10 III. METODE PENELITIAN A. Tempat dan Waktu Penelitian dilaksanakan pada bulan September 2015 sampai Februari 2016. Isolasi dan visualisasi RNA Colletrotichum dilaksanakan di Laboratorium Hama Penyakit Tanaman, Fakultas Pertanian, Universitas Sebelas Maret Surakarta, sedangkan pengamatan menggunakan UV Transilluminator dilaksanakan di Laboratorium Biologi dan Bioteknologi Tanah, Fakultas Pertanian, Universitas Sebelas Maret Surakarta. B. Bahan dan Alat Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah 36 biakan murni Colletotrichum yang diperoleh dari penelitian Rahmawati (2016). Isolat-isolat tersebut diisolasi dari buah cabai, dari wilayah Karanganyar dan Boyolali. Berdasarkan morfologi spora, ke 36 isolat tersebut terkelompok menjadi 2. Kelompok 1 adalah C. gloesporioides dengan karakter spora berbentuk cylindrical, dan kelompok 2 adalah C. acutatum dengan karakter spora berbentuk fusiform. Bedasarkan hasil uji virulensi, 7 dari 36 isolat tergolong hipovirulen yaitu isolat B1.8, B1.9, B2.3, K1.1, K1.5, dan K1.6. Bahan yang digunakan dalam persiapan sampel adalah medium Potato Dextrose Broth (PDB) untuk pembiakan murni Colletotrichum. Bahan-bahan yang digunakan dalam analisis RNA total antara lain TRIzol, kloroform, isopropanol (Isopropyl Alcohol), etanol 75%, loading dye, Ethidium Bromide, aquadest steril dan TBE. Marker yan digunakan yaitu 1-kb DNA Ladder (vivantis). Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah kamera digital, cawan petri, tabung erlenmeyer, Hot Plate Stirer, botol steril, bunsen, pisau silet, mortal dan pastle, timbangan analitik, tabung vorex, mikropipet, microwave, tabung, sentrifuge, vortex, alat elektroforesis, UV Transilluminator, Laminar Air Flow (LAF), autoclave, gelas ukur, kertas label, kertas saring, alumunium foil, kertas film, tabung Eppendorf 1,5 ml, bak elektroforesis. 10
11 C. Perancangan Penelitian Perancangan penelitian ini dibagi mejadi 4 tahap atara lain yaitu: 1. Persiapan sampel Colletotrichum untuk isolasi RNA total meliputi pembiakan miselium Colletotrichum. 2. Ekstraksi RNA total dilakukan dengan mengikuti prosedur Morris (1979) dan Hillman et al. (1990). 3. Visualisasi RNA melalui elektroforesis meliputi pembuatan gel agarose dan uji elektroforesis. 4. Analisis data meliputi identifikasi profil pita RNA melalui UV Transilluminator dan analisis dendrogram. D. Pelaksanaan penelitian 1. Pembiakan Colletotrichum untuk isolasi RNA Isolasi RNA diawali dengan persiapan kultur Colletotrichum yang berasal dari medium PDA yang telah dimiliki. Terdapat 36 isolat Colletotrichum yang berasal dari berbagai jenis cabai dengan berbagai tingkat virulensi. Sebanyak 36 isolat tersebut disubkulturkan pada medium PDB (Potato Dextrose Broth). Bahan yang digunakan dalam membuat medium PDB sama dengan bahan medium PDA tetapi tanpa pembahan agar. Kentang ditimbang sebanyak 150 gr dan dextrosa sebanyak 10 gr. Kentang dikupas dan dipotong kecil-kecil, dicuci sampai bersih. Kentang dimasak sampai mendidih, selama 15 menit, kemudian disaring, dan ekstraknya dicampur dengan dextrosa, lalu dipanaskan kembali sampai zat tersebut larut sempurna. Dimasukkan dalam botol-botol steril sebanyak 20 ml, kemudian ditutup menggunakan alumunium foil. Disterilkan dalam autoclave pada suhu 121 0 C selama 15 menit (Atlas 1997, Syahrial et al. 2014). Subkultur dari medium PDA ke medium PDB dilakukan dengan membuat plug-plug. Plug tersebut kemudian dimasukkan pada botol-botol yang berisi medium PDB. Botol ditutup kembali menggunakan alumunium foil kemudian diberi label. Botol-botol tersebut diinkubasi selama 10 hari pada suhu ruang. Diperlukan
