BAB II REKAYASA KULTUR JARINGAN PADA JAMUR TIRAM 2.1. Pembuatan Bibit PDA /F0 Jamur Tiram Pembuatan bibit PDA yang dimaksud di sini adalah pembiakan kultur murni atau biakan murni dengan menggunakan teknik kultur jaringan. Yang dimaksud dengan kultur jaringan adalah mengambil bagian dari jamur untuk ditumbuhkan pada media PDA agar dapat berkembang dan memperbanyak diri. Sel-sel pada spora jamur tiram diharapkan dapat berkembang menjadi individu baru secara sempurna pada media yang sesuai dalam hal ini media PDA. Teknik kultur jaringan dengan media PDA (Potato Dextrosa Agar) ini sangat penting untuk dikuasai oleh pebudidaya jamur karena dari sinilah semua proses multiplikasi atau pengembangan jamur tiram berlangsung. 2.2. Sekilas Tentang PDA PDA adalah singkatan dari Potato Dextrosa Agar merupakan campuran media dari larutan 200 gram kentang ditambah 20gram Dextrosa dan 20 gram bubuk agar-agar. Dalam media agar-agar PDA inilah dikembangkan biakan murni dari spora jamur tiram. Larutan PDA dalam botol sebelum di inokulasikan spora jamur 8

Pada media PDA ini di inokulasikan / dibibitkan biakan yang diambil dari bagian tubuh jamur tiram Inokulasi biakan murni ke dalam media PDA Lalu dari biakan murni yang diambil dari tubuh jamur tersebut bereaksi pada media PDA dengan perkembangan sel-sel spora jamur. Reaksi perkembangan awal spora jamur pada media PDA Selanjutnya jika biakan murni dari indukan jamur tersebut dapat berkembang dengan baik, maka terjadilah duplikasi-duplikasi sel-sel spora yang sangat banyak membentuk jaringan hifa miselium yang berkembang dengan baik pada media PDA tersebut. 9

PDA yang berkualitas akan tampak secara visual berisikan jaringan hifa miselium yang tampak padat dan bergelombang menyerupai rangkaian ombak. Visual jaringan hifa miselium pada media PDA yang terbentuk Dari perkembangan sel-sel spora jamur tiram 2.3. Bahan Yang Diperlukan Dalam Pembuatan PDA Untuk membuat media PDA, bahan yang diperlukan sangat sederhana dan mudah didapat, bahan-bahan tersebut adalah: 1. Kentang sejumlah 200 gram Belilah kentang dengan kualitas baik, keadaan mulus dan tidak terlalu banyak bintiknya. Kentang juga tidak boleh dalam keadaan terlalu tua dan sudah lunak. Sebaiknya kentang masih segar dan dalam keadaan masih cukup keras. 10

2. Dextrose sejumlah 20 gram Dextrosa ini adalah sejenis glukosa atau gula. Jika kesulitan untuk mendapatkannya, bisa diganti dengan gula putih biasa. Biasanya dextrosa bisa dibeli di apotek, toko-toko laboratorium, atau di toko alat-alat kedokteran. 3. Agar-agar sejumlah 20 gram Agar-agar yang digunakan bisa agar-agar batang atau agar-agar bubuk. Jika kita menggunakan agar-agar bubuk, pilihlah yang kualitas baik dan yang tidak berwarna atau bening. Dalam satu sachet biasanya memiliki berat bersih 7gram, jadi jika diperlukan 20 gram, maka diperlukan 3 sachet/bungkus agar-agar. 4. Air steril / air destilasi sejumlah 1 liter Untuk memudahkan, pilih saja air mineral dalam kemasan dengan merk yang sudah terkenal baik dari segi kualitas. 11

5. Jamur indukan Jamur untuk indukan yang dipilih hendaknya: Kondisi sehat Tidak terlalu tua dan tidak pula terlalu muda/kecil Tidak terlalu basah Memiliki gagang/tangkai yang besar dan keras Tidak terdapat kontaminasi baik hama maupun kontaminasi bakteri di dalamnya. Khusus mengenai memilih jamur indukan nanti akan dibahas tersendiri karena memang memerlukan tips dan trik khusus dari berbagai pengalaman yang ada memilih indukan yang diharapkan terdapat banyak spora berkualitas di dalamnya. 12

