7 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor dan Balai Penelitian Tanaman Hias Segunung. Penelitian berlangsung pada Bulan Juli 2009 sampai dengan November 2009. Metode Penelitian Perbanyakan Propagul Agens Antagonis Propagul mikroba antagonis disiapkan dengan cara sebagai berikut: biakan murni B. subtilis dan P. fluorescens masing-masing ditumbuhkan pada media nutrient agar dan King s B yang mengandung 0.01M FeCl 3. Setelah diinkubasikan dalam inkubator bersuhu 30 ± 2 ºC selama 24 jam, diambil 3 loop penuh dan disuspensikan ke dalam 10 ml air steril, dikocok menggunakan vorteks supaya homogen, sehingga terbentuk suspensi dengan kerapatan 10 12 cfu/ml. Sebanyak satu ml suspensi isolat tersebut dituangkan ke dalam 500 ml media Nutrient Broth (NB) di dalam erlenmeyer berkapasitas 750 ml, kemudian dimasukkan ke dalam penangas air bersuhu 30 ºC sambil digoyangkan selama 24 jam. Sel bakteri kemudian dipanen dan disuspensikan ke dalam akuades steril. Selanjutnya 10% dari larutan propagul tadi dimasukkan ke dalam media perbanyakan massal. Perbanyakan Massal Bahan Pembawa Biopestisida Secara umum strategi perbanyakan massal dilakukan dengan memodifikasi metode Suryana & Cahyono (2008). Langkah dalam pembuatannya adalah sebagai berikut: 1. Penyiapan medium basal Untuk basal medium, kascing (vermicompost) sebanyak 100gr direndam dalam 1 liter air steril selama 1 hari, kemudian disaring. Hasil saringan kascing tersebut selanjutnya ditambah molase 10% sesuai perlakuan (Tabel 1) kemudian disterilkan.
8 Tabel 1 Berbagai formulasi biopestisida untuk uji viabilitas, kompatibilitas dan kemangkusan No Perlakuan 1. Bassal medium, ph normal 2. Bassal medium + Bs, ph normal 3. Bassal medium + Pf, ph normal 4. Bassal medium + Bs +Pf, ph normal 5. Molase 10%, ph normal 6. Molase 10% + Bs, ph normal 7. Molase 10% + Pf, ph normal 8. Molase 10% + Bs + Pf, ph normal 9. Bassal medium + molase 10 %, ph normal 10. Bassal medium + Bs + molase 10%, ph normal 11. Bassal medium + Pf + molase 10%, ph normal 12. Bassal medium + Bs + Pf + molase 10%, ph normal 13. Bassal medium, ph 3.5 sebelum biofermentasi 14. Bassal medium + Bs, ph 3.5 sebelum biofermentasi 15. Bassal medium + Pf, ph 3.5 sebelum biofermentasi 16. Bassal medium + Bs +Pf, ph 3.5 sebelum biofermentasi 17. Molase 10%, ph 3.5 sebelum biofermentasi 18. Molase 10% + Bs, ph 3.5 sebelum biofermentasi 19. Molase 10% + Pf, ph 3.5 sebelum biofermentasi 20. Molase 10% + Bs + Pf, ph 3.5 sebelum biofermentasi 21. Bassal medium + molase 10 %, ph 3.5 sebelum biofermentasi 22. Bassal medium + Bs + molase 10%, ph 3.5 sebelum biofermentasi 23. Bassal medium + Pf + molase 10%, ph 3.5 sebelum biofermentasi 24. Bassal medium + Bs + Pf + molase 10%, ph 3.5 sebelum biofermentasi 25. Bassal medium, ph 3.5 sesudah biofermentasi 26. Bassal medium + Bs, ph 3.5 sesudah biofermentasi 27. Bassal medium + Pf, ph 3.5 sesudah biofermentasi 28. Bassal medium + Bs +Pf, ph 3.5 sesudah biofermentasi 29. Molase 10%, ph 3.5 sesudah biofermentasi 30. Molase 10% + Bs, ph 3.5 sesudah biofermentasi 31. Molase 10% + Pf, ph 3.5 sesudah biofermentasi 32. Molase 10% + Bs + Pf, ph 3.5 sesudah biofermentasi 33. Bassal medium + molase 10 %, ph 3.5 sesudah biofermentasi 34. Bassal medium + Bs + molase 10%, ph 3.5 sesudah biofermentasi 35. Bassal medium + Pf + molase 10%, ph 3.5 sesudah biofermentasi 36. Bassal medium + Bs + Pf + molase 10%, ph 3.5 sesudah biofermentasi 37. Kontrol positif 38. Kontrol negatif 39. Bakterisida komersil (streptomisin sulfat 20% ) sesuai anjuran
