59 Lampiran 1. Pembuatan Media Natrium Agar Pembuatan Media Agar Natrium Agar (150 ml) 1. Siapkan gelas Erlenmeyer volume 250 ml dan air laut steril 150 ml. 2. Timbang natrium agar sebanyak 4,2 gram 3. Masukkan natrium agar ke dalam erlenmeyer lalu tuang air laut steril. 4. Panaskan media di atas hot plate hingga mendidih dan homogen. 5. Tutup erlenmeyer dengan kapas yang telah dibungkus dengan kassa. 6. Sterilisasi media menggunakan autoclave selama 15 menit pada suhu 121 o C 7. Setelah di autoclave, media didinginkan hingga suhu 45 50 o C 8. Tuangkan media tersebut ke dalam cawan petri yang sudah steril sebanyak 8 10 ml dan biarkan membeku dalam keadaan tertutup. Pemanasan Nutrient Agar Nutrient Agar
60 Lampiran 2. Pembuatan Kultur Bakteri Vibrio harveyi dengan Kepadatan Sel 10 7 CFU/ml 1. Larutan McFarland skala 0,5 dibuat dengan 0,05 ml BaCl 2 1% dan 9,95 ml H 2 SO 4 1% ke dalam tabung reaksi kemudian diukur absorbansinya dengan menggunkan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm. 2. Isolat bakteri uji yang berada dalam cawan petri diambil dengan menggunakan kawat ose sebanyak 2-3 ose kemudian dilarutkan ke dalam 10 ml air laut steril. 3. Bandingkan larutan bakteri yang telah dilakukan dengan larutan McFarland. 4. Sebanyak 0,01 ml larutan bakteri dituang ke dalam media agar. Larutan Vibrio harveyi dan Standar McFarland Penuangan Larutan Bakteri dalam Media Agar
61 Lampiran 3. Koordinat dan Data Parameter Fisik dan Kimia Perairan Lokasi Pengambilan Sampel Koordinat Lokasi Pengambilan Sampel: Area Perlindungan Laut (APL) : S 5 44 0,48 E 106 36 39,8 Perairan Semak Daun (PSD) : S 5 44 04,9 E 106 36 39,6 Perairan Panggang (PP) : S 5 44 00,5 E 106 34 05,7 1. Suhu ( C) Koordinat Ulangan Rata-rata I II III ( C) APL 29 29 29 29 PSD 28 29 29 28 PP 30 29 29 29 2. Salinitas ( ) Habitat Ulangan Rata-rata I II III ( ) APL 28 29 29 28,6 PSD 28 30 30 29,3 PP 26 27 27 26,6 3. Kecerahan (%) Habitat Ulangan I II III Rata-rata (%) APL 100 100 100 100 PSD 100 100 100 100 PP 100 100 100 100 4. Kecepatan arus (m/s) Habitat Ulangan Rata-rata I II III (m/s) APL 0,14 0,17 0,17 0,16 PSD 0,13 0,06 0,07 0,08 PP 0,10 0,10 0,09 0,09
62 Lampiran 4. Ekstraksi Ascidian Didemnum molle Sampel Ascidian Didemnum molle Dikeringkan Ascidian Didemnum molle kering Serbuk Ascidian Didemnum molle Dihaluskan menggunakan blender Disaring Dimaserasi 1x24 jam dengan pelarut Metanol Ampas Filtrat Ekstrak Pasta Diuapkan dengan Rotary Evaporator Diagram Alir Ekstraksi Ascidian Didemnum molle
Lanjutan Lampiran 4 63
64 Lampiran 5. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak pada Saat In Vitro Ascidian Didemnum molle 1 ppm = 1 mg/l = 0,001 g/l Larutan Stok 100.000 ppm dalam 10 ml 100.000 ppm = 0,001 g/l = = 1 g/10 ml 0,001 g x 100.000 1000 ml Pengenceran dilakukan dengan menggunakan Jembatan Stok V 1 = Volum larutan stok yang dibutuhkan V 2 = Volum pengenceran yang akan dibuat M 1 = Konsentrasi larutan stok M 2 = Konsentrasi pengenceran yang akan dibuat Konsentrasi 10.000 ppm V 1 x M 1 = V 2 x M 2 V 1 x 100.000 ppm = 5 ml x 10.000 ppm V 1 = 50000/100000 = 0,5 ml 0,5 ml dari larutan stok ditambah dengan 4,5 ml akuades Konsentrasi 1.000 ppm V 1 x M 1 = V 2 x M 2 V 1 x 100.000 ppm = 5 ml x 1.000 ppm V 1 = 5000/100000 = 0,05 ml 0,05 ml dari larutan stok ditambah dengan 4,95 ml akuades
65 Lanjutan Lampiran 5. Konsentrasi 100 ppm V 1 x M 1 =V 2 x M 2 V 1 x 100.000 ppm = 5 ml x 100 ppm V 1 = 500/100000 V 1 = 0,005 ml 0,005 ml dari larutan stok ditambah dengan 4,995 ml akuades Konsentrasi 10 ppm V 1 x M 1 = V 2 x M 2 V 1 x 100.000 ppm = 5 ml x 10 ppm V 1 = 500/100000 = 0,0005 ml 0,0005 ml dari larutan stok ditambah dengan 4,9995 ml akuades Larutan Ekstrak Ascidian Didemnum molle Berdasarkan Perlakuan yang digunakan pada Uji Aktivitas Antibakteri
