Kimia, FMIPA, Universitas Riau; 2)Jurusan Agroteknologi, FAPERTA, Universitas Riau, Jln. Raya Soebrantaas Km 12,5, Pekanbaru 28293. titanianugroho@gmail.com; titania_nugroho@unri.ac.id Abstrak. LBKURCC20, LBKURCC21, LBKURCC22, LBKURCC27, LBKURCC28, LBKURCC29, LBKURCC30, LBKURCC34 merupakan fungi karbolitik koleksi laboratorium Biokimia FMIPA Universitas Riau. Fungi-fungi tersebut telah berhasil diisolasi dan dimurnikan dari tanah zona inti hutan cagar biosfer Giam Siak Kecil-Bukit Batu Riau, menggunakan media selektif penghasil karbohidrase tertentu. Identifikasi secara morfologi isolat-isolat tersebut telah dilakukan, tetapi masih perlu dilakukan analisis filogenetik molekuler untuk menentukan hubungan kekerabatan hingga tingkat spesies yang lebih tepat. Hal ini dikarenakan identifikasi morfologi fungi secara tepat baru dapat dilaksanakan hingga tingkat genus. Sebelum dapat dilakukan analisis filogenetik molekuler berdasarkan sekeuens DNA ribosomal (rdna) pada daerah ITS (Internal Transcribed Spacer region), terlebih dahulu harus dilakukan optimasi isolasi DNA dan amplifikasi ITS rdna tersebut. Optimasi ini perlu dilakukan, supaya diperoleh produk amplifikasi PCR ITS rdna yang cukup baik, untuk menghasilkan sekuens DNA yang optimal untuk analisis filogenetik. Isolasi DNA kromosomal dilakukan menggunakan kit Wizard Genomic ex Promega Co. (Madison, USA) dari miselia kultur dengan umur bervariasi. Keberhasilan isolasi dan amplifikasi DNA dengan PCR bergantung pada konsentrasi isolat DNA templat yang cukup, primer, dan temperatur annealling. Hasil penelitian menunjukkan bahwa masing-masing isolat DNA fungi yang berhasil diisolasi dengan baik berasal dari umur miselia kultur yang bervariasi mulai dari 1 hingga 3 hari, yaitu sebelum timbul spora, tetapi dalam jumlah miselia yang cukup. Primer untuk amplifikasi ITS rdna terbaik adalah pasangan primer ITS-4 dan ITS-5, kecuali untuk Penicillium sp. LBKURCC34. Temperatur annealing bervariasi bergantung pada galur dan pasangan primernya, tetapi berada pada rentang antara 44 o C s/d 49 o C. Kata Kunci. ITS rdna, Trichoderma, Penicillium. PENDAHULUAN Trichoderma dan Penicillium merupakan fungi filamen dengan anggota spesies yang memiliki potensi bioteknologi yang tinggi. Hal ini karena kemampuan berbagai spesiesnya untuk menghasilkan enzimenzim industri, maupun untuk kemampuannya menghasilkan berbagai senyawa bioaktif [1-3]. Usaha bioprospecting untuk mengisolasi galur-galur baru Trichoderma dan Penicillium terus dilakukan, karena kemampuan yang sangat beragam, baik dari segi kwantitas maupun sifat enzim yang dihasilkan. Salah satu kawasan yang potensial untuk menemukan galur atau species baru Trichoderma dan Penicillium penghasil enzim karbohidrase tinggi adalah tanah hutan gambut yang kaya selulosa dan sisa-sisa serangga [4,5]. Di antara hutan gambut yang belum banyak dieksplorasi adalah hutan gambut zona inti cagar biosfer Giam Siak Kecil-Bukit Batu (GSKBB) di Riau [6]. Dalam rangka penemuan galur lokal Indonesia Trichoderma dan Penicillium penghasil Semirata 2013 FMIPA Unila 407
