MATERI DAN METODE PENELITIAN Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Balai Pengujian Mutu Pakan Ternak (BPMPT) Kecamatan Setu, Kabupaten Bekasi dan beberapa laboratorium pabrik pakan. Penelitian ini dilakukan pada bulan Juni 2008 sampai dengan bulan Maret 2010. Materi Penelitian Bahan penelitian yang digunakan adalah pakan ayam broiler starter (BR1) dan finisher (BR2) dari berbagai pabrik pakan di Indonesia. Bahan yang digunakan adalah Kjeltec tablet, H 2 SO 4, NaOH, methyl merah dan biru, H 3 BO 3, HCl (Protein kasar), heksan, selongsong lemak (Lemak kasar), H 2 SO 4, NaOH, etanol, kertas saring (serat kasar), HCl, HNO 3, La 2 O 3, NH 4 OH, standar kalsium (Kalsium), Ammonium molibdat vanadat, HClO 4, dan standar fosfor (Fosfor). Peralatan penelitian yang digunakan adalah oven, tanur, digestor protein, kjeltec destilasi, buret, soctex, kompor serat kasar, spektrofotometer, atomic absorption spectrophotometer (AAS) dan Near Infrared (NIR) merk Buchi NIRLab N-200. Metode Penelitian Preparasi Sampel Pakan ayam broiler starter (BR1) dan finisher (BR2) dari beberapa produk pabrik pakan dikumpulkan minimal 60 sampel. Sampel tersebut diperoleh dari sampel yang datang ke BPMPT Bekasi sebagai pelanggan dan dari beberapa pabrik pakan yang disertai dengan hasil ujinya. Selanjutnya semua pakan dilakukan pengujian kimia dengan mengacu metode Association of Official Analytical Chemists (AOAC), metode pabrik pakan atau Standar Nasional Indonesia (SNI) yang dikerjakan di BPMPT Bekasi dan laboratorium beberapa pabrik pakan seperti pada Tabel 2. Jenis pengujian yang dilakukan adalah kadar air, abu, protein kasar, lemak kasar, serat kasar, kalsium dan fosfor.
18 Tabel 2. Metode uji kimia Jenis uji Metode uji kimia Air Oven 105 ºC, 3 jam Abu Tanur 600 ºC, 2 jam Protein kasar Kjeldahl, katalis Cu, H 3 BO 4 4%, HCl 0,1 N Lemak kasar Soctex, pelarut heksan Serat kasar Ekstraksi H 2 SO 4 1,25% dan NaOH 3,25 % Kalsium AAS Fosfor Spektrofotometer Metode Uji Kimia Metode Pengujian Kadar Air Penentuan kadar air menurut SNI 01-2891-1992 butir 5.1 adalah untuk mengetahui persentase kadar air yang terkandung dalam pakan. Prinsip metode uji ini adalah kehilangan berat pada pemanasan selama 3 jam menggunakan oven pada suhu 105 ºC dianggap sebagai kadar air yang terdapat pada pakan. Sampel ditimbang sebanyak 2 gram dimasukkan ke dalam vochdoos dan dipanaskan sesuai metode uji. Berat sampel setelah dipanaskan dicatat sampai bobot konstan dengan selisih penimbangan 10 mg. Kadar air dihitung dengan rumus : W 1 - W 2 Kadar Air = x 100 %.............. 1 W dimana W = berat sampel (g) W 1 = berat sampel sebelum dikeringkan (g) W 2 = berat sampel setelah dipanaskan (g) Metode Pengujian Kadar Abu Metode uji penentuan kadar abu menurut Association of Official Analytical Chemists (AOAC 2005) Metode 942.05, adalah untuk mengetahui persentase kadar abu yang terkandung dalam pakan. Prinsip metode uji ini adalah proses pengabuan selama 2 jam menggunakan tanur pada suhu 600 ºC dimana zat-zat