2.4. Peralatan Yang Diperlukan Untuk membuat PDA yang berkualitas, diperlukan peralatan yang memadai. Peralatan yang dimaksud antara lain adalah : 1. Laminar air flow atau bisa juga dengan kotak pembibitan sederhana Fungsi dari laminar air flow ini adalah untuk menjamin proses inokulasi atau pembibitan jamur dalam kondisi steril. Contoh dari laminar air flow adalah sebagai berikut: Ini adalah laminar air flow standar laboratorium untuk pembibitan kultur jaringan. Harganya pun tentu mahal sekali dan kebanyakan pebudidaya jamur tiram tentu akan berfikir ulang untuk membelinya. Nah, ternyata walaupun penting, laminar air flow ini bisa diganti dengan kotak pembibitan sederhana. Kotak pembibitan sederhana Pada kotak pembibitan sederhana ini dilapisi melamin agar selalu dalam keadaan bersih. Pada pencahayaan terdapat dua jenis lampu yaitu lampu neon biasa untuk penerangan dan lampu ultraviolet/uv. Lampu UV ini bersifat optional. Boleh diberikan jika memang diperlukan. 13

Contoh lain dari kotak pembibitan sederhana Kotak pembibitan sederhana ini dibuat dari kayu dengan lapisan melamin di dalamnya. Pada bagian atas diberi kaca tebal dengan lubang untuk pengeluaran panas dari api bunzen. Kotak ini hendaknya dibuat benarbenar rapat dan tertutup. Ini untuk memastikan pada saat inokulasi pemberian bibit semua dalam keadaan steril. Untuk kaca bagian atas bisa menggunakan kaca tebal 13mm. 2. Autoclav atau tungku bertekanan Autoclav atau tungku bertekanan ini diperlukan dalam proses sterilisasi media PDA. Dalam pembuatannya, memang diperlukan sterilisasi pada suhu 121 o C pada tekanan kurang lebih 1,5Bar. Jika tidak memiliki autoclav, fungsi alat ini juga bisa digantikan dengan panci presto bertekanan. 14

3. Botol untuk tempat media PDA Botol yang kami pilih di sini biasanya botol yang berbentuk pipih bekas madu atau bekas maaf minuman keras seperti wiski. Mengapa botol berbentuk pipih ini dipilih? Karena untuk memudahkan pengembangan media PDA nantinya dan juga memudahkan pada saat diturunkan ke bibit induk F1. 4. Peralatan tambahan pinset, cutter, pemotong stainless, kertas koran, karet, bunzen atau lampu api dan alkohol 96%. Peralatan tambahan ini harus bersifat steril dan bersih. Oleh karena itu hendaknya berasal dari bahan stainless steel. 15

5. Peralatan tambahan berupa kapas steril, gelas ukur, saringan, kompor, panci, dan sebagainya yang diperlukan pada proses memasak. 2.5. Tata cara Rekayasa Pembibitan indukan murni PDA Langkah 1 persiapan Setelah semua bahan dan peralatan disiapkan, pada awalnya cucilah hingga bersih botol untuk tempat media PDA, setelah itu sterilkan botol, pengaduk, gelas ukur dan semua peralatan penunjang dengan cara merebus pada air 100 o C, atau masukkan ke dalam autoclav lalu sterilkan pada tekanan 1,5Bar selama 15 menit. Penyeterilan botol, pengaduk, gelas ukur dan semua peralatan penunjang ini dilakukan untuk lebih memperbesar tingkat keberhasilan dalam pembuatan PDA nantinya. 16

Langkah ke-2 menyiapkan dan merebus kentang Siapkan kentang sejumlah 200 gram lalu potonglah kecil-kecil berbentuk kubus dengan ukuran kurang lebih 1cm x 1cm. Langkah ke-3 rebuslah kentang dalam 1 liter air steril Merebus kentang ini dilakukan selama kurang lebih 30-40 menit. Kondisi yang menurut pengalaman adalah hingga jumlah air 1 liter tadi menjadi kurang lebih 0,3liter -0,4liter. 17

Langkah ke-4 Saringlah air rebusan kentang tadi Saringlah air kaldu dari rebusan kentang tadi. Jika jumlah hasil air yang ada di kisaran 300ml 400 ml, maka waktu perebusan sudah pas. Langkah ke-5 Tambahkan air steril sehingga jumlahnya menjadi 1 liter Air kaldu kentang tadi diencerkan kembali menggunakan air steril sehingga jumlahnya menjadi 1 liter kembali. Ingat, wadah atau tempat untuk pengenceran pun harus bersih dan steril pula. 18

Langkah ke-6 menambahkan dextrosa Tambahkan 20 gram dextrosa ke dalam larutan dan aduk hingga benar-benar merata Langkah ke-7 menambahkan agar-agar bubuk Tambahkan agar-agar bubuk sejumlah 20 gram atau tiga bungkus lalu aduk hingga benar-benar merata 19

