BAB I Pengantar kromatografi Sejarah dan perkembangan kromatografi Teknik pemisahan yang sebenarnya dapat dikatagorikan teknik kromatografi adalah pada waktu Runge, F.F. (1834-1843) melakukan spot test campuran zat warna dari ekstrak tumbuh-tumbuhan pada pita kain dan atau kertas. Pada tahun 1850 ia memisahakan larutan garam dengan kertas. Selanjutnya Goppel sroeder, F (1868) menganalisis zat warna, hidrokarbon, alkohol-alkohol, beer, milk pada minuman dan air minum menggunakan kertas. Sedangkan peneliti Schobeinc menggunakan pita kertas untuk memeriksa cairan. Baru kemudian Day D.T. (1897-1903) menggunakan kolom yang diisi serbuk tanah untuk pemisahan. Namun yang populer adalah kimiawan Rusia, Mikhail Tswett (1906-1907) telah berhasil memisahkan pigment kloroplast dengan fase diam CaCO3 dan petroleum eter sebagai fase gerak. Mulai saat itu konsep kromatografi lebih jelas. Kromatografi diturunkan dari bahasa greek, iaitu chromato (warna) dan grafe (tulisan) yang berarti penulisan dengan warna (writing with colors). Kemudian diikuti beberapa peneliti misalnya: Wilson, J.N. (1940) mempelajari tentang teori pada kromatografi kertas. Tiselius, A (1941) pemenang hadiah nobel atas penemuannya mengenai analisis adsorpsi dan elektroforesis. Martin, A.J.P. dan Synge, R.L.M.(1941) mengajukan pertama kali model yang menjelaskan efesiensi kolom dan mengembangkan kromatografi cair dan berhasil mendapatkan hadiah Nobel tahun 1952. Masih banyak lagi peneliti lain untuk disebut satu persatu, namun yang perlu diingat adalah Van Deemter, JJ dkk yang mengembangkan teori kecepatan dengan menyederhanakan hasil kerja Lapidus dan Ammundson pada fungsi distribusi Gauss. Dari perkembangannya nama kromatografi tidak sesuai lagi karena sekarang tidak hanya dilakukan pemisahan pada campuran senyawa berwarna saja. Dasar pemisahan kromatografi adalah perbedaan kecepatan migrasi komponen (senyawa-senyawa) yang dibawa oleh fasa gerak (mobile phase) dan ditahan secara selektif oleh fasa diam (stationary phase). Metode pemisahan ini sangat dikenal di laboratorium kimia karena dasar pemikiran yang sederhana dan mudah difahami. Hasil pemisahan yang dikehendaki tergantung untuk keperluannya, sehingga dapat dipilih teknik kromatografi yang sesuai, dari yang sederhana hingga yang sangat rumit.
Hampir semua senyawa kimia dapat dipisahkan dengan metode kromatografi dari molekul yang mempunyai berat molekul besar hingga yang kecil. Perkembangan yang kemudian adalah mampu memisahkan senyawasenyawa sterio isomer. Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan memanipulasi sifat kimia-fisika dari molekul yaitu: 1. Kecenderungan molekul larut dalam cairan, hubungannya dengan kelarutan senyawa dalam dua fase cairan dan konsep Like dissolves like. Hubungan ini tidak lepas dengan pengertian polaritas senyawa. 2. Kecenderungan molekul untuk berinteraksi dengan molekul fase gerak ataupun fase diam. Interaksi ini dapat melibatkan terjadinya ikatan hydrogen (adsorpsi), proses filtrasi atau permeasi, dan terjadinya interaksi ionik. 3. Kecenderungan molekul untuk mudah menguap. Kemudahan molekul menguap tergantung dari sifat fisika-kimia, apakah itu ikatan kimia, bobot molekul dan lain-lain. Perbedaan volatilitas ini digunakan sebagai dasar pemisahan pada kromatografi gas. Penggolongan kromatografi Atas dasar mekanisme pemisahan: 1. kromatografi serapan (absorption chromatography) 2. kromatografi partisi (partition chromatography) 3. kromatografi eksklusi (exclusion chromatography) 4. kromatografi penukar ion (ion exchange chromatography) Atas dasar (wujud) fase gerak: 1. kromatografi gas (fase geraknya adalah gas) 2. kromatografi cair (fase geraknya adalah zat cair) Atas dasar bentuk atau bahan fase diam: 1. Kromatografi planar a. kromatografi lapis tipis b. kromatografi kertas c. kromatotorn 2. Kromatografi kolom a. kolom terbuka b. kromatografi gas, c. kromatografi cair kinerja tinggi