19 organik diuraikan menjadi H 2 O, CO 2 dan gas lain yang menguap, sedangkan sisanya yang tertinggal adalah berupa oksida mineral (abu). Sampel ditimbang sebanyak 2 gram dimasukkan ke dalam crusibel dan dipanaskan sesuai metode uji. Berat sampel setelah dipanaskan dicatat sampai bobot konstan dengan selisih penimbangan 10 mg. Kadar abu dihitung dengan rumus : W 2 - W 1 Kadar Abu = x 100 %......... 2 W dimana W = berat sampel (g) W 1 = berat crusibel kosong setelah dipanaskan (g) W 2 = berat crusibel + sampel setelah dipanaskan (g) Metode Pengujian Kada Protein Kasar Metode uji penentuan kadar protein kasar menurut Association of Official Analytical Chemists (AOAC 2005) Metode 2001.11 (Kjeldahl), adalah untuk mengetahui persentase kadar protein kasar yang terkandung dalam pakan. Prinsip metode uji ini adalah pengubahan N menjadi NH 3 dengan proses destruksi, destilasi dan titrasi. Sampel ditimbang sekitar 0,5-1 gram dimasukkan ke dalam tabung destruksi 250 ml, ditambahkan 2 tablet katalisator (kjeltab Cu) atau 7 g CuSO 4.5H 2 O + 0,8 g K 2 SO 4, lalu ditambahkan 15 ml H 2 SO 4 97% dan dipanaskan dengan kompor digestor pada suhu 420ºC dalam lemari asam selama 1 jam atau sampai larutan menjadi biru jernih, kemudian didinginkan. Pindahkan tabung destruksi ke alat destilasi (Kjeltec), tambahkan akuades 75 ml dan 60 ml NaOH 40%. Letakkan larutan penerima pada erlenmeyer 250 ml yang berisi 25 ml larutan H 3 BO 4 4% dan 3 tetes mix indicator (campuran 0,0667 g metil biru dan 0,1333 g metil merah, kemudian dilarutkan dengan ethanol sampai 100 ml sampai homogen), kemudian lakukan destilasi sampai tertampung kira-kira 150 ml destilat dalam erlenmeyer. Larutan destilat dititrasi dengan HCl 0,1N sampai terjadi perubahan warna menjadi abu-abu. Lakukan juga penetapan blanko. Kadar nitrogen (N %) dihitung dengan rumus :
20 (ml HCl ml blanko) x normalitas HCl x 14.007 N (%) = x 100 %... 3 mg sampel Berdasarkan persentase N dapat ditentukan kadar protein kasar dengan persamaan 4 berikut : Protein kasar (%) = % N x 6,25... 4 Metode Pengujian Lemak Kasar Metode uji penentuan kadar lemak kasar menurut AOAC Metode 2003.06 (AOAC 2005) ekstraksinya menggunakan soxtec, adalah untuk mengetahui persentase kadar lemak kasar yang terkandung dalam pakan. Prinsip metode uji ini adalah lemak dapat diekstraksi dengan menggunakan heksan/zat pelarut lemak lainnya, bila zat pelarutnya diuapkan maka akan tertinggal lemak kasarnya. Sampel ditimbang sebanyak 2 gram dimasukkan ke dalam selongsong kertas, lalu ditutup dengan kapas non lemak dan masukkan ke dalam alat soxtec. Letakkan wadah lemak berisi heksan 70 ml pada alat soxtec dan selongsong kertas yang berisi sampel harus terendam heksan. Lakukan ekstraksi selama 1 jam pada suhu 140 ºC dengan tahapan pembakaran 20 menit, pencucian 30 menit dan penguapan 10 menit. Selanjutnya wadah yang berisi lemak hasil ekstraksi dipanaskan dalam oven pada suhu 105 ºC selama 1 jam. Berat sampel setelah dipanaskan dicatat sampai bobot konstan dengan selisih penimbangan 10 mg. Kadar lemak kasar dihitung dengan rumus : W 2 - W 1 Kadar lemak kasar = x 100 %....... 5 W dimana W = berat sampel (g) W 1 = berat wadah lemak kosong setelah dipanaskan (g) W 2 = berat wadah lemak + sampel setelah dipanaskan (g) Metode Pengujian Kadar Serat Kasar Metode uji penentuan kadar serat kasar menurut SNI 01-2891-1992 butir 11, adalah untuk mengetahui persentase kadar serat kasar yang terkandung dalam