Langkah ke-8 masukkan ke dalam botol Setelah merata, masukkan larutan PDA ke dalam botol sejumlah kurang lebih 1cm. Untuk botol ex wiski kira-kira 30-40ml, utk botol UC1000 kira-kira 20ml Langkah ke-9 tutup dengan kapas dan plastik Tutup botol dengan kapas steril, lalu diberi plastik tebal 0.05m dan ikat menggunakan karet. 20

Langkah ke-10 sterilkan larutan PDA Lakukan langkah sterilisasi larutan PDA menggunakan autoclav atau panci presto bertekanan. Langkah ke-11 Sterilisasi Jika menggunakan autoclav, setting autoclav pada tekanan 1,5Bar lalu lakukan sterilisasi selama kurang lebih 15-20menit. Jika menggunakan panci presto, kurang lebih 30-40menit. 21

Langkah ke-12 keluarkan dan dinginkan larutan PDA Setelah dilakukan sterilisasi, letakkan botol dalam keadaan tidur/miring hampir 180 o Tujuannya adalah agar larutan PDA bisa menyebar di permukaan dasar botol, biarkan larutan PDA ini sampai agar-agarnya mengeras sempurna. Proses inokulasi bisa dilakukan jika suhu media PDA sudah mencapai kurang lebih 37 o C. Untuk lama pendinginan kurang lebih 5 jam. Untuk meningkatkan prosentase keberhasilan, hendaknya proses inokulasi indukan langsung dilakukan begitu agaragar PDA sudah mulai mendingin. Waktu maksimalnya kurang lebih 12 jam. Perletakan PDA hendaknya di dalam kotak pembibitan sederhana atau di dalam laminar air flow. Jika menggunakan kotak pembibitan sederhana, sebelum memasukkan media PDA di dalamnya, semprotlah terlebih dahulu menggunakan alkohol 96% untuk memastikan sterilnya ruangan kotak pembibitan. Untuk lebih jelasnya seluruh proses pembuatan larutan PDA ini dapat dilihat pada dokumentasi foto dan video pada CD di folder pembuatan media PDA. 22

Langkah ke-13 memasukkan indukan jamur ke media PDA (Inokulasi) Langkah inilah yang paling penting dalam proses pembuatan bibit PDA. Di sini yang paling penting adalah pemilihan indukan yang akan diinokulasikan pada media. Selain itu selama proses, semua harus dalam keadaan steril dan bersih. Langkah ke-13 ini dibagi menjadi beberapa langkah penting yaitu: Persiapan Sebelum tangan dimasukkan ke dalam kotak pembibitan, tangan harus disterilkan dengan menyemprotkan alkohol 96% secara merata. Lalu kemudian mensterilkan cutter dan pinset dengan mencelupkan ke dalam gelas berisi alkohol dan dipanaskan terlebih dahulu menggunakan api bunzen. Sterilkan pinset dengan cara mencelupkan di gelas berisi alkohol. Lalu pinset dipanaskan sejenak pada api bunzen secara merata. Celupkan cutter yang digunakan Untuk menyayat jamur ke dalam Gelas berisi alkohol, selanjutnya Seperti cutter juga dipanaskan Sejenak menggunakan api bunzen 23

Pengambilan indukan jamur Cara pengambilan adalah dengan menyayat indukan jamur tersebut mengunakan cutter lalu pada satu sisi jamur dibagi menjadi beberapa bagian. Bagian tersebut diambil menggunakan pinset. 24

Meletakkan indukan ke dalam media PDA Segera ambil media PDA, buka tutup kapasnya, lalu letakkan sejenak di depan api i bunzen, selanjutnya masukkan secara perlahan indukan tadi ke dalam media PDA. Jangan sampai indukan yang diambil tadi menyentuh apapun termasuk mulut botol, lalu segera tutup kembali kapasnya dan tutup dengan koran dan karet. 25

Setelah seluruh proses inokulasi selesai, pindahkan bibit PDA tersebut ke lemari atau tempat yang bersih dan steril. Sebelum diletakkan bibit PDA, hendaknya tempat tersebut disterilkan dengan menyemprotkan alkohol. Catat selalu tanggal inokulasi untuk menandai umur dari bibit PDA yang dibuat tersebut. Proses foto dan video penyayatan/mengiris jamur pada teknik pengambilan spora indukan jamur yang lebih jelas terdapat pada CD dokumentasi pada folder cara mengambil indukan 26

