PRAKTIKUM PARASITOLOGI (TM-Pr.4) Praktikum I: Menghitung Telur Cacing Pada Sediaan Tinja Pemeriksaan mikroskopis tinja terhadap parasit metode kwantitatif : 1. Metode Stoll 2. Metode Kato-Katz Membuat Sediaan Tinja Secara Langsung Dengan Metode Kato-Katz Untuk mempermudah identifikasi telur cacing, mahasiswa dianjurkan membawa catatan kuliah/praktikum terdahulu dan/atau atlas parasitologi tentang topik dimaksud. Alat & Bahan: 1. Sampel tinja. 2. Reagensia Kato yang terdiri dari : - Malachite green 3% dalam aquadest - Glycerine - Phenol 6% dalam aquadest 3. Lembar selofan berukuran 22x40 mm. Lembar selofan ini direndamkan selama 24 jam ke dalam reagensia Kato sebelum digunakan. 4. Kawat kasa stainless (60 atau 80 meshs) atau kasa nilon (105 meshs) ukuran 3 cm x 3 cm. 5. Pola: karton persegi ukuran 3 cm x 4 cm x 1.37 mm (tebalnya) dengan lubang berdiameter 6 mm. 6. Kertas minyak. 7. Object glass. 8. Prop karet/botol kecil 9. Lidi dan/atau spatula sebagai aplikator 10. Pinset 11. Sarung tangan Cara kerja: 1. Taruh sampel tinja di atas kertas minyak. 2. Tekan bagian atas tinja dengan kasa. Tinja halus yang keluar melalui kasa diambil dengan lidi/spatula. 3. Pada object glass yang bersih dan bebas debu/lemak, dengan menggunakan aplikator letakkan sampel tinja ke dalam lubang karton pola sampai penuh, lalu angkat karton pola sehingga sampel tinja tertinggal pada object glass sebanyak isi lobang karton. 4. Menutup tinja tersebut dengan lembar selofan yang sudah disiapkan. 5. Selofan ditekan-tekan perlahan dengan prop karet/botol kecil sampai tinja di bawahnya tersebar serata mungkin di bawah selofan. 6. Keringkan larutan yang berlebihan dengan cara membalikkan object glass sebentar pada kertas saring/tisu sambil menekan perlahan sehingga cairan sisa terserap, kemudian dibalikkan kembali. 7. Diamkan selama 15 menit pada suhu kamar. Sediaan siap diperiksa di bawah mikroskop dengan pembesaran objektif 10 x. 8. Hitung telur cacing yang ada pada semua tinja di sediaan ini. 9. Volume tinja per pola : 41.7 mg. Maka untuk mendapatkan jumlah telur per gram tinja (EPG : Eggs Per Gram) = hasil x 24.
Interpretasi hasil pemeriksaan: Classes of intensity for soil transmitted helminthes (WHO, 2002) Parasit Light-intensity infections Moderate-intensity infections Heavy-intensity infections A.lumbricoides 1-4.999 epg 5000-49.999 epg 50.000 epg T.trichiura 1-999 epg 1000-9.999 epg 10.000 epg Hookworms 1-1.999 epg 2000-3.999 epg 4000 epg PRAKTIKUM PARASITOLOGI (TM-Pr.5) Praktikum II: Plasmodium sp., menghitung kepadatan parasit Plasmodium sp. pada sediaan darah tepi secara mikroskopis Untuk mempermudah identifikasi parasit, mahasiswa dianjurkan membawa catatan kuliah/praktikum terdahulu dan/atau atlas parasitologi tentang topik dimaksud. Pembuatan sediaan h darah: Alat & Bahan: 1. Object glass 2. Kaca penggeser 3. Sarung tangan 4. Kapas alkohol 70 % / alkohol swab 5. Kapas kering 6. Marker untuk memberi label pada slide 7. Lanset steril/hemolet 8. Larutan kerja Giemsa + buffer (perbandingan 1:4) A. Pembuatan sediaan h darah tipis: Cara kerja: 1. Mengambil satu object glass (slide) yang bersih, kering, serta bebas debu dan lemak dan satu kaca penggeser yang berfungsi untuk menyebar darah. 2. Melakukan desinfeksi ujung jari tangan yang akan diambil darahnya dengan alkohol swab dan menunggunya hingga kering. 3. Menusuk jari yang telah didesinfeksi dengan lanset steril/hemolet sedalam 3 mm. 4. Mengh darah yang pertama keluar dengan kapas kering. 5. Meletakkan tetesan darah berikutnya sebanyak 1 tetes (± 10 µl) dan diletakkan di pinggir object glass. 6. Dengan posisi kaca penggeser membentuk sudut 30-45 0 terhadap object glass, sentuh tetesan darah dan biarkan darah menyebar merata di tepi kaca penggeser. Dorong kaca penggeser ke depan dengan cepat dan mantap.