Titania Tjandrawati Nugroho dkk: Optimasi Isolasi dan Amplifikasi ITS DNA Ribosomal Fungi Karbolitik Isolat Zona Inti Cagar Biosfer Giam Siak Kecil-Bukit Batu karbohidrase tinggi, telah diisolasi 8 isolat fungi dari tanah hutan gambut primer dan sekunder di zona inti cagar biosfer Giam Siak Kecil-Bukit Batu, Riau. Kedelapan isolat tersebut merupakan fungi karbolitik pemecah selulosa atau kitin. Dua isolat telah diidentifikasi secara morfologi sebagai Trichoderma spp. (LBKURCC22 dan 28), sedangkan sisanya merupakan spesiesspesies Penicillium (LBKURCC20, 21, 27, 29, 30 dan 34). Identifikasi secara morfologi baru dapat menentukan genus dari isolat-isolat tersebut. Untuk penentuan spesies, diperlukan identifikasi molekuler. Salah satu cara identifikasi spesies fungi secara molekuler adalah menggunakan sekuens DNA ribosomal (rdna) pada daerah ITS (Internal Transcribed Spacer region). Daerah ITS rdna yang baik untuk diagnostik identifikasi spesies dan analisis filogenetik adalah daerah ITS-1 dan ITS-2 yang bersama-sama mengapit daerah 5.8S rdna fungi. Sebelum dapat dilakukan analisis filogenetik molekuler berdasarkan sekeuens DNA ribosomal (rdna) pada daerah ITS (Internal Transcribed Spacer), terlebih dahulu harus dilakukan optimasi isolasi DNA dan amplifikasi ITS rdna tersebut. Optimasi ini perlu dilakukan, supaya diperoleh produk amplifikasi Polymerase Chain Reaction (PCR) ITS rdna yang cukup baik, untuk menghasilkan sekuens DNA yang baik untuk analisis filogenetik. Keberhasilan isolasi dan amplifikasi DNA dengan PCR bergantung pada konsentrasi isolat DNA templat yang cukup, primer, dan temperatur annealing. Terdapat beberapa primer untuk ITS rdna, yaitu 2 pasang yang mencakup keseluruhan daerah ITS-1, ITS-2 dan 5,8S rdna, dan masingmasing satu pasang primer yang mencakup hanya daerah ITS-1 atau ITS-2 [8]. Untuk keberhasilan identifikasi secara molekuler menggunakan sekuens ITS rdna, diperlukan hasil amplifikasi yang setidaknya memungkinkan sekuensing ITS- 1 dan ITS-2 dari rdna. Pemilihan pasangan yang tepat dengan kondisi temperatur annealing akan sangat mempengaruhi keberhasilan PCR. Makalah ini memaparkan hasil optimasi isolasi DNA menggunakan Wizard Genomic Purification kit, yang bergantung pada umur kultur fungi. Makalah ini juga membahas keberhasilan amplifikasi ITS rdna dari segi pemilihan pasangan primer dan temperatur annealing PCR. METODE PENELITIAN Fungi yang digunakan untuk penelitian ini merupakan isolat fungi penghasil selulase dan kitinase dari cagar biosfer Giam Siak Kecil-Bukit Batu, Riau dan dikoleksi di Laboratorium Biokimia, FMIPA, Universitas Riau, dengan kodekode galur LBKURCC20, LBKURCC21, LBKURCC22, LBKURCC27, LBKURCC28, LBKURCC29, LBKURCC30, LBKURCC34. Kultur fungi dipelihara pada media PDA dengan variasi waktu panen. Pada umur kultur tertentu, miselia dipanen dari media agar, dan DNA diekstraksi dari 100 mg miselia menggunakan Wizard Genomic Purification kit (Promega Cat. No. A1120) dengan memecahkan dinding sel menggunakan enzim litikase Artrhobacter luteus (SIGMA-Aldrich, Cat. No. L2524). PCR dilakukan menggunakan Thermal Cycler Techne TC-312 