21 pakan. Prinsip metode uji ini adalah semua senyawa organik akan larut dalam perebusan dengan H 2 SO 4 1,25 % dan NaOH 3,25 % kecuali serat kasar dan abu, bila ampas yang tidak larut kemudian dibakar sempurna maka serat kasarnya akan menguap menjadi gas dan sisanya berupa abu. Sampel ditimbang sebanyak 2 gram dimasukkan ke dalam beaker gelas 500 ml, lalu penghilangan lemak dengan ditambah heksan 15 ml lalu larutan lemak yang ada di bagian atas dibuang dan sampel didiamkan sampai kering, lalu direbus/ekstraksi dengan ditambah 50 ml H 2 SO 4 1,25 % selama 30 menit dan 50 ml NaOH 3,25 % selama 30 menit selanjutnya disaring dengan kertas saring no.41 dan bilas sampai netral secara beturut-turut dengan larutan H 2 SO 4 1,25% panas, akuades panas dan ethanol secukupnya. Setelah itu lakukan pemanasan dan pembakaran sampel. Kertas saring berisi sampel dimasukkan ke dalam crusibel untuk dipanaskan didalam oven pada suhu 105 ºC selama 2-3 jam dan selanjutnya dibakar didalam tanur pada suhu 550ºC selama 2 jam. Berat sampel setelah dipanaskan dicatat sampai bobot konstan dengan selisih penimbangan 10 mg. Kadar serat kasar dihitung dengan rumus : W 1 - W 2 - B Kadar serat kasar = x 100 %... 6 W dimana W = berat sampel (g) W 1 = berat crucibel + sampel setelah dipanaskan oven (g) W 2 = berat crusibel + sampel setelah dibakar tanur (g) B = berat kertas saring setelah dioven (g) Metode Pengujian Kadar Kalsium Metode uji penentuan kadar kalsium menurut AOAC metode 968.08 (AOAC 2005), adalah untuk mengetahui persentase kadar kalsium yang terkandung dalam pakan. Prinsip metode uji ini adalah abu sampel yang dilarutkan dalam asam ditambahkan dengan lanthanum oksida untuk mencegah terbentuknya ion selain kalsium pada saat penetapan dengan menggunakan alat Atomic Absorption Spectrophotometer (AAS). Penentuan kadar kalsium diawali dengan pengabuan sampel pada suhu 550 ºC selama 4 6 jam, lalu diasamkan dengan ditambahi 10 ml HCl 3N dan
22 dipanaskan selama 10 menit pada suhu 70-80 ºC, dilanjutkan pembuatan larutan sampel pada labu takar dengan menyaring larutan tersebut dan dibilas dengan akuades sampai volume 200 ml. Membuat larutan kurva standard pada konsentrasi 0, 2, 4, 8, 12, 16 dan 20 mg/l dan ambil 2-5 ml dari larutan sampel, masing masing dimasukkan pada labu takar 50 ml yang sudah ditambahi larutan lanthanum oksida (La 2 O 3 ) sebanyak 10 ml, lalu dibaca dengan alat Atomic Absorption Spectrophotometer (AAS) yang sudah diverifikasi. Kadar kalsium dihitung dengan rumus : C x V 1 x V 3 Kadar kalsium =....... 7 W x V 2 x 10.000 dimana W = berat sampel (g) V 1 = volume larutan sampel (ml) V 2 = volume larutan yang diambil dari larutan sampel (ml) V 3 = volume larutan sampel final yang akan dibaca AAS (ml) C = konsentrasi sampel (mg/l) diambil dari persamaan linear,yaitu: C = (y-a)/b, dimana y = absorbansi sampel, b = slope dan a = intercept 10.000 = nilai konstanta hasil konversi dari mg/l menjadi persen (%) Metode Pengujian Kadar Fosfor Metode uji penentuan kadar fosfor menurut AOAC metode 965.17 (AOAC, 2005), adalah persentase kadar fosfor yang terkandung dalam pakan. Prinsip metode ini adalah abu sampel yang dilarutkan dalam asam ditambahkan dengan larutan molybdate-vanadate untuk memberikan warna yang dapat diserap sinar yang dipancarkan oleh spektrofotometer pada panjang gelombang tertentu. Penentuan kadar fosfor sama seperti kadar kalsium sampai pada proses pembuatan larutan sampel yang diawali dengan pengabuan sampel sampai memperoleh larutan sampel 200 ml. Membuat larutan kurva standard pada konsentrasi 0, 2, 4, 8 dan 12 mg/l dan ambil 5-10 ml dari larutan sampel, masing masing dimasukkan pada labu takar 50 ml yang sudah ditambahi larutan