12 ketrampilan dalam melakukan subkultur isolat, agar subkultur yang dilakukan tidak mengalami kontaminasi. Kultur Colletotrichum yang telah tersedia dimasukkan ke dalam medium PDB yang telah dingin dan diinkubasi selama 7-10 hari. Miselium yang telah tumbuh dipisahkan dari medium PDB dengan cara disaring dengan kertas saring. Jamur siap untuk proses isolasi RNA. 2. Isolasi RNA total Isolasi RNA total merupakan suatu metode yang dilakukan untuk pemurnian RNA tanpa adanya campuran lain dari bagian sel. Diperlukan ketrampilan dalam melakukan setiap tahap molekuler. Metode ekstraksi RNA pada penelitian ini dilakukan dengan menggunakan kit RNA (TRIzol). TRIzol merupakan reagen yang efektif untuk digunakan dalam metode isolasi RNA total (Chomczynski et al. 1987, Sallau et al. 2013), hal tersebut dibuktikan dari beberapa penelitian yang menyatakan bahwa penggunaan TRIzol mampu memberikan hasil yang lebih efektif, baik dalam ukuran maupun kemurnian materi genetik yang diisolasi (Zang et al. 2009, Xiao et al. 2015). Isolasi RNA total dilakukan dengan mengikuti prosedur Morris (1979) dan Hillman et al. (1990). Tahap pertama yang dilakukan adalah penimbangan miselium Colletotrichum yang sebelumnya telah disimpan dalam lemari pendingin pada suhu - 20 0 C, miselium ditimbang seberat 75-100 gr. Ekstraksi dilakukan dengan cara menggerus miselium Colletotrichum menggunakan pestle diatas mortar yang telah disimpan dalam lemari pendingin. Penggerusan bertujuan untuk menghancurkan jaringan miselium secara mekanik sehingga mempermudah langkah selanjutnya untuk mengisolasi RNA yang terdapat di dalam sel, serta dilakukan dalam kondisi dingin agar RNA tidak rusak. Ditambahkan TRIzol diatas mortar dan digerus perlahan bersama miselium yang telah lembut sampai merata. TRIzol berungsi untuk melisikan dinding sel (Sallau et al. 2013). Bubur miselium yang telah tercampur dengan TRIzol kemudian
13 dimasukkan ke dalam tabung eppendorf, kemudian diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang. Langkah selanjutnya yaitu disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 x g selama 10 menit, kemudian supernatant diambil dan dimasukkan dalam tabung eppendorf yang baru. Ditambahkan kloroform sebanyak 0,2 ml, kemudian di vortex selama 15 detik. Kloroform dingin yang berfungsi untuk menghilangkan sisa dinding sel serta mampu mendenaturasi protein dan polisakarida (Aristya 2009). Langkah selanjutnya yaitu diinkubasi selama 3 menit pada suhu ruang, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 x g selama 15 menit. Supernatan diambil dan dimasukkan dalam tabung eppendorf yang baru. Ditambahkan isopropanol dingin sebanyak 0,5 ml kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 x g selama 15 menit, setelah itu supernatant dibuang. Penambahan isopropanol dingin bertujuan untuk menjaga volume asam nukleat yang akan diendapkan menjadi minimum. Isopropanol berfungsi untuk presipitasi RNA melalui mekanisme dehidrasi yaitu menarik air sehingga menyebabkan terbentuknya endapan RNA (Aristya 2009). Pellet kemudian dicuci dengan 1 ml etanol 75% kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12.000 x g selama 10 menit, setelah itu etanol dibuang. Pemberian etanol 75 % pada suhu rendah akan menurunkan aktivitas molekul air sehingga pengendapan RNA berlangsung lebih efektif (Aristya 2009). Pencucian menggunakan etanol dapat diulang sekali lagi apabila pellet yang terbentuk cukup tebal. Langkah terakhir yaitu tabung dikeringanginkan sehingga sisa etanol kering. Hal ini bertujuan agar RNA tidak rusak karena terkena etanol. Pellet yang telah kering kemudian ditambahkan 50 μl aquadest steril, dan dihomogenkan. Hasil ekstraksi RNA disimpan pada suhu -20 0 C supaya RNA stabil dan tidak rusak. 3. Visualisasi RNA RNA total yang telah berhasil diisolasi kemudian divisualisasikan. Tahap pertama sebelum dilakukan visualisasi RNA adalah membuat gel agarose. Prosedur