Amplifikasi digunakan dengan pasangan-pasangan primer sesuai deskripsi [8], yaitu untuk primer forward digunakan primer-primer ITS1, ITS3 atau ITS5, sedangkan untuk primer-primer reverse digunakan primer ITS2 atau ITS4. Amplifikasi PCR dilakukan dalam volume 50 µl, yang mengandung 3 µl templat DNA, masingmasing primer 0,4 µm, 200 µm dntp, dan 2,5 U GoTaq Flexi DN Polymerase (Promega Cat. No. M8291) dalam bufer PCR menggunakan MgCl 2 hingga konsentrasi akhir 1,5 mm. PCR dilakukan dengan hot start 5 menit pada 95 o C, diikuti 408 Semirata 2013 FMIPA Unila
Prosiding Semirata FMIPA Universitas Lampung, 2013 35 siklus: denaturasi 1,5 menit pada 94 o C, annealing 1 menit pada variasi temperatur 44 o C s/d 49 o C, dan pemanjangan rantai selama 3 menit pada temperatur 72 o C. Setelah 35 siklus, dilakukan reaksi pemanjangan rantai akhir selama 5 menit. Hasil PCR dianalisis secara elektroforesis dengan gel agarosa 1,2% (berat/volume) dalam bufer 1xTAE, diwarnai dengan Etidium Bromida, dan difoto dengan kamera digital SONY DSC-W80. Ukuran fragmen ditentukan dengan membandingkan terhadap standar1 Kb Ladder (Promega Cat. No. G571A). HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi DNA kromosomal dari sel fungi relatif mudah dilakukan menggunakan Wizard Genomic Purification kit, dan enzim Litikase untuk memecahkan dinding sel fungi. Akan tetapi umur kultur fungi pada media PDA sangat menentukan keberhasilan isolasi DNA kromosomal. Hal ini terlihat dari variasi umur kultur berbagai galur isolat fungi zona inti tanah hutan cagar biosfer GSKBB yang dapat memberikan hasil isolasi DNA kromosomal yang baik (Tabel 1). Untuk galur-galur yang pertumbuhannya sangat cepat, dan cepat membentuk spora, maka umur kultur optimum untuk isolasi DNA kromosomal fungi adalah 1 (satu) hari, seperti yang ditunjukkan Penicillium sp. LBKURCC27. Untuk galur yang pertumbuhannya lambat, maka umur kultur optimum untuk isolasi DNA kromosomal fungi adalah 3 (tiga) hari, seperti yang ditunjukkan Penicillium sp. LBKURCC20 dan Trichoderma sp. LBKURCC22. Analisis morfologi koloni menunjukkan bahwa apabila spora telah tumbuh subur (Gambar 1B.), maka sulit sekali memecahkan dinding sel fungi. Hal ini akan menyulitkan isolasi DNA kromosomal fungi, dan konsentrasi DNA yang diperoleh tidak cukup untuk memberikan pita pada elektroforesis. Sebaliknya, apabila pertumbuhan kultur belum cukup banyak, maka jumlah miselia A) B) GAMBAR 23. Kultur Penicillium sp. LBKURCC20 pada media PDA. Panel A) Umur kultur 3 hari, dengan miselia putih tanpa spora; B) Umur kultur 4 hari, dengan miselia telah dipenuhi spora hijau. yang diperoleh akan kurang untuk isolasi DNA optimal. Morfologi koloni yang optimal untuk isolasi DNA ditunjukkan oleh Gambar 1A, yaitu morfologi koloni kultur Penicillium sp. LBKURCC20 berumur 3 hari yang belum ditumbuhi spora, tetapi cukup padat ditumbuhi miselia yang terlihat sebagai benang-benang putih. Gambar 1B adalah morfologi koloni kultur Penicillium sp. LBKURCC20 berumur 4 hari yang telah ditumbuhi banyak spora hijau. Hasil optimasi PCR untuk amplifikasi daerah ITS rdna fungi isolat