7. Membiarkan sediaan darah menjadi kering dengan cara menganginkan, dan memberi label/nomor kode pada object glass dengan menggunakan marker. 8. Fiksasi sediaan darah dengan methanol selama ± 1 menit. 9. Buang sisa methanol, lalu bubuhi dengan larutan kerja Giemsa secara merata dan biarkan selama ± 20 menit. 10. Membuang sisa zat warna dan membilasnya dengan air mengalir secara perlahan. 11. Mengeringkan sediaan dengan mengangin-anginkannya secara tegak lurus di atas kertas saring atau tisu. Sediaan siap untuk diperiksa. Pembacaan Sediaan Darah Tipis: Sediaan darah tipis biasanya digunakan untuk konfirmasi diagnosa spesies atau untuk mendapat gambaran lebih jelas mengenai morfologi parasit. Bila diperlukan untuk menghitung parasitemia, periksa sediaan darah tipis selama 30 menit untuk mencapai paling sedikit 100.000 eritrosit. Metode Persen untuk menghitung parasitemia pada sediaan darah tipis adalah sebagai berikut: 1. Tentukan lokasi pada sediaan darah tipis dimana eritrosit saling berdekatan tetapi tidak saling bertindihan. 2. Periksa dengan metode sistematik (gunakan kontrol fase mikroskop untuk memeriksa satu lapangan pandang pemeriksaan). 3. Hitung jumlah total eritrosit dalam setiap lapangan pandang. Pada waktu yang sama, hitung pula jumlah eritrosit yang mengandung parasit. 4. Hitung hingga mencapai total 1000-5000 eritrosit. 5. Bagi jumlah parasit dengan jumlah total eritrosit yang dihitung dan kalikan hasilnya dengan 100 untuk menghasilkan persentase eritrosit yang terinfeksi parasit: Eritrosit yang terinfeksi x 100 = n % eritrosit yang terinfeksi Total hitung eritrosit Perkiraan jumlah eritrosit yang terinfeksi parasit < 1 % biasanya dapat diabaikan karena nilai prediktif klinis yang diperoleh minimal, kecuali jika ditemukan Plasmodium falciparum stadium trofozoit atau schizont yang berarti infeksi berat. B. Pembuatan sediaan darah tebal: Cara kerja: 1. Mengambil satu object glass (slide) yang bersih, kering, serta bebas debu dan lemak dan satu kaca penggeser yang berfungsi untuk menyebar darah. 2. Melakukan desinfeksi ujung jari tangan yang akan diambil darahnya dengan alkohol swab dan menunggunya hingga kering. 3. Menusuk jari yang telah didesinfeksi dengan lanset steril/hemolet sedalam 3 mm. 4. Mengh darah yang pertama keluar dengan kapas kering. 5. Meletakkan tetesan darah berikutnya sebanyak +/- 3 tetes (± 30 µl) dan diletakkan ditengah object glass. 6. Dengan menggunakan kaca penggeser, darah tersebut disebar secara sirkular dan searah dengan diameter ± 2 cm.
