Deteksi DNA Seara Visual Dengan Teknik Elektroforesis Laurencius Sihotang I. Tujuan 1. Mempelajari 2. Mendeteksi DNA yang telah di isolasi dengan teknik spektrofotometrik 2. mengetahui konsentrasi dan jumlah DNA II. Kajian Pustaka Teknik Elektroforesis Prinsip teknik elektroforesis adalah berdasarkan migrasi partikel bermuatan dibawah pengaruh medan elektronik dalam kondisi yang konstan. Elektroforesis DNA memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp). Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmenfragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visualisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet (media UV-transilluminator). III. Alat dan Bahan Alat 1. Elektroforesis 2. Sisir pembentuk sumur pada gel 3. Pemasok daya 4. Transimuloator dan sinar ultraviolet Bahan
1. Bubuk gel agarose 2. Larutan etidium bromide 10 mg/ml 3. Larutan elektroforesis TAE 4. Larutan zat pewarna/loading buffer IV. Cara Kerja Pembuatan Gel Agarose 1% Pengenceran larutan TAE dari 10% menjadi 1% dengan rumus m 1 v 1 = m 2 v 2, volume TAE 1% yang akan dibuat adalah 250 ml. Ukur larutan tae sebanyak 25 ml kemudian tambahkan akuades hingga volumnya menjadi 250 ml, sehingga diperoleh larutan TAE 1%. Untuk membuat agarose campurkan TAE 1% sebanyak 40 ml dengan agar 0,4 gram. Aduk sampai merata dan panaskan pada microwave. Setelah itu tuangkan larutan agarose tersebut kedalam cetakan yang sudah disiapkan dengan lengkap dengan sisir pembuat sumur pada agarose. Diamkan beberapa saat sampai agarose dingin dan mengeras. Sisa TAE 1% akan digunakan dalam proses elektroforesis. Elektroforesis Setelah agarose mengeras, dilepaskan dari cerakan dan sisir pembentuk sumurnya juga dilepaskan. Kemudian agarose diletakkan ke dalam elektroforesis, setelah itu bagian kanan dan kiri di isi dengan larutan TAE 1% sampai menggenangi agarose yang berperan sebagai cairan elektrolit. Ambil sampel DNA sebanyak 1μL, kemudian campurkan dengan larutan zat pewarna/loading buffer 1μL. Setelah dicampur merata antara sampel DNA dan loading buffer masukkan ke dalam sumur pada agarose dengan menggunakan mikropipet tanpa merobek agarose. Apabila semua sampel DNA sudah dimasukkan kedalam sumur agarose, elektroforesis dihubungkan dengan sumberdaya dan dinyalakan pada tegangan 90 volt selama 30 menit. Langkah selanjutnya adalah ambil agarose dari elektroforesis, analisis dengan di atas transimulator sinar ultraviolet. Sampel yang terdapat DNA genomnya akan terlihat berpendar.
V. Hasil Genom yang sudah berhasil di isolasi dari sampel darah kemdian diuji dengan elektroforesis dan diperoleh hasil sebagai berikut: Sumur Gel No. Sampel darah Deteksi DNA 1-2 - 3-4 - 5-6 - 7-8 - 9-10 - 11-12 - 13-14 - 15 - Tabel 2. Hasil Elektroforesis Isolasi Genom Darah ke-1 Keterangan: Agarose sebanyak 1 % Waktu : 30 menit Daya : 90 volt Gambar 2. Elektroforesis Genom pertama
*ket: urutan sumur gel adalah nomor 1 dimulai dari bawah ke atas nomor 2 dan seterusnya Sumur Gel No. Sampel darah Deteksi DNA 1 3 + 2 17-3 4-4 6 + 5 7 + 6 9-7 13-8 Marker 9 3-10 4-11 6 - Tabel 3. Hasil Elektroforesis Isolasi Genom Darah ke-2 Keterangan: Agarose sebanyak 0,9 % Waktu : 25 menit Daya : 90 volt Sumur gel no 9, 10, 11 merupakan hasil PCR Sumur Gel No 12, 13, 14, 15 rusak sehingga tidsak dapat digunakan Berpendar Gambar 3. Elektroforesis Genom dan hasil PCR pertama
