III BAHAN DAN METODE PENELITIAN 3.1. Bahan Penelitian 3.1.1. Bahan Penelitian Penelitian ini menggunakan 10 sampel darah sapi Pasundan bahan yang digunakan diantaranya N2 cair, alkohol 70 %, yodium tinkture, kapas dan tissue. Bahan untuk pemurnian albumin yaitu aquabides, natrium sulfat 11,25 %, natrium sulfat 30 %, natrium sulfat 22,5 % dan bahan elektroforesis (PAGE) yaitu IA 7,8 akrilamide, 0,2 gr bis, 4 ml gliserol, aquabides sampai 20 ml, IB 2,772 gr tris amino metan, 0,005 gr ammonium persulfat, IID 2,5 µl TEMED, 1,5 gr tris amino metan, 7,2 gr glisin, 1,64 gr tris amino metan, HClsampai 25 ml (ph 6,8), 40 ml gliserol, 20 ml bromophenol blue 0,01 %, 120 ml aquabides, 30 ml methanol, 10,5 acetic acid glacial, 3,75 ml commasie brilliant blue R-25 0,1 %, 125 ml methanol dan 50 ml acetic acid gel. 3.1.2. Alat Penelitian Peralatan yang digunakan untuk pengambilan sampel darah adalah spuit 10 ml, ice box/cooling box. Pemurnian abumin menggunakan tabung ependrof untuk penyimpanan serum, tabung kronis, timbangan analitik (ketelitian 0,001 gram), becker glass, pengaduk, botol penampung 1 liter, incubator, penangas air, sentrifugator 3000 rpm, kertas saring, tabung reaksi, cooling box dan alat elektroforesis poliakrilamida sistem vertical (Mini-Protean II,Bio-Rad) terdiri dari power supply 40 ma, runner, kaca penjepit, sisir tempat membuat sumur gel,
16 mikropipet, eppendorft, tabung reaksi, penangas air, inkubator, becker glass dan jangka sorong. 3.2. Metode penelitian Metode penelitian yang digunakan yaitu metode eksploratif yang disajikan secara deskriptif, untuk menggali dan mengetahui pola pita protein albumin yang diidentifikasi melalui darah sapi Pasundan sebanyak 10 ekor untuk mengetahui pola pita protein albumin darah menggunakan polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). 3.2.1. Penentuan Sampel Sapi Ternak Jumlah sampel darah yang diambil dari 10 ekor sapi Pasundan, mengingat jumlah populasi yang belum diketahui di area penelitian. Penentuan wilayah penelitian dilakukan secara purposive sampling, yaitu di wilayah Village Breeding Center (VBC) Dusun Sukasari Jalan Cikamurang Desa Cikawung Kecamatan Terisi Kabupaten Indramayu Jawa Barat yang memiliki populasi sapi Pasundan yang banyak. Pemilihan sampel ternak menggunakan simple random sampling. Kriteria inklusif sampel ternak adalah : 3.2.1.1. Ternak dalam keadaan sehat dan tidak cacat, hal ini ditentukan karena berkaitan dengan pengambilan darah. 3.2.1.2. Ternak terpilih merupakan sapi Pasundan sesuai dengan rumpun yang telah ditetapkan menteri pertanian berdasarkan SK No. 1051/kpts/SR.120/10/2014 tentang penetapan rumpun sapi Pasundan.
17 Sedangkan kriteria eksklusif sampel ternak adalah sapi ternak pada saat diambil sampel darahnya tiba-tiba sakit, dan pemilik ternak tidak mengijinkan ternaknya diambil sampel. 3.2.2. Teknik Pengambilan Sampel Darah Pengambilan sampel darah dilakukan dari pembuluh darah balik bagian ekor, masing-masing sampel ternak diambil sebanyak 5-10 ml dengan menggunakan spuit 10 ml. Kemudian diambil bagian serum darahnya dengan cara sentrifugasi. 3.2.3. Penetapan Albumin Darah Girindra (1989), menjelaskan bahwa albumin darah mempunyai sifat larut dalam garam. Oleh karena itu penetapan protein serum untuk analisis albumin darah menggunakan metode fenol-ciocalteu, yaitu dengan pengendapan fibrinogen melalui pencucian natrium sulfat untuk mendapatkan albumin. Berikut merupakan penjelasan metode fenol-ciocalteu sebagai berikut : Tahap persiapan alat dan bahan : Siapkan penangas air dengan suhu 37o C, nyalakan terlebih dahulu selama 15 menit agar suhu tetap. Siapkan incubator dengan suhu 37o C. Masukan dalam incubator 2 buah tabung konis 15 ml, 4 buah tabung reaksi, Na2SO4 dengan konsentrasi 30%, 22,5%, dan 11,25 semua bahan tadi selalu dimasukan kedalam incubator agar tidak mengalami supernaturasi (penggumpalan). Pengendapan fibrinogen : Masukan 1 ml serum darah kedalam tabung konis.
