DAFTAR ISI Halaman Sampul Luar... i Sampul Dalam... ii Halaman Prasyarat Gelar... iii Halaman Pengesahan... iv UCAPAN TERIMA KASIH... v ABSTRAK... vi ABSTRACT... vii DAFTAR ISI... viii DAFTAR TABEL... xi DAFTAR GAMBAR... xii DAFTAR LAMPIRAN... xiii DAFTAR SINGKATAN... xiv BAB I PENDAHULUAN... 1 1.1 Latar Belakang Permasalahan... 1 1.2 Rumusan Masalah... 5 1.3 Tujuan Penelitian... 5 1.3.1 Tujuan umum... 5 1.3.2 Tujuan khusus... 5 1.4 Manfaat Penelitian... 6 1.4.1 Manfaat keilmuan... 6 1.4.2 Manfaat praktis... 6 BAB II TINJAUAN PUSTAKA... 7 2.1 Geobacillus sp... 7 2.2 Tongkol Jagung... 8 2.3 Xilan dan Aktivitas Katalitik Enzim Xilanolitik... 9 2.4 Glikosida Hidrolase... 11 2.5 β-xilosidase... 12 2.6 CBM (Carbohydrate Binding Module)... 12 2.7 Kinetika Enzim... 14 BAB III KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESIS PENELITIAN... 21 3.1 Kerangka Konsep Penelitian... 21 3.2 Hipotesis Penelitian... 24 3.3 Skema Kerangka Konseptual Penelitian... 25 BAB IV METODE PENELITIAN... 26 4.1 Tempat dan Waktu Penelitian... 26 4.2 Bahan dan Alat Penelitian... 26 4.2.1 Bahan penelitian... 26 4.2.2 Sampel penelitian... 26 4.2.3 Alat penelitian... 26 4.3 Rancangan Penelitian... 27 4.3.1 Isolasi xilan... 27 viii
4.3.2 Karakterisasi enzim -xilosidase GbtXyl43B yang mengandung CBM... 28 4.4 Prosedur Penelitian... 29 4.4.1 Pembuatan reagensia dan medium... 29 4.4.1.1 Pembuatan media LB padat untuk peremajaan isolat GbtXyl43A dan GbtXyl43B... 29 4.4.1.2 Pembuatan media inokulum untuk tahap inokulasi isolat GbtXyl43A dan GbtXyl 43B... 29 4.4.1.3 Pembuatan media produksi GbtXyl43A... 29 4.4.1.4 Pembuatan media produksi GbtXyl43B... 29 4.4.1.5 Pembuatan larutan NaOH 4 M... 30 4.4.1.6 Pembuatan larutan buffer fosfat 50 mm ph 6... 30 4.4.1.7 Pembuatan larutan CH 3 COOH 4 M... 30 4.4.1.8 Pembuatan larutan HCl 6 N... 30 4.4.1.9 Pembuatan larutan akrilamid/bis-akrilamid... 30 4.4.1.10 Pembuatan larutan Sodium Dodesil Sulfat (SDS) 10 %... 31 4.4.1.11 Pembuatan buffer tris HCl 1M, ph 8,8... 31 4.4.1.12 Pembuatan buffer tris HCl 1M, ph 6,8... 31 4.4.1.13 Pembuatan sample buffer (SDS Reducing Buffer)... 31 4.4.1.14 Pembuatan running buffer... 31 4.4.1.15 Pembuatan larutan APS 10%... 32 4.4.1.16 Pembuatan separating gel 12%... 32 4.4.1.17 Penentuan stacking gel 5%... 32 4.4.1.18 Pembuatan larutan staining... 32 4.4.1.19 Pembuatan larutan destaining... 32 4.4.1.20..Pembuatan larutan bromofenol biru 0,5%... 33 4.4.1.21 Pembuatan larutan oat spelt xylan 1%... 33 4.4.1.22 Pembuatan larutan xilan 1 % (hasil esktraksi dari tongkol jagung)... 33 4.4.1.23 Pembuatan larutan birchwood xylan 1%... 33 4.4.1.24. Pembuatan larutan buffer untuk pemurnian protein GbtXyl43A dan GbtXyl43B... 33 4.4.1.25 Pembuatan larutan Na 2 CO 3 0,4 M... 34 4.4.1.26 Pembuatan reagen asam 3,5-dinitrosalisilat (DNS)... 34 4.4.1.27 Pembuatan reagen Bradford... 34 4.4.1.28 Pembuatan larutan standar albumin (BSA)... 34 4.4.1.29 Pembuatan larutan standar xilosa... 34 4.4.2 Isolasi xilan dari tongkol jagung... 34 4.4.3 Peremajaan isolat... 35 ix
4.4.3.1 Peremajaan isolat E.coli BL21 GbtXyl43A/GbtXyl43B... 35 4.4.3.2 Pembuatan inokulum... 35 4.4.4 Produksi ekstrak kasar enzim rekombinan... 36 4.4.4.1 Produksi ekstrak kasar GbtXyl43A dan GbtXyl32B... 36 4.4.5 Pemurnian protein dan analisa protein... 36 4.4.5.1 Pemurnian protein GbtXy43A dan GbtXyl43B... 36 4.4.5.2 Analisis hasil pemurnian dengan SDS-PAGE... 37 4.4.5.3 Uji aktivitas enzim dengan metode DNS... 38 4.4.5.4 Penentuan kadar protein... 38 4.4.6 Analisis xilan dari tongkol jagung dan produk hidrolisisnya... 39 4.4.7 Penentuan parameter kinetika enzim... 39 BAB V HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN 5.1 Isolasi Xilan dari Tongkol Jagung... 40 5.2 Produksi GbtXyl43A dan GbtXyl43B Rekombinan... 42 5.3 Pemurnian Protein GbtXyl43A dan GbtXyl43B Rekombinan... 44 5.4 Uji Aktivitas GbtXyl43A dan GbtXyl43B terhadap Berbagai Substrat Alami... 48 5.5 Analisis Produk Hidrolisis GbtXyl43B terhadap Substrat Xilan dari Tongkol Jagung... 51 5.6 Analisis Profil Kinetika GtXyl43B Rekombinan... 56 BAB VII KESIMPULAN DAN SARAN 6.1 Kesimpulan... 60 6.2 Saran... 60 DAFTAR PUSTAKA... 61 LAMPIRAN x