2.6. Tips dan Hal Yang Perlu Diperhatikan Pada pembuatan bibit PDA, ada beberapa hal penting yang perlu diperhatikan agar didapatkan prosentase keberhasilan yang tinggi. Hal tersebut antara lain adalah : Pada proses persiapan peralatan, semua peralalatan, botol, sendok, gelas ukur, dalam keadaan steril caranya dengan merebus semua peralatan tersebut dalam air mendidih. Jangan meremehkan proses ini karena sayang sekali jika kegagalan hanya dikarenakan media botol yang digunakan tidak steril. Pemilihan kentang dan agar-agar bubuk harus yang baik dan berkualitas. Waktu/durasi memasak kentang kurang lebih 30 menit atau 40 menit.jika memasak kurang lama, maka larutan kaldu kentang yang dihasilkan kurang nutrisi, jika teralu lama, maka larutan kaldu kentang yang didapat terlalu sedikit. Indikator yang pas, biasanya dalam memasak kentang sampai larutan yang dihasilkan kurang lebih berjumlah 300ml sampai 400ml dari 1000ml (1liter) air pada awalnya. Pengisian air di botol hendaknya jangan terlalu banyak. Kurang lebih ketinggian air di botol pada saat tegak adalah 1cm. Setelah dilakukan proses sterilisasi nantinya, posisi botol akan diletakkan hampir 180 o atau tidur. Tujuannya agar cairan media PDA menyebar di botol. Menurut pengalaman, ketebalan yang pas adalah sekitar 2mm 3mm. Jumlah yang tidak terlalu tebal ini juga mengurangi tingkat kegagalan nantinya. 27

Jarak cairan PDA ke mulut botol kurang lebih 1-2cm, jangan sampai cairan PDA terlalu dekat atau malah menyentuh mulut botol. Jarak 2cm media PDA ke mulut botol untuk menghindari masuknya Kontaminasi dari luar kondisi perkembangan miselia adalah semi unaerob, hanya perlu oksigen masuk sedikit jika terlalu banyak, memicu kegagalan Dalam proses inoklasi indukan murni, diperlukan kompor api kecil yang disebut bunzen. Pada umumnya bunzen ini menggunakan bahan bakar spirtus bakar, namun pada proses pembuatan PDA, gunakan bahan bakar alkohol 96%. Karena api yang dihasilkan bersih dan sedikit asap. 28

Gunakan selalu pemotong dan pinset yang baru, steril, dan kalau bisa terbuat dari bahan stainless steel. Pinset untuk mengambil jamur, pemotong stainless untuk mengambil PDA Dan cutter untuk mengiris jamur indukan Koran yang digunakan sebagai penutup nantinya juga harus disterilkan dengan memasukkan ke dalam plastik lalu diikutkan dalam proses sterilisasi pada autoclav. Sebelum digunakan pun, ada baiknya koran disterilkan lagi dengan disemprot alkohol. 29

Memilih indukan jamur untk inokulasi seperti yang telah dijelaskan sebelumnya harus memiliki sifat : tidak terlalu muda atau tua, tidak terlalu basah, memiliki batang yang keras dan bebas kontaminasi. Jamur indukan yang dipilih diharapkan memiliki spora jamur yang banyak dan berkualitas. Biasanya jamur yang seperti ini memiliki ciri-ciri sebagai berikut : Merupakan jamur dengan tangkai tunggal atau ganda, itupun dipilih pada jamur yang memiliki gagang besar dan keras. Jika diambil dari jamur yang berkoloni banyak atau menggerombol, biasanya tangkai/gagangnya kecil sehingga kurang bisa digunakan. Jamur untuk indukan biasanya diambil dari jamur yang memiliki gagang tunggal atau ganda, karena di sini gagang/tangkainya biasanya besar dan keras Jamur yang berkoloni banyak, biasanya memiliki Gagang/tangkai kecil (kurang bagus untuk dijadikan indukan PDA) 30

Umur jamur yang diambil pada kisaran 2-3hari dari munculnya pinhead. Pada umur itu jamur dalam posisi pertumbuhan, biasanya spora yang terdapat di dalamnya masih banyak karena proses tersebut. Jika sudah terlalu tua, jaringan menyerupai gabus yang diambil dari dalamnya sudah pecah dan basah membentuk daun jamur sehingga tidak bisa lagi untuk digunakan. Jamur memiliki gagang yang besar dan keras. Pengambilan tubuh jamur yang diharapkan memiliki kandungan spora yang banyak dan berkualitas biasanya terdapat pada daerah antara leher dan batang. Jika gagangnnya besar, maka area ini diharapkan banyak mengandung spora. Jamur yang digunakan sebagai indukan hendaknya baru dipetik dan langsung digunakan untuk proses inokulasi. Pengambilan tubuh jamur besarnya sekitar 5mm 3 atau 10mm 3. Contoh indukan jamur untuk PDA Untuk lebih jelasnya pada pemilihan indukan jamur yang diharapkan memiliki jumlah spora yang banyak dan berkualitas dapat dilihat pada foto/dokumentasi contoh-contoh jamur untuk untuk indukan PDA pada folder Indukan jamur untuk PDA di CD data pembibitan 31