GSKBB dengan berbagai pasangan primer ditunjukkan Tabel 2. DNA ribosomal dari semua kultur fungi isolat dalam penelitian ini tidak berhasil diamplifikasi dengan pasangan primer ITS1-ITS4 (tidak ditunjukkan dalam tabel). DNA ribosomal semua kultur, kecuali Penicillium LBKURCC34 berhasil diamplifikasi secara PCR menggunakan pasangan primer ITS5- ITS4, pada suhu annealing antara 44 o C s/d 47 o C. Berarti dapat disimpulkan bahwa primer ITS1 kurang homolog dengan sekuens pada bagian 18S rdna yang mengawali ITS-1 dari DNA ribosomal semua fungi isolat hutan zona inti GSKBB. Rata-rata rdna yang dapat diamplifikasi Semirata 2013 FMIPA Unila 409
Titania Tjandrawati Nugroho dkk: Optimasi Isolasi dan Amplifikasi ITS DNA Ribosomal Fungi Karbolitik Isolat Zona Inti Cagar Biosfer Giam Siak Kecil-Bukit Batu dengan pasangan primer ITS5-ITS4 adalah 624 s/d 664 pb. Ini sesuai dengan daerah yang mencakup sebagian 18S rdna, ITS-1, 5,8S rdna, ITS-2 dan sebagian dari 28S rdna fungi pada umumnya. Apabila rdna fungi isolat GSKBB berhasil diamplifikasi menggunakan pasangan primer ITS5-ITS4, yang merupakan primer-primer eksternal rdna fungi, maka tidak perlu lagi dilakukan amplifikasi PCR menggunakan pasangan primer ITS5-ITS2 dan ITS3-ITS4, karena primer-primer ITS2 dan ITS3 merupakan primer-primer internal rdna fungi. Oleh karena itu, amplifikasi rdna menggunakan pasangan primer ITS5-ITS2 dan ITS3-ITS4 hanya dilakukan untuk Penicillium sp. LBKURCC34 dan Trichoderma sp. LBKURCC22, yang semula pada suhu 45 o C tidak memberikan produk PCR dengan primer ITS5-ITS4. Meskipun suhu annealing diturunkan hingga 44 o C, produk PCR primer ITS5-ITS4 untuk rdna Penicillium sp. LBKURCC34 tetap tidak diperoleh. Hal berbeda ditemukan untuk Trichoderma sp. LBKURCC22 ketika suhu annealing diturunkan ke 44 o C. Pada suhu annealing 44 o C, dapat diperoleh produk PCR untuk rdna Trichoderma sp. LBKURCC22, menggunakan pasangan primer ITS5-ITS4, dengan ukuran 652 pb. Ukuran produk PCR amplifikasi rdna Trichoderma sp. LBKURCC22 menggunakan ITS5-ITS2 berhasil pada suhu annealing 45 o C dengan ukuran produk yang spesifik untuk daerah yang mencakup sebagian 18S rdna, ITS-1, dan sebagian 5,8S rdna, yaitu 384 pb. Amplifikasi rdna Penicillium sp. LBKURCC34 berhasil dilakukan dengan baik menggunakan pasangan primer ITS3- ITS4, pada suhu annealing 44 o C, dengan produk spesifik berukuran 270 pb, yang mencakup daerah 5,8S rdna, ITS-2 dan sebagian 28S rdna. Meskipun produk PCR rdna Penicillium sp. LBKURCC34 dapat diperoleh untuk pasangan primer ITS5-ITS2 pada suhu annealing 47 O C dengan ukuran spesifik 278 pb, terdapat dua produk PCR non-spesifik, dengan ukuran 603 pb dan 502 pb. Kedua produk nonspesifik ini tidak dapat dihilangkan, meskipun suhu annealing dinaikkan hingga 49 o C. Meskipun demikian untuk keperluan sekuensing, kedua produk non-spesifik tidak akan mengganggu, selama dilakukan proses pemurnian pita spesifik 278 pb. Pemurnian pita spesifik 278 pb dapat dilakukan, dengan memisahkan produkproduk PCR ITS5-ITS2 Penicillium sp. LBKURCC34 secara elektroforesis, dan memotong keluar agar pita 278 