23 molybdate-vanadate sebanyak 10 ml, lalu dibaca dengan alat spektrofotometer yang sudah dikalibrasi. Kadar fosfor dihitung dengan rumus : C x V 1 x V 3 Kadar fosfor =....... 8 W x V 2 x 10.000 dimana W = berat sampel (g) V 1 = volume larutan sampel (ml) V 2 = volume larutan yang diambil dari larutan sampel (ml) V 3 = volume larutan sampel final yang akan dibaca (ml) C = konsentrasi sampel (mg/l) diambil dari persamaan linear, C = (y-a)/b, dimana y= absorbansi sampel, b= slope, a= intercept 10.000 = nilai konstanta hasil konversi dari mg/l menjadi persen (%) Metode Pengujian menggunakan NIR Kalibrasi NIR Kalibrasi NIR merupakan tahapan pertama sebelum alat NIR digunakan. Hasil uji kimia dan sampel pakan yang mencukupi minimal 60 sampel dalam keadaan sudah halus dengan ukuran partikel 0.75 mm, dimasukkan pada cawan petri secukupnya dan ditekan, lalu dimasukkan ke alat NIR. Data tersebut akan diubah menjadi spektrum. Kumpulan spektrum/spektra dibagi menjadi 2 (dua) yaitu 2/3 bagian untuk kalibrasi NIR dan 1/3 bagian untuk validasi. Validasi NIR bertujuan untuk memastikan bahwa kalibrasi NIR sudah baik dan dapat digunakan sebagai alat pengujian. Parameter yang digunakan dalam menganalisa kalibrasi NIR adalah nilai Q, koefisien korelasi (r), Standard Error of Estimation (SEE), Standard Error of Prediction (SEP), konsistensi, bias dan metode NIR yaitu Principle Component Regression (PCR) dan Partial Least Squares Regression (PLS).
24 Nilai Reflektan, Data Treatment KALIBRASI NIR Jumlah Sampel Regresi Linear Data Uji Metode Kimia VALIDASI NIR Jumlah Sampel Nilai Reflektan, Data treatment, Persamaan Kalibrasi, Pengukuran kandungan nutrisi Data Uji Metode Kimia T a h a p I Evaluasi Uji Banding Hasil Kalibrasi NIR Jumlah Sampel Metode Kimia Hasil Validasi NIR Gambar 2. Skema metode kalibrasi dan validasi NIR serta uji banding T a h a p 2 Cara kerja NIR spectrometer dapat dibagi menjadi interferometer dan NIR spectroscopy seperti pada Gambar 3 dan Gambar 4. Prinsip kerja NIRLab N-200 adalah interaksi antara molekul pada sampel dengan cahaya yang dipancarkan pada panjang gelombang antara 4000 10.000 cm -1. Cahaya infrared yang dibentuk oleh sumber cahaya akan dipisah didalam interferometer dan akan bergabung lagi untuk membentuk interferogram. Sumber cahaya berasal dari lampu Wolfram halogen. Cahayanya diatur oleh beam splitter (cahaya pemisah) untuk berinteraksi dengan molekul pada sampel yang sebagian cahaya akan diserap dengan panjang gelombang sesuai struktur kimianya, sedangkan sebagian cahaya yang tidak diserap akan dipantulkan sesuai sistem optik lainnya sampai diterima detector. Detector berfungsi mengkonversi panjang gelombang elektromagnetik menjadi data elektrik untuk mengukur intensitas cahaya dan oleh analog-digital converter (ADC) akan mengkonversi data analog ke data digital yang selanjutnya dapat diproses dengan software. Data reflektan yang dihasilkan akan ditransformasikan menjadi bentuk data absorbansi (penyerapan) dengan mengubahnya menjadi log (1/R). Melalui analog-digital converter (ADC) data