9 2. Perlakuan ph Terdapat tiga jenis perlakuan ph yang digunakan: (1) ph diatur dengan penambahan buffer sehingga basal medium memiliki ph 3.5, (2) ph 3.5 diatur setelah selesai pelaksanaan biofermentasi dan (3) ph tetap seperti semula tanpa ada perlakuan apapun. 3. Fermentasi Biopestisida Basal medium yang telah jadi kemudian diberi bakteri antagonis (10 ml/1lt) dengan kerapatan 10 5 10 6 cfu/ml dan diinkubasikan selama tiga minggu melalui proses fermentasi secara aseptik menggunakan alat fermentor, alat tersebut dikenal dengan nama biofermentor. Gambar 1 Bio-Fermentor sederhana yang digunakan untuk penyiapan basal medium pembawa biopestisida organik cair Uji Viabilitas dan Kompabilitas Bahan Aktif dalam Bahan Pembawa Biopestisida Pengujian viabilitas dan kompabilitas bahan aktif dalam bahan pembawa dilakukan menggunakan berbagai perlakuan seperti tersebut pada Tabel 1. Pengujian viabilitas bahan aktif dalam bahan pembawa dilakukan dengan menggunakan metode pengenceran berseri berdasarkan metode Hsu et al. (1994) yang dimodifikasi. Biopestisida disimpan pada suhu ruang (25±2ºC) dan viabilitas bahan aktif diamati satu bulan setelah penyimpanan. Hal tersebut dilakukan untuk mengetahui masa kedaluarsa dari biopestisida ini. Kriteria kompabilitas bahan aktif terhadap bahan pembawa didasarkan pada kemampuan agens biokontrol atau
10 bahan aktif untuk bertahan hidup dan mempertahankan keefektifannya dalam mengendalikan penyakit busuk lunak bakteri. Uji Kemangkusan Biopestisida Organik Cair terhadap E. carotovora pada Anggrek Phalaenopsis sp. Uji kemangkusan biopestisida dilakukan di Rumah Kaca Balai Penelitian Tanaman Hias Segunung. Tanaman anggrek tersebut merupakan tanaman hasil kultur jaringan yang berumur ±12 bulan setelah aklimatisasi dan merupakan tanaman yang memiliki persamaan multikarakter (Mary clon). Tanaman ditanam dalam pot plastik berdiameter 20 cm yang berisi campuran media arang dan moss. Percobaan I Metode Penyemprotan langsung. Daun anggrek diinokulasi E. carotovora dengan cara menusukkan jarum suntik pada lima titik disetiap daun contoh, kemudian setelah daun kering disemprotkan biopestisida organik berbahan aktif B. subtilis dan P. fluorescens dengan jumlah dan kerapatan yang sama dengan E. carotovora. Pengamatan dilakukan selama 4 minggu terhitung sejak pertama kali inokulasi dilaksanakan. Rancangan yang digunakan adalah rancangan acak kelompok dengan empat kali ulangan. Jumlah perlakuan ada 39 yang terdiri dari 36 bipestisida dengan memakai isolat B. subtilis dan/atau P. fluorescens, ditambah satu fungisida kimiawi sintetik (Agrept 1 g/l) sebagai pembanding dan dua kontrol yakni kontrol positif dan kontrol negatif (Tabel 1). Peubah yang diamati meliputi waktu inkubasi, peluang kejadian penyakit dan perkembangan gejala penyakit. Percobaan II Metode celupan kapas basah. Daun anggrek diinokulasi E. carotovora dengan cara pemberian inokulum suspensi bakteri menggunakan kapas yang telah diberikan suspensi tersebut sebelum pemberian patogen, daun anggrek diberi perlakuan dengan menggoreskan titik luka (suntik luka) sehingga kapas yang telah terisi patogen lebih mudah melakukan penetrasi (kontak) dengan daun anggrek, kapas didiamkan selama ± 1 menit (masa dimana patogen mampu mempenetrasi secara normal), kemudian diberikan berbagai perlakuan antagonis menggunakan biofermentor uji. Pengamatan dilakukan selama 4 minggu terhitung sejak pertama kali inokulasi dilaksanakan. Rancangan percobaan yang digunakan serta peubah yang diamati sama dengan percobaan I.
11 Uji Perbandingan Ketahanan Varietas Anggrek Hibrida Pada uji perbandingan ketahanan digunakan 2 tanaman untuk masingmasing varietas, prosedur perbandingan diambil 3 tanaman anggrek hibrida yang berbeda, bahan tanaman yang digunakan adalah anggrek Phalaenopsis sp. jenis Mary clon yang berbunga putih kode KHM246Q (jenis A), kemudian tanaman pembanding dengan jenis yang sama namun bersumber dari Balai Penelitian Tanaman Hias (jenis B), dan tanaman pembanding yang berasal dari Cipanas (jenis C). Dalam penelitian ini terdapat 2x3 sampel tanaman atau 6 tanaman uji dengan masing-masing dilakukan 4 ulangan, daun dijadikan sebagai ulangannya. Uji perbandingan ketahanan dilakukan dengan metode penyemprotan langsung.