pb. Produk PCR 278 pb ini kemudian akan dapat dielusi keluar potongan agar sehingga akhirnya diperoleh produk PCR ITS5-ITS2 rdna yang spesifik dan murni. TABEL 5. Umur kultur optimum untuk isolasi DNA kromosomal fungi. Spesies: Galur: Umur Kultur (hari) Penicillium sp. LBKURCC20 3 Penicillium sp. LBKURCC21 2 Trichoderma LBKURCC22 3 sp. Penicillium sp. LBKURCC27 1 Trichoderma LBKURCC28 1 sp. Penicillium sp. LBKURCC29 3 Penicillium sp. LBKURCC30 3 Penicillium sp. LBKURCC34 2.5 TABEL 6. Hasil optimasi PCR amplifikasi daerah ITS rdna fungi isolat GSK-BB dengan berbagai pasangan primer Suhu Ukuran produk PCR dari pasangan primer: Spesies & Galur annealing ( o C) ITS5-ITS4 ITS5-ITS2 ITS3-ITS4 Penicillium sp. LBKURCC20 45 o C 664 pb t.d. t.d. Penicillium sp. LBKURCC21 45 o C 658 pb t.d. t.d. Trichoderma sp. LBKURCC22 45 o C t.d. 384 pb t.d. 410 Semirata 2013 FMIPA Unila
Prosiding Semirata FMIPA Universitas Lampung, 2013 44 o C 652 pb t.d. 270 pb Penicillium sp. LBKURCC27 45 o C 604 pb t.d. t.d. 47 o C 604 pb t.d. t.d. Trichoderma sp. LBKURCC28 45 o C 702 pb t.d. t.d. 624 pb 47 o C Penicillium sp. LBKURCC29 45 o C 624 pb t.d. t.d. Penicillium sp. LBKURCC30 47 o C 654 pb t.d. t.d. 624 pb t.d. t.d. Penicillium sp. LBKURCC34 47 o C t.a. 603 pb t.d. 502 pb 278 pb 44 o C t.a. t.d. 270 pb 49 o C t.d. 603 pb 502 pb 278 pb t.d. Keterangan: t.d. = tidak dilakukan PCR dengan pasangan primer tersebut. t.a. = tidak ada produk hasil PCR dengan pasangan primer tersebut. Amplifikasi rdna semua galur Trichoderma sp. isolat tanah zona inti GSKBB memberikan produk PCR dengan pasangan primer ITS5-ITS4 yang baik dengan ukuran 624 pb dan 652 pb. Hal ini konsisten dengan bar code yang telah diciptakan untuk spesies-spesies dari genus Trichoderma. Untuk Penicillium sp. juga diperoleh produk PCR rdna yang baik untuk pasangan primer ITS5-ITS4, kecuali untuk Penicillium sp. LBKURCC34. Identifikasi spesies dan analisis filogenetik fungi filamen tidak hanya dapat dilakukan dengan sekuens-sekuens ITS rdna, tetapi dapat dilakukan juga dengan sekuenssekuens tef1, cal1, chit18-5 dan rbp2 [9]. Untuk Penicillium telah juga diciptakan bar code yang khusus untuknya, dan kemungkinan dapat memberikan analisis identifikasi yang lebih tepat [10]. Meskipun demikian, penggunaan sekuens ITS rdna merupakan langkah pertama untuk identifikasi spesies fungi secara molekuler. Tentunya semakin banyak metode dan sekuens yang digunakan untuk verifikasi spesies, akan semakin baik, tetapi berarti memerlukan biaya yang lebih tinggi. KESIMPULAN DNA kromosomal fungi isolat tanah zona inti GSKBB yang berhasil diisolasi dengan baik berasal dari umur miselia kultur yang bervariasi mulai dari 1 hingga 3 hari, yaitu sebelum timbul spora, tetapi dalam jumlah miselia yang cukup. Primer untuk amplifikasi ITS rdna terbaik adalah pasangan primer ITS-4 dan ITS-5, kecuali untuk Penicillium sp. LBKURCC34. Daerah ITS rdna Penicillium sp. LBKURCC34 dapat diamplifikasi menggunakan pasangan primer ITS5-ITS2 dan ITS3-ITS4. Temperatur annealing bervariasi bergantung pada galur dan pasangan primer yang digunakan, tetapi berada pada