Lampiran 6. Diameter Zona Hambat Ekstrak Didemnum molle Terhadap Bakteri Vibrio harveyi 66
67 Lampiran 7. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Ascidian Didemnum molle pada Uji LC 50 Konsentrasi larutan stok yang digunakan adalah 10.000 ppm dalam volum 500 ml 10.000 ppm = 10 g/l = 10 g 1 L 500 ml 1 L 1000 = 5 Untuk mendapatkan konsentrasi 10.000 ppm dilarutkan 5 gram ekstrak dalam 500 ml akuades. Pengenceran dilakukan dengan menggunakan Jembatan Stok V 1 = Volum larutan stok yang dibutuhkan V 2 = Volum pengenceran yang akan dibuat M 1 = Konsentrasi larutan stok M 2 = Konsentrasi pengenceran yang akan dibuat Konsentrasi 1000 ppm V 1 x M 1 = V 2 x M 2 V 1 x 10.000 ppm = 500 ml x 1.000 ppm V 1 = 500.000/10.000 = 50 ml 50 ml dari larutan stok ditambah dengan 450 ml akuades Konsentrasi 100 ppm V 1 x M 1 = V 2 x M 2 V 1 x 10.000 ppm = 500 ml x 100 ppm V 1 = 50.000/10.000 = 5 ml 5 ml dari larutan stok ditambah dengan 495 ml akuades
68 Lanjutan Lampiran 7 Konsentrasi 10 ppm V 1 x M 1 = V 2 x M 2 V 1 x 10.000 ppm = 500 ml x 10 ppm V 1 = 5.000/10.000 = 0,5 ml 0,5 ml dari larutan stok ditambah dengan 499,5 ml akuades Larutan Ekstrak Ascidian Didemnum molle Berdasarkan Perlakuan yang Digunakan pada Uji LC 50
69 Lampiran 8. Data Pengamatan Mortalitas Udang Windu pada Uji LC 50 Selama 48 jam Lama Perendaman Jumlah Udang yang Mati pada Konsentrasi (ppm) 0 10 100 1000 10000 I II I II I II I II I II 15 menit - - - - - - - - - - 30 menit - - - - - - - - 2 2 1 jam - - - - - - 1 1 - - 2 jam - - - - - - 1 1-1 4 jam - - - - - - - 1 1 1 6 jam - - - - - - - 3 1 2 8 jam - - - - - - - - 2-16 jam - - - - - - 2 - - - 24 jam - - - - - 1 - - - - 48 jam - - - - - - - - - - Total 0 0 0 0 0 1 4 6 6 6
70 Lampiran 9. Hasil Perhitungan LC 50 dengan Menggunakan EPA Probit LC 50 Didemnum molle EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 Conc. Number Exposed Number Responding Observation Proportion Proportion Responding Predicted Proportion Responding Adjused for Responding Controls 10 12 0 0,0000 0,0000 0,0001 100 12 1 0,0833 0,0833 0,0822 1000 12 10 0,8333 0,8333 0,8352 10000 12 12 1,0000 1,0000 0,9996 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 0.007 Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 5.991 Mu = 2.587787 Sigma = 0.422818 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits --------------------------------------------------------------------- Intercept -1.120327 1.729846 ( -4.510825, 2.270170) Slope 2.365082 0.652672 ( 1.085844, 3.644320) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Point Exposure 95% Confidence Limits Conc. Lower Uper LC/EC 1.00 40.196 2.304 104.992 LC/EC 5.00 78.036 9.253 170.563 LC/EC 10.00 111.148 19.080 224.825 LC/EC 15.00 141.116 30.726 274.165 LC/EC 50.00 387.067 180.124 810.578 LC/EC 85.00 1061.685 551.051 4592.272 LC/EC 90.00 1347.940 674.208 7370.954 LC/EC 95.00 1919.908 891.534 15151.202 LC/EC 99.00 3727.254 1452.826 60656.582
71 Lampiran 10. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Ascidian Didemnum molle pada Uji Tantang 1 ppm = 0,001 g/l Ekstrak dibuat dalam 1 liter air laut. Perlakuan B (96,75 ppm) 96,75 ppm = 0,001 g/l = 0,001 x 96,75 = 0,09675 g/l Perlakuan C (193,5 ppm) 193,5 ppm = 0,001 g/l = 0,001 x 193,5 = 0,1935 g/l Perlakuan D (96,75 ppm) 290,25 ppm = 0,001 g/l = 0,001 x 290,25 = 0,29025 g/l Perlakuan E (387 ppm) 387 ppm = 0,001 g/l = 0,001 x 387 = 0,387 g/l Larutan Ekstrak Ascidian Didemnum molle Berdasarkan Perlakuan yang Digunakan pada Uji Tantang
72 Lampiran 11. Dokumentasi Penelitian Salah Satu Lokasi Pengambilan Sampel Pengukuran Diameter Zona Hambat Menggunakan Jangka Sorong Bakteri Vibrio harveyi yang Digunakan dalam Penelitian
73 Lanjutan Lampiran 11 Media Pemeliharaan Selama Penelitian Benih Udang Windu yang Mati