18 Tambahkan larutan Na2SO4 11,25% sebanyak 0,75 ml. Sentrafigusi bahan tersebut selama 20 menit dengan 1500 rpm. Fibrinogen akan terendap, kemudian pisahkan dan ambil 0,75 ml bagian cairan tanpa fibrinogen taruh pada tabung konis. Pemisahan globulin : Siapkan cairan 0,75 ml cairan tanpa fibrinogen tadi. Tambahkan larutan aquabides dan Na2SO4 30% masing masing sebanyak 0,75 ml. Larutan yang sudah dicampur tadi dihomogenkan dengan cara membolakbalik tabung reaksinya. Panaskan larutan yang sudah homogen pada penangas air dengan suhu 37o C selama 10 menit. Sentrifugasi larutan, setelah selesai ambil cairan bagian atas pada tabung konis sehingga terpisah presipitatnya. Pemisahan larutan albumin: Siapkan cairan yang terpisah presipitatnya sebanyak 2 ml dan tambahkan 3 ml larutan Na2SO4 30%, setelah tercampur homogenkan. Panaskan larutan tersebut selama 15 menit dengan penangas air. Saring dengan menggunakan kertas saring satu sampel 3 kali penyaringan. Setelah penyaringan terakhir larutan albumin atau Bovine Serum Albumin (BSA) didapatkan dan siap digunakan untuk proses elektroforesis. 3.2.4. Elektroforesis Harris, (1994) menjelaskan bahwa analisis protein albumin darah dilakukan dengan metode elektroforesis menggunakan SDS (sodium dedosil
19 sulfate) poliakrilamid gel. Lebih lanjut pemisahan pertama dilakukan pada diskus panjang akrilamid. Kemudian keseluruhan diskus yang mengandung polipeptida yang terpisah sesuai dengan titik isoelektriknya digunakan sebagai selipan pada lempeng tipis gel akrilamid yang mengandung SDS, dan selanjutnya dielektroforesis. Prosedur elektroforesis diantaranya : a. Preparasi sampel 1. Sampel dipekatkan atau dilakukan freeze dry hingga kering, kemudian dilarutkan (1:1, jika cair) dalam sampel buffer/loading buffer. 2. Sampel yang sudah larut kemudian dipanaskan pada air mendidih selama 5 menit. Sampel siap untuk digunakan. b. Penyusunan alat pencetak gel 1. Disiapkan slot pencetak gel pada posisi horizontal. 2. Disisipkan plat kaca yang berukuran lebih besar ke dalam celah antara kedua slot pencetak gel. 3. Diantara slot pencetak gel dan kaca tersebut, terhadap kedua bagian sisi celah, disisipkan spacer/ pembatas tepi gel. 4. Kemudian, diatas spacer tersebut, disisipkan plat kaca yang berukuran lebih kecil. 5. Slot pencetak kemudian diletakkan ke posisi vertikal, kemudian ke dalam celah yang terbentuk diantara kedua plat kaca disisipkan kartu pencetak untuk memastikan bahwa kedua spacer di kedua sisi celah berdiri vertikal. 6. Susunan slot pencetak gel dan plat kaca kemudian dikencangkan dengan mengencangkan great yang berada di bagian belakang slot pencetak.