25 analog akan dikonversi ke data digital. Selanjutnya diproses dengan Fourier transformation (FFT) untuk menghasilkan spektrum (Buchi, 2005). Aplikasi pengukuran dibuat sesuai parameter uji, yaitu air, abu, protein kasar, lemak kasar, serat kasar, kalsium dan fosfor. Ssampel akan direspon dengan melakukan pre-treatment pada spektra. Berikut ini faktor-faktor dalam membuat spektra kalibrasi dan validasi NIR yang dilakukan secara otomatis oleh Software NIRCal adalah sebagai berikut : 1. Tipe/jenis pretreatment yang dipilih Tipe/jenis pretreatment pada software NIRCal ini terdapat 19 jenis, dimana untuk melakukan kalibrasi dapat menggunakan satu atau dua jenis pretreatment tergantung metode yang digunakan PCR atau PLS. 2. Metode yang dipilih Metode yang digunakan dalam membuat kalibrasi NIR ada 3 (tiga) jenis, yaitu MLR, PCR dan PLS, tetapi yang banyak digunakan adalah PLS dan PCR Cermin kaku Sumber cahaya NIR Cermin bergerak Balok splitter Sampel Gambar 3. Skema interferometer
26 Sumber cahaya NIR Gambar 4. Skema NIR Spectroscopy Pretreatment spektra digunakan untuk memperbaiki dan meminimalkan pengaruh yang tidak diinginkan. Spektra NIR dipengaruhi oleh berbagai parameter seperti variasi kimia dan fisik dari sampel pada proses pengukuran dan perubahan pada spektrometer yang akan mempengaruhi hasil spektrum. Beberapa pengaruh yang umumnya muncul sebagai masalah adalah : serapan yang tumpang tindih, tidak linear, pemisahan cahaya dan gangguan acak data. Salah satu cara untuk memperbaiki masalah tersebut adalah signal spektra original akan ditransformasi secara matematika yang disebut pretreatment. NIRCal membagi jenis data pretreatment dan akan diseleksi oleh NIRCal software. Spektra diperoleh umumnya ditentukan oleh fungsi PRESS (Predicted Residual Error Sum Square) atau jumlah perbedaan antara nilai data uji (original) dan nilai prediksi dari NIR. Pretreatment ditentukan juga oleh panjang gelombang. Adapun rumus PRESS adalah sebagai berikut : N PRESS = (X n Y n ) 2 n=1
27 Keterangan : X n = nilai data uji (original) Y n = nilai prediksi (NIR) n = nomor spektra (data kalibrasi atau validasi) Jenis grafik spektra yang umum dipilih oleh NIRCal software adalah : 1. Normalization by Closure (NC). Jenis grafik ini masih seperti aslinya hanya memperbaiki signal yang diperoleh. Adapun rumusnya menurut (Buchi 2006) sebagai berikut : N.T NC = ---------- N T i i=1 Keterangan : N = jumlah data T = transmisi atau reflektan (NIR) i = nomor spektra (data kalibrasi atau validasi) 2. Turunan pertama BCAP untuk mengeliminasi ordinat linear yang tidak dipakai Rumus kedua dari turunan pertama BCAP sebagai berikut : f(x i+2 ) + f(x i+1 )- f(x i-1 ) f(x i-2 ) f (X i ) = -------------------------------------------- 4 Keterangan ; f = jumlah data yang diturunkan X = ordinat i = nomor spektra (data kalibrasi atau validasi) 3. Vector Normalization to Unit Length (VN) untuk mengurangi variasi dari baseline dan mengeliminasi ordinat linear yang tidak dipakai. Rumus ketiga dari Vector Normalization to Unit Length sebagai berikut : T T VN = ------ = -------------------------- T T 2 i + T 2 2 i+1. T n