2.7. Mempelajari Perkembangan Miselium Bibit PDA Pada bibit PDA yang normal dan memiliki perkembangan baik, akan mengalami proses sebagai berikut: Perkembangan miselium awal pada PDA akan tampak pada indukan yang diinokulasi seperti terselimuti spora miselium. Ini terjadi dalam waktu 24 jam atau 48 jam dari waktu inokulasi. Pada hari ke-3 dan ke-4 adalah masa terpenting dan krusial dari perkembangan miselium. Jika media PDA yang dibuat pas dan cocok nutrisinya, maka miselium dari indukan jamur tersebut akan tampak mulai merambat pada media PDA. 32

Jika perkembangan miselium cukup baik, maka pada hari ke-7 dan ke-8, miselium sudah mencapai hampir 50% dari permukaan botol media PDA. Miselium akan mencapai 100% dari permukaan botol media PDA setelah kurang lebih 10 hari atau 15 hari. Penyimpanan bibit PDA hendaknya diletakkan di tempat yang bersih dan steril yang memiliki kelembaban rendah. Bisa juga meletakkannya pada lemari es. Waktu yang tepat untuk menurunkan bibit PDA ke generasi indukan murni F1 adalah sekitar 2-3 hari setelah miselium mencapai 100% dari permukaan botol. Maksimal PDA sudah harus diturunkan setelah 2 pekan atau 12 hari dari miselium mencapai 100%. Tetapi jika bibit PDA disimpan pada lemari es, PDA masih sanggup bertahan hingga sekitar 4 bulan. 33

2.7. Kegagalan Dalam Pembuatan Bibit PDA Dan Antisipasinya contoh PDA yang gagal dan kurang berkualitas Dalam pembuatan bibit PDA terkadang atau sering terjadi kegagalan seperti kontaminasi, miselium tidak merambat atau berkembang dan sebagainya. Secara umum, kasus yang paling sering terjadi adalah: - Kontaminasi Kontaminasi yang terjadi bisa berupa munculnya green spot, orange spot dan kontaminasi lainnya yang menyebabkan miselium tidak berkembang. Penyebab kontaminasi ini antara lain adalah : Bahan utama yang digunakan yaitu kentang dalam kondisi kurang baik, umumnya sudah lembek/lunak, antisipasinya pilih kentang yang kualitasnya baik dan tidak terlalu banyak bintiknya. Botol yang digunakan tidak steril. Botol bukan hanya dicuci, tapi hendaknya direbus dahulu dalam air sampai mendidih 100 o C. Kapas yang digunakan sebagai penutup tidak baru, kurang steril. Koran yang digunakan sebagai penutup tidak steril. Koran harus disterilkan dengan memasukkannya ke dalam plastik lalu disterilkan dalam autoclav pada tekakan 1,5BAR selama kurang lebih 15 menit. Kondisi pada saat inokulasi kurang bersih dan steril. Kotak pembibitan harus steril dengan menyemprotkan alkohol. Tangan juga harus bersih dan steril. 34

