Analisis Fisiko Kimia KROMATOGRAFI Oleh : Dr. Harmita
DEFINISI Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas). Bila fase diam berupa zat padat yang aktif, maka dikenal istilah kromatografi penyerapan (adsorption chromatography). Bila fase diam berupa zat cair, maka teknik ini disebut kromatografi pembagian (partition chromatography).
Jenis-jenis kromatografi Berdasarkan fase gerak yang digunakan, kromatografi dibedakan menjadi dua golongan besar yaitu gas chromatography dan liquid chromatography. Masing-masing golongan dapat dibagi lagi seperti yang telah disebutkan pada definisi di atas.
Con d Kromatografi PADAT ION EXCHANGE GEL FASA DIAM ADSORBSI PERTUKARAN ION EKSKLUSI GAS CAIR CAIR CAIR FASA GERAK GC PLATE KOLOM ANION KATION GPC HPTLC HPLC Keterangan GLC = Gas Liquid Chromatography GSC = Gas Solid Chromatography LLC = Liquid Liquid Chromatography LSC = Liquid Solid Chromatography PC = Paper Chromatography TLC = Thin Layer Chromatography GP = Gel Permeation GF = Gel Filtration HPLC = High Performance Liguid Chromatography
Liquid Liquid Chromatography (LLC) LLC adalah kromatografi pembagian dimana partisi terjadi antara fase gerak dan fase diam yang kedua-duanya zat cair. Dalam hal ini fase diam tidak boleh larut dalam fase gerak. Umumnya sebagai fase diam digunakan air dan sebagai fase gerak adalah pelarut organik. Misalnya pada kromatografi kertas, sebagai fase diam adalah air yang terserap pada serat selulosa dari kertas.
Liquid Solid Chromatography (LSC) LSC adalah kromatografi penyerapan. Sebagai adsorben digunakan silika gel, alumina, penyaring molekul atau gelas berpori dipak dalam sebuah kolom dimana komponen-komponen campuran dipisahkan dengan adanya fase gerak. Kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis (TLC) merupakan teknik pemisahan yang masuk golongan ini.
Ion-exchange chromatography Teknik ini menggunakan zeolitas, resin organik atau anorganik sebagai penukar ion. Senyawaan yang mempunyai ion-ion dengan afinitas yang berbeda terhadap resin yang digunakan dapat dipisahkan. Analisa asam-asam amino adalah yang umum dilakukan dengan cara ini. Contoh lain adalah asam-asam nukleat dan analisis garam-garam anorganik.
Exclusion chromatography Dalam teknik ini, gel nonionik berpori banyak dengan ukuran yang sama digunakan untuk memisahkan campuran berdasarkan perbedaan ukuran molekulnya (BM). Molekul-molekul yang kecil akan memasuki pori-pori dari gel sedangkan molekul besar akan melewati sela-sela gel lebih cepat bila dibandingkan dengan molekul yang melewati pori-porinya. Jadi urutan elusi mula-mula adalah molekul yang lebih besar, molekul sedang, dan terakhir molekul yang paling kecil. Bila sebagai penyaring digunakan gel yang hidrofil (Sephadex) maka teknik ini disebut gel filtration chromatography dan bila digunakan gel yang hidrofob (polystyrene-divinylbenzene) disebut gel permeation chromatography. Teknik kromatografi yang umum digunakan dibidang farmasi yaitu kromatografi kolom, kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, kromatografi gas, dan high performance liquid chromatography (kromatografi cair kinerja tinggi / KCKT).
Teori Martin dan Synge adalah yang pertama kali menulis tentang teori liquid partition chromatography. Prinsip teori yang dikemukakan itu dapat diterapkan untuk semua jenis kromatografi. Pemisahan terjadi karena molekul sampel tertahan oleh fase diam atau dibawa oleh fase gerak, tergantung dari afinitas senyawa tersebut terhadap kedua fase ini.
Koefisien distribusi Distribusi dari molekul-molekul sampel diantara dua fase ditentukan oleh tetapan kesetimbangan yang dikenal dengan koefisien distribusi, K (koefisien partisi). Cs K = Cm K = koefisien partisi Cs = konsentrasi sampel dalam fase diam (stationary phase) Cm = konsentrasi sampel dalam fase gerak (mobile phase)
Faktor kapasitas ( Retention / K ) K = KVs/Vm = capacity factor = CsCv / CmVm = perbandingan molekul sampel dalam fase diam dengan fase gerak. K adalah nilai yang menunjukkan seberapa kuat komponen-komponen dalam sample yang dibawa oleh fasa gerak berinteraksi dengan kolom (fasa diam).