DAFTAR TABEL No. Judul Tabel Halaman Tabel 2.1 Kandungan xilan beberapa limbah pertanian... 9 Tabel 5.1 Pemurnian protein GbtXyl43A dan GbtXyl43B rekombinan... 47 Tabel 5.2 Aktivitas GbtXyl43B rekombinan terhadap berbagai substrat alami 51 Tabel 5.3 Luas area standar dan produk hidrolisis substrat oat spelt xylan dan xilan dari tongkol jagung... 55 xi
DAFTAR GAMBAR Nomor Judul Gambar Halaman Gambar 2.1 Tongkol jagung (Zea Mays L)... 7 Gambar 2.2 Struktur xilan dan lokasi penyerangan enzim xilanolitik... 11 Gambar 2.3 Struktur CBM tipe A, B, dan C dari sumber berbeda... 14 Gambar 2.4 Perubahan konsentrasi substrat, enzim dan produk selama waktu reaksi... 15 Gambar 2.5 Penentuan pada berbagai variasi konsentrasi substrat... 16 Gambar 2.6 Plot Lineweaver-Burk... 19 Gambar 3.1 Analisis filogenetik CBM dari GbtXyl43B dan kaitannya dengan urutan asam amino dari famili CBM... 23 Gambar 3.2 Skema kerangka konseptual penelitian... 25 Gambar 4.1 Diagram alir penelitian... 27 Gambar 4.2 Diagram alir penelitian lanjutan... 28 Gambar 5.1. Ilustrasi pengolahan limbah lignoselulosa dalam pemisahan lignin, selulosa dan hemiselulosa... 40 Gambar 5.2 Serbuk halus xilan A dan xilan B... 42 Gambar 5.3 Mekanisme induksi IPTG... 43 Gambar 5.4 Interaksi antara protein His-tag dengan resin Ni-NTA... 45 Gambar 5.5 Struktur senyawa imidazol dan histidin... 45 Gambar 5.6 Elektroforegram protein GbtXyl43A dan GbtXyl43B rekombinan... 47 Gambar 5. 7 Lokasi gen Gbtxyl43B dan gen lainnya dalam ptp510... 48 Gambar 5.8 Model struktur 3 dimensi CBM dari GbtXyl43B... 49 Gambar 5.9 Persamaan reaksi DNS... 50 Gambar 5.10 Kromatogram standar HPLC... 52 Gambar 5.11 Kromatogram HPLC produk hidrolisis oat spelt xylan + xilosa (1%) + arabinosa (1%)... 53 Gambar 5.12 Kromatogram HPLC produk hidrolisis xilan A + xilosa (1%) + arabinosa (1%)... 53 Gambar 5.13 Kromatogram HPLC produk hidrolisis xilan B + xilosa (1%) + arabinosa (1%)... 53 Gambar 5.14 Kromatogram HPLC hasil hidrolisis hemiselulosa B... 54 Gambar 5.15 Kurva hubungan waktu inkubasi pada berbagai konsentrasi substrat dengan konsentrasi xilosa... 57 Gambar 5.16 Kurva Lineweaver Burk untuk kinetika GbtXyl43B... 59 xii
DAFTAR LAMPIRAN No. Judul Lampiran Halaman Lampiran 1. Kurva standar xilosa Lampiran 2. Kurva standar protein Lmapiran 3. Data penentuan aktivitas, dan kadar protein GbtXyl43A dan GbtXyl43B rekombinan Lampiran 4. Penentuan tingkat kemurnian protein GbtXyl43A dan GbtXyl43B rekombinan Lampiran 5. Data aktivitas spesifik GbtXyl43B rekombinan pada berbagai substrat alami Lampiran 6. Kromatogram standar HPLC dan kontrol substrat Lampiran 7. Tabel luas area standar dan produk hidrolisis substrat oat spelt xylan dan xilan dari tongkol jagung Lampiran 8. Grafik hubungan konsentrasi xilosa dengan waktu inkubasi Lampiran 9. Penentuan nilai K M, V max, K cat dan K cat /K M xiii
DAFTAR SINGKATAN APS HPLC DNS CBM CM CBB SDS BSA TEMED IPTG Ni-NTA : Ammonium Persulfat : High Performance Liquid Chromatography : Asam 3,5-dinitrosalisilat : Carbohydrate Binding Module : Catalytic Module : Comassie Brilian Blue : Sodium Dodesil Sulfat : Bovine Serum Albumin : N,N,N N-Tetramethylenetilenediamine : Isopropyl-thio-β-D-thiogalactopyranosida : Ni-Nitriloacetic acid xiv