Peralatan seperti pinset dan cutter harus direndam dalam gelas berisi alkohol, sebelum digunakan pun harus dipanaskan menggunakan api bunzen sejenak. Proses inokulasi indukan harus dekat dengan api bunzen agar aman terhadap bakteri. Indukan yang akan dimasukkan ke dalam botol media PDA harus cepat, dekat dengan api bunzen, dan tidak boleh menyentuh mulut botol walaupun sejenak. Indukan jamur yang digunakan bebas kontaminasi dan hama. - Miselium tidak berkembang Terkadang terjadi miselium pada media PDA tidak berkembang sesuai yang diharapkan, atau indukan tidak bereaksi menumbuhkan miselium. Penyebabnya antara lain adalah : Pemilihan indukan yang tidak tepat. Pemilihan indukan yang salah atau tidak tepat menyebabkan kandungan spora sedikit atau tidak ada sama sekali. Untuk itu memang memerlukan latihan agar memahami letak spora pada indukan jamur. (Perhatikan dengan benar foto cara mengambil indukan dan teknik mengiris/menyayat jamur pada CD dokumentasi foto dan video) Cairan PDA belum mengeras sempurna ketika di inokulasikan indukan jamur. Ketika cairan PDA belum mengeras sempurna, kondisi masih sedikit basah, sehingga indukan jamur yang diletakkan pun menjadi mati. Hendaknya menggunakan agar-agar yang memiliki kualitas baik. Kondisi pada saat inokulasi masih terlalu panas. Walaupun cairan PDA sudah mengeras, tetapi jika saat inokulasi suhunya masih teralu tinggi, indukan jamur pun bisa mati. Waktu yang paling tepat adalah sekitar 6-7jam sejak dikeluarkan dari autoclav. Jika tidak sempat maksimal 24 jam sejak dikeluarkan dari autoclav. Campuran PDA yang terlampau keras. Jika kita membuat agar-agar, terkadang agar-agar yang ada terlampau keras/kenyal, tidak lembut. Ini bisa terjadi jika agar-agar yang digunakan kualitas tidak baik atau terlalu banyak. Jika menggunakan agar-agar batang, teknik membuat PDA ini memang agak rumit, karena harus direbus dahulu, untuk memudahkan gunakan saja agar-agar dalam kemasan yang kandungan isinya sudah jelas (seperti netto 7 gram per bungkus) sehingga mudah dalam menakar. Miselium biasanya tidak mau menyebar jika media PDA yang dibuat terlalu keras. Analoginya seperti manusia, jika makanan keras/atos, kita juga susah untuk memakannya khan..? Cairan PDA terlalu lama saat proses sterilisasi. Inokulasi pada autoclav cukup 15 menit pada tekanan 1,5BAR, atau sekitar 30 menit jika menggunakan panci presto bertekanan. Namun waktu ini masih bersifat optional tergantung alat yang digunakan. Jika terlalu lama pada proses ini, indikasinya warna PDA terlalu 35

gelap, dikhawatirkan struktur nutrisi yang terkandung di dalamnya sudah kurang baik bagi perkembangan miselium. Cairan PDA kurang saat sterilisasi. Ini malah kebalikannya, karena kurang lama saat sterilisasi, warna PDA masih belum berubah, yaitu putih keabuan. Pada kondisi ini kemungkinan masih mengandung bakteri. Warna PDA yang pas adalah kuning kecoklatan. Pada media PDA yang pas, miselium dari jamur indukan akan tampak Merambat dengan sempurna - Kegagalan karena waktu inokulasi yang tidak tepat Seperti yang sering dijelaskan sebelumnya, waktu inokulasi atau pemberian bibit indukan harus tepat. Tidak boleh terlalu cepat atau terlalu lama. Terkadang karena lupa atau apa, inokulasi baru diberikan 2 hari sejak pembuatan media PDA, kondisi ini beresiko. Ada juga yang berasumsi media PDA bisa disimpan di dalam lemari pendingin dahulu, lalu setiap saat bisa dikeluarkan lalu di inokulasikan indukan jamur. Mungkin sistem atau tatacara seperti itu ada di teori pembuatan PDA, namun sepanjang pengalaman kami, pembuatan PDA dengan hasil maksimal dan berkualitas hanya bisa dihasilkan jika semua dilakukan dalam waktu yang berurutan dan segera dilakukan, tidak menunda-nunda. 36