Con d Faktor kapasitas (k ) didefinisikan sebagai waktu tambahan yang diperlukan zat terlarut untuk terelusi, dibandingkan dengan zat yang tidak tertahan (k = 0), dibagi dengan waktu elusi dari zat yang tidak tertahan. Faktor kapasitas dinyatakan berdasarkan persamaan : t R t M k = = t M t' M t' R M R Keterangan : k = faktor kapasitas t R = waktu retensi zat t M = waktu retensi zat inert (contoh ; pelarut)
Con d tm tr1 tr2 Kromatogram sampel dengan tiga komponen
Laju pemisahan Apabila bagian waktu yang dibutuhkan oleh molekul sampel pada fase gerak dikalikan dengan kecepatan linier (u) dari fase gerak maka diperoleh laju pemisahan (rate of travel) dari molekul rata-rata. Rate = u 1 1 + K' Jadi, laju pemisahan ditentukan oleh : 1. Kecepatan fase gerak (sama untuk tiap komponen campuran). 2. Perbandingan dari volume fase diam dengan fase gerak (sama untuk tiap komponen campuran) 3. Koefisien distribusi (spesifik untuk tiap komponen campuran).
Retention time Waktu yang diperlukan oleh sebuah komponen sampel untuk melintasi kolom sepanjang L disebut retention time (t). Dari definisi ini, laju pemisahan diperoleh: Length L t= = = ( 1 + K ) = t M (1 + K ) Rate u t M = waktu yang diperlukan oleh fase gerak untuk melintasi kolom sepanjang L. Persamaan ini merupakan persamaan dasar untuk semua jenis kromatografi. Dalam praktek sering diterapkan pada kromatografi gas dan definisinya dapat diubah menjadi retention time,, yaitu waktu yang diperlukan oleh sampel mulai dari saat injeksi sampai timbulnya peak maksimum.
Retention volume Bila kecepatan dari fase gerak konstan, maka volume dari fase gerak yang diperlukan untuk memisahkan suatu komponen campuran dari kolom dapat dihitung dengan rumus berikut : Volume = waktu x kecepatan aliran V R = t R F Bila persamaan retention time disubstitusikan ke dalam persamaan ini maka diperoleh: V R = Vm (1 + K ) = Vm + KVs Vm = volume dari fase gerak dalam kolom Vs = volume dari fase diam Bila fase diam berupa zat padat maka Vs dapat dirubah menjadi luas permukaan / area (adsorption) atau dengan kapasitas penukar ion.
Relative retention (selektifitas, α) α adalah nilai yang menunjukkan seberapa baik sistem kromatografi dapat memisahkan dua komponen. Retention time dan retention volume kurang tepat jika dipakai untuk identifikasi dengan membandingkan data-data lainnya karena harga- harga ini sangat tergantung dari cara pembuatan kolom dan kondisi percobaan. Untuk menghilangkan efek dari operasional variabel, maka lebih baik digunakan harga relative retention yaitu perbandingan antara retention time sampel dengan retention time standar yang diperoleh dari kolom yang sama dengan kondisi percobaan yang sama
R m α = = t t R t VR Vm K = * t V Vm + K * m R α = relative retention tanda asetrik (*) = harga untuk standar Injek Gambar : Kromatogram sampel dengan empat komponen Selektifitas, α = k 2 = tr2 - tm k 1 tr1 - tm
Plate theory (N) Martin dan Synge melihat adanya persamaan proses yang terjadi pada kolom kromatorafi dengan kolom destilasi bertingkat kemudian menerapkan konsep theoretical rate pada pemisahan dengan destilasi ke dalam kromatografi.