Atas dasar cara mengalirkan fase gerak 1. vacuum column chromatography 2. flash column chromatography 3. gravity column chromatography 4. high pressure liquid chromatography Penamaan pada umumnya didasarkan keadaan fase gerak dan fase diamnya, misalnya GLC = gas liquid chromatography (KGC) GSC = gas solid chromatography (KGP) LLC = liquid liquid chromatography (KCC) LSC = liquid solid chromatography (KCP) Definisi istilah Sampel atau cuplikan : senyawa atau campuran senyawa yang larut dalam fase gerak. Senyawa yang larut dalam cairan fase gerak disebut linarut atau solute. Fase diam : dapat berbentuk cairan atau padat, berfungsi menghambat migrasi linarut. Fase gerak : dapat berbentuk cairan atau gas yang berfungsi membawa linarut menelusuri fase diam. Fase pendukung : bahan padat netral terhadap linarut, berfungsi menahan fase diam supaya berfungsi sesuai yang dikehendaki. Elusi : proses awal hingga selesai digerakkan linarut oleh fase gerak menelusuri fase diam. Visualisasi : proses mendeteksi hasil pemisahan baik langsung dengan mata atau melalui tahapan perlakuan terhadap hasil pemisahan tsb.misalnya dengan sinar ultra lembayung ataupun dengan dengan reagen pewarna. Mekanisme Pemisahan Molekul polar dan non-polar Sebelum membicarakan mekanisme pemisahan perlu difahami pengertian senyawa yang bersifat polar dan non polar. Untuk lebih mudahnya diambil contoh H2O, air tersusun dari 2 atom hydrogen dan 1 atom oksigen. Ikatan antara H dan O adalah kovalen. Bila ditarik garis dari atom H ke O akan terbentuk dua garis lurus yang bertemu di atom O dengan sudut 104,5 C. Maka bentuk molekul air tidak merupakan garis lurus, Diingat bahwa atom O adalah
atom yang mempunyai sifat elektronegatif, yaitu atom yang mempunyai kemampuan menarik electron lebih kuat. Seperti halnya atom F, Cl, Br dan I. Dalam hal ini pasangan elektron ikatan tertarik kearah atom O, maka ada 2 gaya dari H ke O yang tidak saling menghilangkan, tetapi dihasilkan resultant yang merupakan momen dipole dari senyawa H2O. Jadi dengan demikian ada muatan positif dan negatif atau muatan terkutub dalam molekul air, oleh karena itu air dinyatakan sebagai senyawa polar. Demikian juga methanol, etanol, aseton dapat dijelaskan seperti tersebut diatas, hanya saja kekuatan momen dipolenya berbeda-beda, sehingga polaritasnyapun berbeda. Bagaimana dengan heksan? Nah molekul ini tidak mempunyai atom elektronegatif sehingga tidak ada momen dipole yang berarti, dengan demikian senyawa ini bersifat non-polar. Bagaimana dengan CCl4 dan CHCl3? Konsep like dissolves like Hubungan polaritas suatu senyawa dengan kelarutan dalam cairan menunjukkan bahwa senyawa polar akan larut dalam cairan polar (pelarut), sedangkan senyawa non-polar larut dalam pelarut non-polar. Dengan pendekatan struktur molekul kiranya dapat diketahui polaritas suatu senyawa. Bila dua senyawa perbedaan polaritas demikian jauh maka keduanya saling tidak larut dan bila keduanya berbentuk cairan maka keduanya tidak dapat saling campur (immicible), dan bila dicampur akan ada dua lapisan cairan. Mekanisme pemisahan secara partisi Mekanisme ini terjadi pada kromatografi yang fase diamnya berbentuk cairan dan fase geraknya berbentuk cairan juga (kromatografi cair-cair). Konsep like dissolves like, interaksi terjadinya ikatan hidrogen juga berlaku disini. Dianalogikan dengan solute terlarut dalam dua cairan (pelarut) yang tidak campur. Solute akan terlarut sebagian pada pelarut yang satu dengan konsentrasi [xjidan sebagian lain terlarut pada pelarut ke dua [x] 2. Bila terjadi kesetimbangan distribusi diatara [x]i dan [xk maka mempunyai nilai tetapan partisi (Ka), nilai K tetap pada temperature tetap. Hukum Nernst.