- Kegagalan karena pemilihan indukan Kegagalan ini yang paling sering terjadi. Sulitnya mendapatkan indukan yang pas dan sesuai menyebabkan jika ingin membuat bibit PDA bukan dengan membuat media PDA nya terlebih dahulu. Tetapi mencari di kumbung jamur, apakah ada indukan yang bagus dan berkualitas untuk dijadikan indukan, jika ada, barulah pembuatan media PDA dilakukan. Jamur yang dipilih pun harus segera diinokulasikan ke media PDA, maksimal 12 jam setelah dipetik, oleh karena itu indukan tidak boleh terlalu basah atau pun terlalu tua, karena biasanya tidak bertahan lama. - Kegagalan karena faktor peralatan yang kurang memadai Dalam membuat bibit PDA yang mutlak harus dimiliki adalah autoclav atau panci presto bertekanan untuk sterilisasi media PDA. Selain itu yang sangat penting juga kotak pembibitan atau laminar air flow. Dua peralatan ini sifatnya wajib untuk dimiliki. Di sini memang dituntut kreatifitas masing-masing pebudidaya, bagaimana untuk memiliki standar peralatan yang murah namun berkualitas dan bisa dimanfaatkan dalam pembuatan bibit PDA. 2.7. Multiplikasi atau Penggandaan Bibit PDA ke Media PDA Dalam membuat kultur jaringan, untuk menghasilkan bibit PDA jamur tiram terdapat tingkat kesulitan yang cukup tinggi. Tingkat kesulitan itu bukan pada pembuatan media PDA, tetapi terutama pada proses inokulasi. Memilih dan mengambil spora dari indukan jamur adalah kunci utama keberhasilan pembuatan bibit PDA. Namun, jamur untuk indukan yang memiliki kualitas baik terkadang tidak selalu ada. Untuk itulah jika sudah berhasil membuat bibit PDA dengan kualitas baik, bibit PDA tersebut bisa dikembangkan ke media PDA pula. Tingkat kesulitan dan resiko pengembangan bibit PDA ke media PDA relatif lebih kecil dari pada langsung mengambil dari indukan jamur. Namun, yang perlu diperhatikan adalah, proses ini hanya bisa dilakukan satu kali saja!. Maksudnya, media pengembangan PDA yang dihasilkan tidak boleh dikembangkan menjadi media PDA lagi. Jika dilakukan, walaupun nantinya berhasil, namun tingkat kerapatan miselium sudah kurang bagus untuk diturunkan ke media F1. Untuk tata cara penggandaan bibit PDA ke media PDA adalah sebagai berikut: Proses pembuatan media PDA sama dengan yang telah dijelaskan sebelumnya pada langkah pada sub bab 2.5. pada langkah ke-1 hingga langkah ke-12. Selanjutnya adalah proses inokulasi. Pada langkah inokulasi, jika pada pembuatan bibit PDA kultur jaringan, yang digunakan adalah indukan jamur, pada langkah ini yang digunakan sebagai inokulan adalah bibit PDA yang dipilih memiliki kualitas baik. 37

Lalu langkah penyimpanan juga sama seperti dalam pembuatan bibit PDA yaitu diletakkan di lemari yang bersih dan steril serta memiliki tingkat kelembaban yang rendah dan terjaga. 2.8. Perbandingan kualitas bibit PDA murni dengan PDA turunan Untuk membandingkan kualitas PDA murni dengan PDA turunan hasil multiplikasi dari PDA murni sebenarnya memerlukan penelitian yang lebih mendalam. Penelitian tidak hanya pada kualitas turunan di bibit induk F1, namun harus lebih detil lagi pada kualitas dan kuantitas panen jamur tiram pada kumbung. Secara spesifik memang penelitian dari perbandingan ini belum kami lakukan, namun secara garis besar, kualitas turunan yang ada tidak terlalu jauh berbeda. Bahkan bisa dikatakan tidak ada perbedaan yang mencolok. Hal ini dikarenakan, jika memang harus membandingkan, semua kondisi harus dibuat homogen, ini yang sulit untuk dilakukan, karena pada umumnya standard kualitas kerja, jenis kayu, dan perawatan jamur di kumbung juga mempengaruhi kualitas dan kuantitas panen. Kesimpulan dari ketiadaan perbedaan ini kami ambil dikarenakan standard hasil panen dari masing-masing kumbung hampir tidak ada perbedaan jika media tumbuh baglog adalah hasil dari generasi turunan PDA murni atau PDA hasil multiplikasi. Namun memang yang perlu untuk ditekankan di sini adalah, proses multiplikasi hanya dilakukan satu kali saja. Jangan sampai PDA hasil multiplikasi ini dikembangkan lagi ke media PDA. 2.9. Pentingnya memilih bibit PDA Yang Berkualitas Dalam tatacara pembuatan bibit PDA seperti yang telah dijelaskan pada sub bab 2.5 tampak bahwa yang dihasilkan dalam satu campuran bisa mencapai 20 botol bibit PDA. Hal ini tentunya akan menimbulkan pertanyaan sebagai berikut: Untuk apa bibit PDA sebanyak itu? Apakah seluruhnya akan diturunkan menjadi bibit induk F1? Mengapa tidak membuat campuran yang sedikit saja? Apakah dari keseluruhan bibit PDA itu memiliki kualitas yang sama? Bagaimana menentukan kualitas PDA yang baik? Dan mungkin beberapa pertanyaan yang lainnya. Memang kesan dari pertanyaanpertanyaan tersebut akan selalu timbul. Kita tidak pernah tahu apakah indukan yang kita pilih untuk membuat bibit PDA itu memiliki spora yang banyak dan berkualitas, kita juga tidak pernah tahu tingkat keberhasilan kita dalam membuat bibit PDA. Kita hanya berusaha secara maksimal dan terbaik dengan harapan mendapatkan hasil yang baik pula. 38