7. Membiarkan sediaan darah menjadi kering dengan cara menganginkan, dan memberi label/nomor kode pada object glass dengan menggunakan marker. 8. Meletakkan sediaan di atas di atas rak, lalu membubuhinya dengan larutan kerja Giemsa secara merata dan biarkan selama ± 20 menit. 9. Membuang sisa zat warna dan membilasnya dengan air mengalir secara perlahan. 10. Mengeringkan sediaan dengan mengangin-anginkannya secara tegak lurus di atas kertas saring atau tisu. Sediaan siap untuk diperiksa. Pembacaan Sediaan Darah Tebal: 1. Baca slide secara zig-zag menggunakan mikroskop lengkap dengan pembesaran obyektif 100x dan ocular 10x menggunakan minyak immerse. 2. Catat jumlah parasit per mm 3 dengan metode sebagai berikut: Metode ini didasarkan atas jumlah parasit per mm 3 darah pada sediaan darah tebal yang dihitung sesuai dengan jumlah leukosit yang telah ditentukan, dengan standar 8000 leukosit per mm 3. Sebelum mulai menghitung, sejumlah 0.25 µl darah (± 100 lapangan pandang) diperiksa pada sediaan darah tebal untuk menentukan jenis dan stadium parasit yang mungkin ditemukan. Bila sudah pasti, maka metode penghitungan untuk sediaan darah yang positif adalah sebagai berikut: a. Alat penghitung dua tally diperlukan untuk menghitung jumlah parasit dan leukosit secara terpisah. b. Hitung 200 leukosit dan semua parasit. Catat jumlah parasit per 200 leukosit. c. Rumus : Jumlah parasit x 8000 = parasit per mm 3 Jumlah leukosit Hal ini berarti bahwa jika 200 leukosit dihitung maka jumlah parasit dikalikan 40. d. Hitung semua parasit yang ada dan hitung jumlahnya untuk stadium aseksual. e. Hitung jumlah parasit pada fase seksual (gametosit) secara terpisah menggunakan metode yang sama. f. Bila tidak ditemukan parasit setelah pemeriksaan 100 lapangan pandang, hasil pemeriksaan dinyatakan negatif.
Plasmodium sp. Filum: Apicomplexa Subfilum: Sporozoa Klas: Telopsorea Subklas: Haemosporina Famili: Plasmodidae Genus: Plasmodium Plasmodium vivax Stadium cincin muda (early ring form) Perhatikan gambaran cincin dengan satu inti pada sediaan darah dan sediaan darah tebal. Pada stadium ini sulit dibedakan antara P vivax, P ovale, dan P malariae. Stadium cincin lanjut pada sediaan Eritrosit mulai membesar Sitoplasma parasit mulai menebal Dapat dijumpai stippling, yakni bintikbintik Schuffner yang halus tersebar di dalam eritrosit Stadium trofozoit pada sediaan Eritrosit membesar hingga seukuran lekosit Sitoplasma semakin menebal, semakin ameboid pada trofozoit matang Dapat dijumpai pigmen halus bewarna kecoklatan Stadium skizon muda pada sediaan Eritrosit membesar Terdapat lebih dari satu inti di dalam Sitoplasma menyatu (presegmenting stadium) Stadium skizon matang pada sediaan Eritrosit membesar Terdapat 8-24 merozoit di dalam, biasanya 12-18
Makrogametosit (gametosit betina) Eritrosit membesar pada sediaan Sitoplasma bewarna biru Inti relatif lebih kecil dibandingkan pada mikrogametosit, terletak di pinggir Kromatin padat dan terletak meminggir Plasmodium ovale Mikrogametosit (gametosit jantan) Eritrosit membesar pada sediaan Sitoplasma bewarna merah jambu Inti relatif lebih besar dibandingkan pada makrogametosit, terletak di dalam Kromatin padat dan menyebar di dalam Stadium cincin lanjut pada sediaan Eritrosit bisa berbentuk komet Sitoplasma parasit mulai menebal Dapat dijumpai stippling, yakni bintikbintik James yang halus tersebar di dalam eritrosit Stadium trofozoit pada sediaan Eritrosit sedikit membesar dengan fimbria, berbentuk seperti komet Sitoplasma semakin menebal dan ameboid, terutama pada trofozoit matang Dapat dijumpai pigmen halus bewarna kecoklatan Stadium skizon pada sediaan Eritrosit berfimbria Terdapat lebih dari satu inti di dalam Skizon matang mengandung 6-12 merozoit, biasanya 8 Pigmen kecoklatan