20 Perlu diperhatikan bahwa tekanan di semua sisi harus merata dan tidak terlalu kencang, karena dapat menyebabkan plat kaca menjadi pecah. 7. Setelah susunan slot pencetak tersebut kompak, keluarkan kartu pencetak dari celah antara kedua kaca tersebut, membentuk sumur untuk tempat gel dicetak. c. Preparasi gel 1. Buat larutan running buffer, yaitu buffer Tris HCl 1,5 M ph 8,8 (18,19 g Tris dalam aquades, adjust ph dengan HCl 1 N, adjust volume sampai dengan 100 ml dengan aquades). 2. Buat larutan stacking buffer; yaitu buffer Tris HCl 0,5 M ph 6,8 (6 g Tris dalam aquades, adjust ph dengan HCl 1 N, adjust volume sampai dengan 100 ml dengan aquades). 3. Buat larutan amonium persulfat 10% b/v. 4. Buat larutan 10% SDS (sodium dodesil sulfat). 5. Buat larutan 30% akrilamid/bis akrilamid (campuran 29,2 g akrilamid dan 0,8 g N,N -bis akrilamid dalam 100 ml aquades). 6. Dicampurkan larutan diatas (kecuali amonium persulfat). 7. Ditambahkan amonium persulfat ke separating gel (sesuai dengan prosentase gel yang diinginkan) kemudian aduk dan segera tuangkan ke dalam pencetak gel. Untuk membentuk sisi permukaan yang rata, dapat dituangkan sedikit isoamil alkohol ke atas separating gel dalam pencetak gel. Setelah separating gel memadat, larutan isoamil alkohol kemudian dikeluarkan dari dalam pencetak gel dengan tisu atau dengan membalikkan pencetak gel. Bilas gel yang sudah padat dalam pencetak gel dengan aquades dengan hati-hati, keringkan dengan tisu atau kertas saring.
21 8. Ditambahkan amonium persulfat ke stacking gel (sesuai dengan prosentase yang diinginkan) kemudian aduk dan tuangkan segera ke dalam pencetak gel, di atas lapisan separating gel yang sudah memadat. Kemudian segera Disisipkan sisir pencetak sumur ke dalam larutan stacking gel yang sedang memadat. Jarak bagian dasar sumur dengan lapisan separating gel minimum 0,5-1 cm. Setelah stacking gel tersebut padat, keluarkan sisir pencetak gel dengan hati-hati. 9. Disiapkan buffer electrode; yaitu 9 g Tris, 43,2 g Glisin, dan 3 g SDS dalam 600 ml aquades (larutan stok, bila hendak digunakan, 60 ml dari larutan ini ditambah dengan 240 ml aquades). 10. Gel holder (beserta plat kaca) kemudian dilepaskan dari wadah pencetak gel, dan dipindahkan ke plat elektroforesis berkutub. Kedua gel holder kemudian dikunci sehingga membentuk kotak sumur di bagian tengah plat elektroforesis. Ke dalam sumur plat kemudian dimasukkan buffer electrode hingga gel pada gel holder terendam. d. Running sampel 1. Sampel sebanyak 10 µl yang dicampur dengan 5 µl stock (1,64 gr tris amino metan ditambah HCl sampai 25 ml (ph 6,8) dilarutkan dalam 40 ml gliserol, 20 ml bromophemol blue 0,001% dan 15 ml aquadest) dimasukkan ke dalam sumur yang telah dicetakpada stacking gel. Volume sampel yang masuk berkisar antara 5-10 µl (tergantung kadar protein dari sampel). 2. Setelah semua sampel dimasukkan ke dalam masing-masing sumur, plat elektroforesis dimasukkan dalam chamber electrophoresis yang telah berisi ± 300 ml buffer elektroda.