rentang antara 44 o C s/d 49 o C. UCAPAN TERIMA KASIH Penelitian ini dibiayai Dana Hibah Guru Besar Lembaga Penelitian Universitas Riau a.n. Titania T. Nugroho, sesuai Surat Perjanjian Pelaksanaan Hibah Program Penelitian Guru Besar 105/UN.19.2/PL/2012, tanggal 3 April 2012, berdasarkan DIPA Universitas Riau tahun 2012, Nomor: 0680/023-04.2.16/04/2012 DAFTAR PUSTAKA Barreiro, C., Martin, J. F., Garcia-Estrada, C. (2012). Proteomics shows new faces for the old Penicillin Produces Penicillium chrysogenum. Journal of Biomedicine and Biotechnology. Vol. Semirata 2013 FMIPA Unila 411
Titania Tjandrawati Nugroho dkk: Optimasi Isolasi dan Amplifikasi ITS DNA Ribosomal Fungi Karbolitik Isolat Zona Inti Cagar Biosfer Giam Siak Kecil-Bukit Batu 2012, Article ID 105109, doi: 10.1155/2012/105109. Berrin, J., Navarro, D., Couturier, M., Olive, C., Grisel, S., Haon, M., Taussac, S., Lechat, C., Courtecuisse, R., Favel, A., Coutinho, P. M., Lesage-Meessen. (2012). Exploring the natural fungal biodiversity of tropical and temperate forests toward improvement of biomass conversion. Appl. Environ. Microbiol., Vol. 78, Issue 18, July 2012 p. 6483 6490. Gal-Hemed, I., Atanasova, L., Komon- Zelazowska, M. K., Druzhinina, I. S., Viterbo, A., Yarden, O. Marine isolates of Trichoderma spp. As potential halotolerant agents of biological control for arid-zone agriculture. (2011). Appl. Environ. Microbiol., Vol. 77, Issue 15, August 2011 p. 5100-5109. Hoyos-Carvajal, L., Orduz, S., & Bissett, J. (2009). Genetic and metabolic biodiversity of Trichoderma from Colombia and adjacent neotropic regions. Fungal Genetics and Biology,Vol. 46, May 2009 p. 615-631. Kubicek, C. P., Komon-Zelazowska, M., & Druzhinina, I. S. (2008). Fungal genus Hypocrea/Trichoderma: from barcodes to biodiversity. J. Zhejiang Univ. Sci. B., Vol. 9, Issue 10, October 2008 p. 753-763. Liu, G., Zhang, L., Wei, X., Zou, G., Qin, Y., Ma, L., Li, J., Zheng, H., Wang, S., Wang, C., Xun, L., Zhao, G-P., Zhou, Z., Qu, Y. (2013). PLOS One, Vol. 8, February 2013 p. e55185. Schuster, A., & Schmoll, M. (2010). Biology and biotechnology of Trichoderma. Appl. Microbiol. Biotechnol., Vol. 87, May 2010 p. 787-799. Seifert, K. A., Samson, R. A., dewaard, J. R., Houbraken, J., Levesque, C. A., Moncalvo, J-M., Louis-Seize, G., Hebert, P. D. N. (2007). Prospects for fungus identification using CO1 DNA barcodes, with Penicillium as a test case. Proc. Nat. Acad. Sci., Vol. 104, Issue 10., March 2007 p. 3901-3906. Sukara, E., & Purwanto, Y. (2009). Biosphere reserve: The management of conservation areas for sustainable economic development. The 3rd Humanosphere Science School: Scientific Exploration and Sustainable Management of Peat and Land Resources in Giam Siak Kecil-Bukit Batu Biosphere Reserve, Riau. (pp. 1-20). Pekanbaru. August 2009. White, T., Bruns, T., Lee, S., & Taylor, J. (1990). Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. Dalam: M. Innis, D. Gelfand, J. Sninsky, & T. White (Eds.), PCR protocols: A guide to methods and applications (pp. 315-322). San Diego: Academic Press. 412 Semirata 2013 FMIPA Unila