Halaman : 1 dari 5 METODE UJI 1. RUANG LINGKUP Metode ini digunakan untuk mengukur indeks similaritas pada individu sebagai dasar untuk menentukan hubungan kekerabatan dari tumbuhan, hewan maupun manusia. 2. ACUAN NORMATIF Ford-Lioyd, B. 1996. Measuring Genetic Variation Using Molecular Marker. International Plant genetic Resources Institute. Karp, A., S. Kresovich, K. V. Bhat, W. G. Ayad and T. Hodgkin. 1997. Molecular tools in plant genetic resources conservation: a guide to the technologies. International Plant genetic Resources Institute. Sambrook, J., E. F. Fritch and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning : a laboratory manual. Volume 1-3. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press., Cold Spring Harbor. Sulandari, S. Dan M. S. A. Zein. 2003. Panduan Praktis Laboratorium DNA. Bodang Zoologi, Pusat Penelitian Biologi-LIPI. Yuwono, T. 2006. Biologi Molekular. Erlangga, Jakarta 3. ISTILAH DAN DEFINISI Indeks similaritas adalah nilai kesamaan digunakan untuk membandingkan kesamaan species yang ditemukan antara dua komunitas. Nilai indeks similaritas yang relatif rendah menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang relatif besar antara species penyusun dari dua komunitas yang dibandingkan Hubungan kekerabatan adalah salah satu prinsip mendasar untuk mengelompokkan setiap individu kedalam kelompok katergori atau silsilah perkawinan (keluarga)
Halaman : 2 dari 5 4. CARA UJI 4.1. Prinsip Analisis variasi molekular berdasarkan penanda RAPD atau ISSR dapat menggunakan dendogram berdasarkan rata-rata koefisien similaritas menggunakan program MVSP 3.1. Perhitungan koefisien similaritas pada program ini menggunakan metode pengklasteran UPGMA dan similaritas menggunakan Jaccard s Coefficient. Kelebihan Jaccard s Coefficient adalah tidak menggunakan karakter dobel negatif (karakter yang sama-sama tidak dimiliki). 4.2. Bahan Pita hasil amplifikasi DNA 4.3. Peralatan Software MVSP 4.4. Persiapan pengujian Data berupa pita-pita DNA diubah menjadi matriks 0-1 dengan cara pita DNA yang tampak dikode menggunakan angka 1 sedangkan pita DNA yang tidak tampak dikode menggunakan angka 0. Matriks dibuat menggunakan program komputer Microsoft Excel (.xls). Data hasil skoring kemudian dimasukkan dalam program (Multi Variate Statistical Package) MVSP 3.1A. Hasil analisis data menggunakan MVSP 3.1A adalah dendogram menggunakan metode UPGMA ( Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean) (Sokal dan Sneath, 1978). 4.5. Prosedur pengujian File baru New pada program PFE dibuka dan akan tampil sebuah layar. Pada layar tersebut diketik *L <jumlah karakter> <jumlah populasi>. Setelah modifikasi selesai dilakukan, maka tabel n x t selanjutnya di-copy ke program PFE (Gambar 1). File tersebut disimpan dalam format.mvs dengan tambahan
Halaman : 3 dari 5.mvs pada akhir nama file dalam menu save. File.mvs tersebut selanjutnya dapat dibuka dengan program MVSP 3.1. Gambar 1. Tabel n x t yang telah dikopi ke program PFE (Dokumentasi pribadi) Selanjutnya, program MVSP 3.1 dibuka dengan aplikasi mvspw. File pada MVSP diklik Open dan file.mvs yang tersimpan dipilih. Ketika terbuka, MVSP akan menampilkan sebuah layar tambahan mengenai jumlah variabel dan jumlah sampel dari file.mvs yang dimasukkan. Nama OTU/ sampel pada program MVSP yang sebelumnya telah diubah menjadi simbol [a, b, c] dapat diubah kembali dengan menu Data Edit Data. Pengubahan data pada menu tersebut dapat menerima spasi, tetapi tidak dapat mencetak miring sebagaimana yang seringkali dilakukan terhadap nama suatu spesies. Setelah semua simbol OTU diubah menjadi nama spesiesnya, layar Edit Data tersebut ditutup dan analisis klaster dapat dimulai.analisis klaster dilakukan melalui menu Analyses Cluster Analysis.Pada layar Cluster Analysis Options dipilih metode pengklasteran UPGMA dan similaritas Jaccard s Coefficient (Gambar 2). Kemudian dipilih submenu Advance nyalakan pilihan similarity/ distance matrix, clustering report, dan text dendrogram (Gambar 3). Setelah semuanya selesai, klik OK. Hasil analisis akan memunculkan dua layar, yakni layar pertama yang berisikan matriks similaritas dan analisis klaster serta layar kedua yang menampilkan dendrogram.
Halaman : 4 dari 5 Gambar 2. Tampilan kotak dialog Cluster Analysis Option pada program MVSP 3.1 untuk memilih metode pengklasteran dan similaritas (Dokumentasi pribadi) Gambar 3. Tampilan kotak dialog Cluster Analysis Option pada program MVSP 3.1 untuk memilih hasil yang nantinya akan ditampilkan (result to display) (Dokumentasi pribadi) 4.6. Perhitungan Ukuran pita DNA dapat ditentukan dengan membandingkan jarak perpindahan pita DNA sampel dengan jarak migrasi DNA ladder.penentuan ukuran pita-pita DNA dilakukan dengan cara mengukur jarakmigrasi standar dari sumuran. Ukuran fragmen DNA ladder yangdiketahui kemudian dihitung logaritmanya. Nilai logaritma ini dijadikansebagai sumbu Y dan jarak migrasi standar sebagai sumbu
Halaman : 5 dari 5 X.Berdasarkan kedua sumbu tersebut, kemudian diperoleh persamaan garislinear Y=aX+b. Ukuran-ukuran pita DNA hasil amplifikasi pada masing-masing sampel dapat diketahui dengan memasukkan nilai terukur dalam persamaan garis tersebut. Nilai Y yang diperoleh dihitung nilai antilognya (10^Y) dan hasil tersebut merupakan ukuran panjang basayang teramplifikasi. 5. PENGENDALIAN MUTU Pembuatan dendogram berdasarkan karakter molekular dapat dilakukan dengan terlebih dahulu mengubah data karakter molekular menjadi data biner, membuat tabel n x t, kemudian menganalisis dengan program MVSP 3.1.