Rate theory Dalam praktek harga H selalu lebih besar dari harga idealnya (nol) yang berarti terjadi pelebaran peak. Pelebaran ini disebabkan oleh 3 faktor yaitu: 1. Efek perbedaan jarak (eddy diffusion) Perbedaan jarak yang dilalui oleh molekul yang satu dengan yang lain disebabkan perbedaan bentuk, ukuran partikel-partikel pengisi kolom, cara pengisian kolom, dan diameter dari kolom. Perbedaan ini mengakibatkan perbedaan waktu keluarnya molekul- molekul dari kolom. Untuk memperkecil efek ini, digunakan partikel-partikel kecil yang serba sama tetapi tidak menyebabkan penurunan tekanan dalam kolom terlalu tinggi, diameter kolom yang kecil, pengepakan yang mampat dan serba sama tanpa memecahkan partikel-partikel pengisi kolom tersebut. Efek ini lebih lanjut dapat dijelaskan dengan gambar berikut :
Con d konsentrasinya tinggi ke daerah yang konsentrasiya rendah. Akibatnya, waktu melintasi kolom, molekul-molekul akan menyebar (berdifusi) ke belakang dan 2.Difusi molekul sepanjang g kolom Cm Fase Diam Molekul-molekul cenderung untuk berdifusi dari daerah yang ke depan
Con d 3. Efek ketidaksinambungan Aliran yang terus-menerus dari fase gerak menyebabkan penyimpangan dari keseimbangan dimana Cs/Cm selalu lebih kecil dari K pada tepi zona yang didepan dan selalu lebih besar pada tepi zona yang dibelakang seperti terlihat pada gambar di atas (c). Pada partition chromatography, efek ini makin nyata bila kekentalan fase diam makin tinggi.
Resolusi (R) Merupakan ukuran apakah seuatu senyawa terpisah secara baik atau tidak dengan senyawa lain
Con d Perubahan kecil pada nilai α akan menyebabkan nilai resolusi berubah secara segnifikan, hal ini dapat dilihat pada contoh dibawah ini. Selektifitas, selektivit as Hitunglah R jika α = 1,1 dan α = 1,4
Con d
Resolusi atau daya pisah menunjukkan apakah dua komponen terpisah baik. Resolusi didefinisikan sebagai jarak (t) antara dua puncak dibagi rata-rata lebar (W) dua puncak yang diukur pada alas puncak. t R1 t R2 t R W 1 W 2 Menghitung resolusi
Con d Cara menghitung resolusi : 2( tr2 tr1) R = W 1 + W 2 Keterangan : t R1 = waktu retensi komponen 1 t R2 = waktu retensi komponen 2 W 1 = lebar puncak komponen 1 W 2 = lebar puncak komponen 2 Bila nilai resolusi lebih besar dari 1,5; maka pemisahan yang dihasilkan baik atau lebih dari 99,7 % dan bila nilai resolusi lebih kecil dari 1,5 maka pemisahan yang dihasilkan tidak baik.
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI HPLC (High( Performance Liquid Chromatography) ) atau KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi) merupakan teknik analisis yang paling cepat berkembang dalam kimia analitik. Penggunaannya yang sangat banyak terdiri atas berbagai metode dalam kromatografi cair
1. Metode dalam kromatografi cair dibagi atas dua macam : a. Kromatografi Cair Retensif Pemisahan dicapai melalui interaksi antara zat terlarut dengan fase diam. Tipe ini mencakup fase normal, fase terbalik, dan kromatografi ion. b. Kromatografi Cair Non-retensif Pemisahan yang dicapai tergantung kepada perbedaan besar molekul zat terlarut dimana terjadi interaksi antara zat terlarut dengan pori- pori yang terdapat di permukaan fase diam. Tipe ini dikenal sebagai kromatografi ekslusi.
Con d 2. Keuntungan KCKT antara lain : a. Waktu analisis cepat Waktu yang diperlukan biasanya kurang dari satu jam, seringkali hanya 15 menit hingga 30 menit. Untuk analisis yang mudah waktu yang diperlukan kurang dari 5 menit. b. Daya pisahnya baik. c. Peka Kepekaannya sangat tergantung pada jenis detektor dan eluen yang digunakan. d. Pemilihan kolom dan eluen sangat bervariasi. e. Kolom dapat dipakai kembali. f. Dapat digunakan untuk molekul besar dan kecil. Mudah untuk memperoleh kembali cuplikan. Tidak seperti kebanyakan detektor dalam kromatografi gas, detektor KCKT tidak merusak komponen zat yang dianalisis, sehingga zat yang telah dielusi dapat dikumpulkan dengan mudah setelah melewati detektor. h. Dapat menghitung sampel dengan kadar yang sangat rendah. Hal ini sangat bergantung kepada detektor yang digunakan, namun detektor KCKT dapat mendeteksi zat sampai dengan kadar ppt (part( per trillion).
Instrumentasi KCKT memiliki beberapa komponen yang berbeda. Sebagai akibatnya banyak instrumen-instrumen KCKT yang atau telah tersedia secara komersial telah menggunakan desain standar. Bentuk desain ini sangat menguntungkan karena instrumen dapat diperbaharui(mengikuti teknologi terkini) hanya dengan menambahkan komponen lain atau dengan mengganti dengan komponen- komponen lain yang sesuai.