[X] 1 ---------= K d [X] 2 Jika suatu solute mempunyai Ka = 1, pada pelarut A (fase A)/ pelarut B (fase B). Sebanyak 1000 bagian solute terlarut dalam fase A kemudian larutan ini dimasukkan ke dalam corong pisah, selanjutnya dimasukkan fase B volume sama dengan volume fase A. Campuran digojok hingga terjadi kesetimbangan. Karena K = 1, maka 500 bagian solute berada di fase A dan 500 bagian yang lain berada di fase B. Selanjutnya campuran ini kita pindahkan ke tabung pertama pada alat ekstraksi counter current dari Craig. Proses ekstraksi dilanjutkan dengan selalu menambah pelarut baru (fresh solvent) setelah terjadi kesetimbangan diantara kedua fase, fase atas dipindahkan ke no tabung berikutnya yang sudah berisi fase bawah. Demikian seterusnya, maka suatu saat solute akan terbawa terdistribusi ke nomor-nomor tabung lebih besar dan tidak terdapat dalam tabung pertama lagi. Demikian dapat dijelaskan bagaimana solute dapat terbawa oleh fase gerak berpindah ke nomor tabung lebih besar. Bagaimana bila ada tiga solute yang mempunyai nilai K d berbeda (misal: K d1 =0,2; K d2 =1,0; K d3 =5) semua terlarut pada tabung pertama alat ekstraksi counter current dari Craig? Maka solute yang mempunyai nilai Ka terbesar (solute dengan K d 3 ) akan lebih cepat meninggalkan tabling pertama diikuti solute dengan K d 2 dan terakhir dengan K d 1. Dengan demikian senyawa-senyawa dapat dipisahkan berdasarkan perbedaan tetapan partisi (distribusi) antara dua pelarut yang tidak campur (immiscible) Mekanisme pemisahan secara adsorpsi Mekanisme ini terjadi pada kromatografi dengan fase diam berbentuk padat, sedangkan fase gerak dapat berbentuk cairan atau gas. Interaksi antara linarut, fase diam dan fase gerak adalah terjadinya ikatan hidrogen. Sebagai misal kita ambil contoh fase diam yang banyak digunakan adalah silika gel. Di permukaan silikagel terdapat ujung-ujung gugus OH (OH bebas). Gugus inilah yang menyebabkan silika gel bersifat polar. Bila ada senyawa polar (mempunyai gugus OH, C=O atau adanya atom dengan pasangan elektron bebas) maka
akan terjadi ikatan hidroden antara molekul linarut dengan OH fase diam. Selain interaksi itu ada juga interaksi terbentuknya ikatan hidrogen antara molekul fase gerak dengan linarut dan antara malekul fase gerak dengan fase diam. Jika interaksi fase diam dengan linarut lebih kuat dibandingkan interaksi yang lain, maka fase diam tersebut tertahan (teradsorpsi) lebih lama pada fase diam. Sebaliknya jika interaksi fase gerak dengan molekul linarut lebih kuat maka linarut tersebut mudah terelusi. Maka terjadi persaingan mana lebih kuat ikatan hidrogen yang terjadi antara molekul linarut dengan fase diam atau linarut dengan fase gerak, karena perbedaan afinitas dengan fase diam inilah senyawasenyawa dapat dipisahkan antara satu dengan yang lain. Perbedaan affinitas molekul-molekul linarut dengan fase diam inilah dasar mekanisme adsorpsi. Mekanisme pemisahan secara eksklusi Mekanisme ini juga disebut pemisahan secara jel permeasi. Digunakan fase diam yang inert, oleh karena itu tidak ada interaksi lain misalnya adsorpsi atau partisi. Molekul cuplikan akan berdifusi secara selektif kedalam fase diam yang mempunyai pori-pori dengan ukuran tertentu. Sedangkan molekul yang berukuran besar tidak dapat berdifusi, maka ia akan keluar kolom lebih awal dari pada molekul yang berukuran kecil. Molekul kecil dapat masuk dalam fase diam dan tertahan lebih lama. Fase diam yang digunakan adalah Mekanisme pemisahan secara pertukaran ion Pada awalnya kromatografi dengan mekanisme ini digunakan untuk pemisahan unsur tanah jarang dan berbagai hasil pemecahan pada penelitian energi atom. Kemudian setelah ditemukan dan dikembangkan resina polistirena, penggunaan kromatografi penukar ion dapat mengatasi kesulitan pemisahan pada senyawa biokimia. Kromatografi ini menggunakan fase diam resin bermuatan. Dibedakan dua macam resin yaitu resin penukar an ion dan resin penukar kation. Mekanisme pemisahan dapat di lukiskan sebagai berikut : a. x - + r + y - r - + r + x - b. X + + r y + r + + r - x +
a. Reaksi penukaran anion b. Reaksi penukaran kation x adalah ion cuplikan y adalah ion fase gerak r adalah bagian ion fase gerak Reaksi diatas menunjukkan bahwa pada kromatografi penukar ion terjadi persaingan antara ion fase gerak dengan ion cuplikan untuk berikatan dengan bagian resin ion. Perbedaan kekuatan interaksi diantara ion cuplikan dengan fase diam resina inilah komponen dapat dipisahkan. Jika senyawa terlarut (cuplikan) berinteraksi kuat dengan bagian ionic resina maka senyawa tersebut ditahan lebih lama didalam kolom, sedangkan senyawa terlarut berinteraksi lemah dengan bagian ionic resina akan tidak ditahan lama oleh resina maka akan keluar dari kolom lebih cepat.