*ket: urutan sumur gel adalah nomor 1 dimulai dari bawah ke atas nomor 2 dan seterusnya Hasil Elektroforesis Isolasi DNA darah yang kedua yang sudah di PCR dan terlihat pendaran pada sumur 1, 4, dan 5 tetapi mengarah dengan jalur terbalik. VI. Pembahasan Setelah dilakukan elektroforesis diperoleh hasil seperti diatas, dimana pengujian pertama tidak ada terdeteksi genom hasil isolasi. Kemungkinan penyebab tidak terlihatnya genom dari uji pertama adalah waktu untuk pengujian elektroforesis terlalu lama lebih dari 30 menit. Selain itu daya pada leketroforesis juga terbalik, sehingga pergerakan genom menjadi terbalik dimana jalur yang pendek bermuatan negatif dan jalur panjangnya positif. Dengan terbaliknya sumber daya listrik tersebut mengakibatkan genom berjalan terbalik. Dengan waktu yang panjang dan jalur genom dalam agarose pendek memungkinkannya genom sudah melewati agarose sehingga tidak ada yang terlihat tampak pada saat diamati dibawah Transimuloator sinar ultraviolet (UV). Hasil yang diperoleh tersebut sangat tidak memuaskan, hal itu mungkin terjadi akibat seperti dijelaskan diatas sehingga dilakukan pengujian ulang, akan tetapi ada beberapa sampel yang genom hasil isolasi tersebut masih banyak terdapat darah/protein sehingga dilakukan kembali pemurnian dengan memberikan isoplropanol sehingga hanya tabung 2, 4, 6, 7, 9, 13 dan 14 yang di uji kembali. Akan tetapi karena sumur gel ada 15 dengan memikirkan efesiensi dilakukan juga elektroforesis terhadap DNA hasil PCR pertama yaitu sampel tabung nomor 3, 4 dan 6. Setelah melakukan elektroforesis kedua terhadap genom, dan di amati diatas transimulator UV diperoleh hasil seperti diatas. Cukup membuat lega karena sampel tabung nomor 3, 6 dan 7 terlihat pendaran genom saat diamati di transimulator UV dengan arah yang terbalik. Untuk sampel lain yang tidak terlihat kemukinan yang terjadi human eror yaitu pada saat pengambilan sampel dr tabung sampel kurang tepat atau memang pada saat isolasi genom tidak berhasil. Hal lain yang dapat menyebabkan kegagalan seperti faktor praktikan belum terbiasa melakukan praktikum yang membutuhkan ketelitian serta keakuratan pengisian bahan serta
perlunya waktu yang lebih lama agar dapat menghasilkan isolate yang terbaik serta maksimal. Kesalahan selanjutnya dapat terjadi pada saat melakukan langkah kerja, misalnya langkah kerja yang kurang tepat, atau adanya kontaminasi sehingga DNA yang seharusnya diambil supernatannya tetapi malah ikut terbuang bersama hasil sentrifugasi yang tidak diinginkan. Akan tetapi yang cukup membuat bingung adalah sampel tabung nomor 3 dan tabung nomor 6 genom terlihat berpendar, akan tetapi pada sampel nomor tersebut hasil PCR tidak ada pendaran. Kemungkinan penyebabnya adalah DNA yang diamplifikasi cukup sedikit dan kemungkinan lain adalah kurang sensitifnya hasil uji PCR. Hal inilah yang menumbuhkan harapan masih bisa dilanjutkan ke tahap selanjutnya. VII. Kesimpulan Hasil uji genom pertama tidak tampak berpendar diatas transimulator UV, kemungkinan penyebabnya adalah terlewatnya genom pada agarose karena sumber daya yang terpasang terbalik. Hal ini diperkuat dengan uji elektroforesis kedua dimana diperoleh hasil sampel nomor 3, 6 dan 7 terdapat pendaran genom. Daftar Acuan Brown, S.M., Hay, J.G., Ostrer, H. 2009. Essentials of Medical Genomics. Second ed. John Wiley & Sons, Inc. New Jersey, USA. Campbell, A. N. J. B. Reece & L. G. Michell. 2012. Biologi. Edisi 8 jilid 1. terj. Erlangga. Jakarta Cohn Robert m., Roth Karl s. 1996. Biochemistry and Disease. William and Wilkins, Inc. Maryland Jamilah. 2005. Pengaruh pemberian macam deterjen, penambahan enzim dan ekstrak nanasterhadap hasil isolasi DNA berbagai macam buah. Universitas Negeri malang. Malang McPherson, M.J., Moller, S.G. 2006. PCR. Second ed. Taylor & Francis Group. Madison Avenue, NY, US. Theophilus, B.D.M. 2008. Principles and Medical Applications of the Polymerase Chain Reaction. In: Molecular Biomethods Handbook Second Edition. Ed: Walker, J.M., Rapley, R. Humana Press, NJ, USA.