14 yang pertama dalam pembuatan gel adalah mengukur volume TAE 1x sebanyak 200 ml, kemudian dituang ke dalam tabung erlenmeyer. Agarose ditimbang sesuai dengan konsentrasi yang akan digunakan. Pada penelitian ini konsentrasi agarose yang digunakan adalah 0,7% yaitu sebanyak 1,4 gr untuk 200 ml TAE. Agarose dituangkan ke dalam tabung erlenmeyer yang berisi TAE, kemudian dipanaskan dengan microwave selama 1 menit, selanjutnya digojog perlahan. Diulang 3-4 kali hingga agarose larut dan homogen. Pada pemanasan terakhir larutan digojog dengan hati-hati agar tidak terbentuk gelembung udara pada larutan, kemudian larutan dituang pada cetakan agarose, dan didiamkan hingga gel mengeras. Buffer TBE 1x dituang ke dalam tangki elektroforesis hingga setengahnya. Gel diletakkan ke dalam tangki dengan posisi sumuran pada kutub negatif tengki, buffer TBE 1x ditambahkan sehingga gel tenggelam dalam buffer. Loading dye diambil dengan volume sesuai sampel RNA yang akan dielektroforesis, yaitu 1 μl loading dye untuk 5 μl RNA, kemudian dicampur dengan sampel RNA. Pencampuran RNA dengan menaruh RNA di loading dye kemudian disedot kembali dengan mikropipet. Campuran loading dye dan RNA dimasukkan ke dalam sumuran gel dengan hati-hati, agar tepat pada lubang sumuran sampel untuk menghindari kontaminasi sampel yang satu dengan yang lainya. RNA marker dimasukkan pada sumuran tepi kanan atau kiri gel. Tangki elektroforesis ditutup, kemudian alat disambungkan ke listrik dan alat disetting dengan voltase sebesar 50V. Proses running berlangsung selama 30 menit. Pada penelitian ini gel agarose diambil kemudian direndam ke dalam etidium bromide, selanjutnya agarose siap diamati menggunakan UV Transilluminator. Profil pita yang terlihat didokumentasikan menggunakan kamera digital. 4. Analisis Data Analisis data meliputi identifikasi profil pita RNA total dan dilakukan analisis dendrogram. Data hasil penelitian berupa data kualitatif dari visualisasi RNA yang dianalisis secara deskriptif. Analisis kualitatif ditunjukkan dengan ada tidaknya pita
15 RNA yang terlihat. Hasil yang didapat akan ditunjukkan dengan perbandingan hasil tiap-tiap isolat melalui analisis dendrogram. E. Variabel Pengamatan 1. Visualisasi RNA Visualisasi RNA telah dilakukan, selanjutnya profil pita RNA dari masingmasing sampel diidentifikasi untuk dilakukan analisis data. 2. Analisis Data Profil pita RNA dari masing-masing sampel diamati untuk menentukan adanya perbedaan isolat. Setiap posisi pita RNA diubah ke dalam bentuk data biner dengan memberi nilai 1 jika ada pita dan 0 jika tidak ada pita. Data biner ini selanjutnya diolah dengan menggunakan program komputer Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System (NTSys) versi 2.02. Berdasarkan nilai kesamaan genetika tersebut dilakukan analisis pengelompokan (cluster analysis) menggunakan metode Unweighted Pair Group Method Analisys (UPGMA). Hasil analisis pengelompokan tersebut berupa dendrogram kesamaan genetika yang menunjukkan hubungan kesamaan antar isolat.