22 3. Dihubungkan kutub elektroda pada plat elektroforesis dengan power supply. Nyalakan power supply, kemudian atur pada tegangan 200 V voltase tetap. Setelah itu, lakukan elektroforesis selama ± 45-50 menit. 4. Setelah selesai, matikan power supply dan cabut kabel penghubung elektroda dari plat elektroforesis. Keluarkan plat elektroforesis dari dalam chamber, kemudian lepaskan plat kaca beserta holder-nya. 5. Dengan hati-hati, lepaskan plat kaca dari holder-nya. Pengerjaan yang kurang hati-hati dapat menyebabkan gel menjadi pecah. 6. Bagian separating gel dan stacking gel dipisahkan dengan cara dipotong dan bagian stacking gel dibuang. e. Pewarnaan dan pencucian gel 1. Separating gel direndam dalam larutan pewarna, yaitu 0,1% Coomassie blue R250 dalam 40% dan 10% asam asetat teknis. Perendaman dilakukan selama satu jam di atas shaker berkecepatan 10-20 rpm. Limit deteksi untuk pewarna coomisse blue adalah 0.3-1 µg protein, sedangkan untul limit deteksi lebih rendah digunakan pewarna silver stain (2-5 ng). 2. Setelah diwarnai, gel kemudian direndam dalam larutan pencuci, yaitu campuran 40% metanol dan 10% asam asetat. Perendaman dalam larutan pencuci dilakukan selama satu jam di atas shaker yang berkecepatan 10-20 rpm. 3. Untuk mendapatkan hasil yang lebih bersih, gel kemudian direndam kembali dalam larutan pencuci (yang sudah diencerkan dua kali) selama satu malam di atas shaker yang berkecepatan 10-20 rpm.
23 f. Pencetakan hasil elektroforesis 1. Gel yang sudah dicuci direndam dalam akuades selama beberapa menit, lalu diletakkan pada bagian halus pada lapisan kertas buffalo/gloria, kemudian ditutup dengan plastik selafon yang telah dibasahi. Untuk mendapatkan hasil yang transparan, kertas buffalo diganti dengan plastik selafon yang telah dibasahi. 2. Diletakkan gel dalam pengering gel selama 1.5 jam. Selama pengeringan, pastikan tidak terjadinya gelembung dipermukaan gel, dengan meratakan gel menggunakan spons. 3. Setelah 1.5 jam, keluarkan lembaran elektroforegram dari pengering gel. Selanjutnya gel disimpan dalam mangkok kaca tertutup dan difoto untuk dokumentasi. 3.2.5. Peubah yang diamati Peubah yang diamati merupakan protein darah berupa pita-pita (band) yang terbentuk dalam gel poliakrilamid. Pada penelitian ini yang dilakukan pengamatan terhadap lokus protein albumin darah. Penentuan lokus pita protein hasil elektroforesis adalah berdasarkan pada beberapa laporan dari penelitianpenelitian sebelumnya (Astuti 1997, dalam, Arifin 2004; Astuti, 1998). Adanya perbedaan besar muatan dan kecepatan gerak pada suatu medan listrik akan memberikan pita protein yang berbeda pula. Pembacaan alel untuk masing-masing lokus didasarkan pada kecepatan mobilitas relatif terhadap sampel yang dipakai sebagai marka. Alel yang paling dekat dengan anoda dinotasikan sebagai alel A dan alel yang menjauhi anoda dan mendekati katoda berturut-turut di notasikan B, C, D, E dan F. Agar lebih akurat dalam menentukan posisi pita-pita protein yang
24 terdapat dalam hasil elektroforesis maka dilakukan pengukuran jarak migrasi dengan anoda sebagai titik awal dalam pengukuran selanjutnya ke arah pita yang dimaksudkan dalam skala milimeter (mm). Berikut ini adalah ilustrasi penentuan pola pita albumin : Ilustrasi1. Penentuan Gen Pita Protein Albumin Berdasarkan Jarak Migrasinya Ilustrasi 2. Bentuk Genotype Heterezigote Pola Pita Protein Albumin Berdasarkan Jarak Migrasi
25 Ilustrasi 3. Bentuk Genotype Homozigot Pola Pita Protein Albumin Berdasarkan Jarak Migrasi Keterangan : Anoda (+) merupakan kutub positif dari elektroda pada proses elektroforesis vertikal. Katoda (-) merupakan kutub negatif dari elektroda pada proses elektroforesis vertikal. s, x, dan y merupakan jarak migrasi pita yang dihitung dari titik awalnya Anoda sampai permukaan awal pita. s/s mm, x/x mm, y/y mm dan seterusnya merupakan jarak migrasi dari pita/band albumin dengan satuan millimeter (mm). Gen AB, dan Gen BC merupakan gen dan genotip heterezigot. Gen AA, Gen BB, dan Gen CC merupakan gen dan genotip homozigot.