Apakah tidak mahal? Untuk masalah biaya akan dibahas secara khusus, namun sebagai gambaran saja, biaya membuat PDA itu sebenarnya tidak mahal. Kentang 200gram itu tidak sampai Rp. 5000,-, agar-agar 3 bungkus maksimal Rp. 9000,-, Dextrosa 20 gram itu kalau dirupiahkan hanya Rp. 1000,- saja. Lalu botol bekas per buahnya hanya Rp. 200,- jadi 20 buah = Rp. 4000,-. Total hanya Rp. 19.000,-. Lalu ditambah gas LPG 3kg seharga Rp.13.500,- total hanya Rp. 32.500,- untuk membuat sekitar 20 botol PDA itu, tidak mahal bukan..? Nah.., dari 20 botol tersebut kita pilih dan di sortir mana bibit PDA yang memiliki pertumbuhan miselium terbaik. Selanjutnya bibit PDA terpilih inilah yang nantinya diturunkan menjadi bibit induk F1. Jadi yang digunakan disini adalah probabilitas, kita tetap perlu membuat PDA sejumlah 20 botol dalam satu kali proses, yang selanjutnya memilih botol PDA yang terbaik sebagai bibit PDA. Mengapa ini dilakukan? Seperti yang telah dijelaskan pada BAB PENDAHULUAN, bahwa dari 1 botol saja bibit PDA dapat menghasilkan banyak bibit induk F1 F2 lalu media baglog jamur tiram putih. Jadi penting sekali untuk selalu memilih bibit PDA yang terbaik yang memiliki miselium tebal dan berkualitas, sehingga diharapkan hasil turunannya akan menghasilkan jamur tiram yang berkualitas dan banyak. Selalu gunakan bibit PDA yang berkualitas untuk diturunkan ke bibit induk F1 39

Kualitas dari bibit PDA ini sangat penting untuk diperhatikan, jangan sampai memilih bibit PDA yang kualitasnya kurang baik. Bagaimana menentukan bahwa bibit PDA itu kurang baik? Caranya adalah sebagai berikut : Perhatikan dengan baik perkembangan awal pertumbuhan miselium pada media PDA, pada masa krusial di hari ke-4 akan tampak apakah miselium yang merambat tebal ataukah tipis, jika rambatan miselium tipis, maka bibit PDA tersebut harus dicatat. Miselium PDA yang baik akan tampak di hari ke-4 dengan rambatan yang merata Miselium PDA yang kuran baik biasanya tipis dan kurang merata 40

Jika pada hari ke-7 rambatan miselium tetap tipis, berarti bibit PDA tersebut layak untuk disortir. Indikasi ini karena kemungkinan spora yang terkandung pada indukan jamur kurang baik dan banyak, sehingga miselium yang merambat tipis. Bibit PDA yang kurang baik akan tampak miselium tetap tipis di hari ke-7 Bibit PDA yang berkualitas akan tampak perkembangan miselium di hari ke-7 semakin menebal dan bertumpuk 41

Memperhatikan perkembangan miselium ini harus terus dilakukan, karena jika miselium sudah mencapai 100%, maka permukaan media PDA akan tertutup oleh miselium walaupun tipis, pada saat ini sulit sekali untuk membedakan secara visual jika tidak diberi tanda atau disortir sebelumnya antara bibit PDA yang baik dan bibit PDA yang kurang baik. Bibit PDA yang tidak berkualitas setelah miselium penuh akan tampak normal, namun kurang baik jika diturunkan ke bibit induk F1, untuk itu harus tetap dicatat Kualitas bibit PDA yang kurang baik ini sangat penting untuk dicatat dan disortir karena jangan sampai bibit PDA ini yang dipilih untuk diturunkan menjadi bibit induk F1. Jika dipaksakan, maka kualitas F1 yang dihasilkan kurang baik, dan selanjutnya turun ke bibit sebar F2 dan media baglog jamur menjadi kurang berkualitas pula. Hal ini menjadi penting untuk diperhatikan, karena secara visual pula, tidak akan tampak kualitas bibit induk F1 yang dihasilkan dari bibit PDA yang kurang baik itu akan berkurang. Semua akan tampak normal sampai pembuatan media baglog jamur, namun semua akan tampak pada durasi panen serta kualitas dan kuantitas jamur yang dihasilkan dari media baglog jamur tiram. Dokumentasi foto-foto PDA yang Baik untuk diturunkan ke bibit induk F1 dan yang kurang baik bias diperhatikan di CD Data pada folder PDA berkualitas 42