28 Keterangan : T = transmisi atau reflektan (NIR) 4. Multiplicative Scatter Correction (MSC full) untuk mengurangi atau meningkatkan pengaruh baseline yang disebabkan oleh pemisahan cahaya. Adapun rumus MSC full sebagai berikut : bt + Ē MSC full = ---------------- b Keterangan : b = slope regresi T = rata-rata E = error 5. Smooth Savitzky-Golay 9 Points untuk mengurangi gangguan dalam spektra dan resolusi spektra serta masih seperti spektra original. Adapun rumus Smooth Savitzky-Golay 9 Points sebagai berikut : ( -21f(X i+4 )+14f(X i+3 )+39f(X i+2 )+54f(X i+1 )+59f(X i )+54f(X i-1 )+39f(X i-2 ) + 14f(X i-3 ) - 21f(X i-4 ) f smooth (X i ) = ---------------------------------------------------------------------------------- 231 Keterangan : f = jumlah data yang diturunkan X = ordinat i = nomor spektra (data kalibrasi atau validasi) Parameter yang diukur dari kalibrasi dan validasi NIR adalah nilai Q, koefisien korelasi (r), Standard Error of Estimation (SEE), Standard Error of Prediction (SEP), konsistensi, bias dan metode NIR (PCR/PLS). Indikator keberhasilan kalibrasi dan validasi NIR adalah : 1. Nilai Q adalah indikator kualitas kalibrasi / validasi NIR secara keseluruhan dengan nilai mendekati 1. 2. Nilai r adalah hubungan antara data uji kimia dengan data uji NIR dengan nilai mendekati 1
29 3. Standard Error of Estimation (SEE) dan Standard Error of Prediction (SEP) adalah standar deviasi yang diperoleh dari proses kalibrasi dan validasi untuk mengukur ketelitian nilai. Semakin kecil semakin baik 4. Bias adalah rata-rata deviasi nilai prediksi NIR dengan nilai kimia mendekati 0 (nol) 5. Konsistensi : perbandingan nilai SEE dan SEP untuk mengukur keakuratan dengan nilai kisaran 80 % - 110 % 6. Metode kalibrasi (PLS/PCR) : teknik analisis multivariat yang dilakukan dengan mereduksi komponen dengan teknik Principal Component Analysis (PCA) dilanjutkan dengan teknik analisis regresi antara komponen utama yang baru terhadap respon Adapun rumus KV hitung dan KV Horwitz adalah : SEE atau SEP KV hitung : ------------------- x 100 % Rata-rata (X) KV Horwitz : 2^1-0.5log(X/100) Keterangan : SEE SEP X : Standar Error of Estimation (data kalibrasi) : Standar Error of Prediction (data validaasi) : Rata-rata (dari data kalibrasi atau validasi) Uji Banding Tahap ini bertujuan untuk memvalidasi metode NIR hasil kalibrasi. Metode uji banding seperti pad Gambar 2, yaitu dengan cara membandingkan metode NIR dan metode kimia. Metode kimia mengacu pada AOAC (2005) dan SNI (1992) seperti pada Tabel 2. Sampel pakan pada penelitian ini menggunakan pakan BR1 dan pakan BR2 sebanyak 63 sampel. Seluruh sampel diuji kadar air dan serat kasar mengacu metode SNI (1992), sedangkan abu, protein kasar, lemak kasar, kalsium dan fosfor mengacu metode AOAC (2005). Selanjutnya sampel tersebut diuji dengan metode NIR hasil kalibrasi.
30 Lama waktu uji menggunakan metode AOAC dan/atau SNI sekitar 3 hari per sampel sedangkan menggunakan metode NIR sekitar 10 menit per sampel. Analisis Data Keakuratan metode NIR dapat dihitung menggunakan perhitungan uji t, yaitu t-hitung t-tabel (Williams & Norris 1990) dan uji ketelitian/ keragaman yaitu Koefisien Varian (KV) (Nasoetion 1970; Wood et al. 1998). Apabila hasil perhitungan metode NIR t-tabel, berarti metode tersebut akurat dengan metode kimia. Hipotesis dari penelitian ini adalah : H 0 : Kandungan nutrisi prediksi dengan NIR = kandungan nutrisi dengan metode kimia H 1 : Kandungan nutrisi prediksi dengan NIR kandungan nutrisi dengan metode kimia