Makrogametosit (gametosit betina) Eritrosit agak membesar pada sediaan Sitoplasma berwarna biru Inti relatif lebih kecil dibandingkan pada mikrogametosit, terletak di pinggir Kromatin padat dan terletak meminggir Mikrogametosit (gametosit jantan) Eritrosit agak membesar pada sediaan Sitoplasma bewarna merah jambu Inti relatif lebih besar dibandingkan pada makrogametosit, terletak di dalam Kromatin padat dan menyebar di dalam Plasmodium malariae Stadium cincin Stadium trofozoit Eritrosit terinfeksi tidak membesar, terkadang cenderung mengecil Pigmen kuning atau kecoklatan Sitoplasma cenderung tertarik ke arah dua kutub membentuk pita (band form) Inti meminggir Stadium skizon: Eritrosit tidak membesar Skizon matang memiliki 6-12 merozoit, biasanya 8, tersusun seperti kelopak bunga
Makrogametosit (gametosit betina) Eritrosit tidak membesar pada sediaan Sitoplasma bewarna biru Inti relatif lebih kecil dibandingkan pada mikrogametosit, terletak di pinggir Kromatin padat dan terletak meminggir Mikrogametosit (gametosit jantan) Eritrosit tidak membesar pada sediaan Sitoplasma bewarna merah jambu Inti relatif lebih besar dibandingkan pada makrogametosit, terletak di dalam Kromatin padat dan menyebar di dalam Plasmodium falciparum Stadium cincin muda pada sediaan Perhatikan dan beri tanda pada gambar: Bentuk single chromatin Bentuk double chromatin Bentuk blister Bentuk marginal Dan lain-lain Stadium trofozoit, akan jarang diumpai di dalam sediaan darah tepi bila semakin matang. Perhatikan dan beri tanda pada gambar trofozoit muda: Ukuran eritrosit terinfeksi sama dengan eritrosit normal Sitoplasma semakin menebal Dijumpai bintik-bintik jarang dan kasar di dalam (Maurer s dots) Skizon, sangat jarang dijumpai di dalam sediaan darah tepi, kecuali pada infeksi berat. Eritrosit terinfeksi tidak membesar Mengandung 8-26 merozoit, biasanya 12-18
Plasmodium falciparum Makrogametosit (gametosit betina) Eritrosit tidak membesar pada sediaan Sitoplasma bewarna biru Inti relatif lebih kecil dibandingkan pada mikrogametosit, terletak di pinggir Kromatin padat dan terletak meminggir Stadium cincin muda pada sediaan Perhatikan dan beri tanda pada gambar: Bentuk single chromatin Bentuk double chromatin Bentuk blister Bentuk marginal Dan lain-lain *coret salah satu, atau gambar keduanya bila preparat tersedia Stadium trofozoit, akan jarang diumpai di dalam sediaan darah tepi bila semakin matang. Perhatikan dan beri tanda pada gambar trofozoit muda: Ukuran eritrosit terinfeksi sama dengan eritrosit normal Sitoplasma semakin menebal Dijumpai bintik-bintik jarang dan kasar di dalam (Maurer s dots) Skizon, sangat jarang dijumpai di dalam sediaan darah tepi, kecuali pada infeksi berat. Eritrosit terinfeksi tidak membesar Mengandung 8-26 merozoit, biasanya 12-18 Gametosit Berbentuk seperti pisang Inti Kromatin Pigmen