BAB V HASIL PENELITIAN Penelitian ini menggunakan sediaan dalam bentuk ekstrak etanol 70% batang sarang semut. Saat ini, di pasaran sarang semut dijumpai dalam bentuk kapsul yang mengandung ekstrak etanol 70% batang sarang semut, sehingga hasil penelitian ini diharapkan dapat diaplikasikan di masyarakat. Penelitian menggunakan 28 ekor mencit C3H yang dibagi menjadi 4 kelompok ( (K), dosis 4 mg/hari (), dosis 8 mg/hari () dan dosis 1 mg/hari ()). Untuk menumbuhkan sel adenokarsinoma mamma pada hewan coba, digunakan metode inokulasi (penanaman sel adenokarsinoma mamma dari mencit C3H donor). Pada tiap-tiap kelompok setelah muncul tumor sebelum diberi perlakuan ekstrak sarang semut diambil satu tikus yang kemudian diterminasi dan diperiksa tumor tersebut secara mikroskopis guna memastikan bahwa tumor yang muncul tersebut adalah adenokarsinoma mamma. Sehingga jumlah mencit C3H pada tiap-tiap kelompok setelah dimulainya perlakuan ekstrak sarang semut adalah ekor. Tidak ada mencit C3H yang mati selama penelitian dari awal pemberian perlakuan ekstrak sarang semut hingga minggu ketiga atau akhir penelitian. Data hasil pengamatan pada kelompok kontrol dan ketiga kelompok uji yang masing-masing diberikan ekstrak sarang semut dengan dosis (4 mg/hari), (8 mg/hari), (1 mg/hari) per oral selama 3 minggu berturut-turut dapat digambarkan sebagai berikut : 47
(a) (b) (c) (d) Gambar 5.1 (a) Kelompok kontrol (b) Kelompok (c) Kelompok (d) Kelompok Gambaran mikroskopis sampel adenocarsinoma mamma pada mencit C3H masing-masing kelompok kontrol dan perlakuan yang diterminasi sebelum pemberian ekstrak sarang semut ( HE,40X) 5.1. Volume tumor pada minggu ke 1, 2, dan 3. Pengukuran panjang dan lebar tumor dilakukan setiap minggu dengan menggunakan kaliper (mm). untuk pengukurann volume tumor menggunakan rumus : (panjang x lebar 2 x 0,5).. 45 48
Tabel 5.1. Volume tumor pada minggu ke 1, 2 dan 3 pada tiap-tiap kelompok percobaan. Kelompok Percobaan Perlakuan 1 (4 mg/hari) Perlakuan 2 (8 mg/hari) Perlakuan 3 (1 mg/hari) Volume (mm 3 ) Minggu I Minggu II Minggu III Mean SD Mean SD Mean SD 44,30 42,2 23,48 30,74 13,97 34,35 5,10 9,34 229,13 175,07 113,2 151, 10,43 39,58 35,23 110,04 472,00 402,8 29,18 334,00 P # 0,14 0,131 0,02 Ket. : # ANOVA minggu I p>0,05 ANOVA minggu II p>0,05 ANOVA minggu III p<0,05 103,28 109,29 90,92 130,3 Pengukuran volume tumor pada minggu 1, 2 dan 3 memberikan hasil sebagai berikut : Pada minggu 1, kelompok kontrol 44,3 mm 3 + 13,97 ; dosis 4 mg/hari 42, mm 3 + 34,35 ; dosis 8 mg/hari 23,5 mm 3 + 5,10 ; dan dosis 1 mg/hari 30,7 mm 3 + 9,34. Pada minggu kedua, terjadi peningkatan volume tumor, kelompok kontrol 229,1 mm 3 + 10,43 ; dosis 4 mg/hari 175,1 mm 3 + 39,58 ; dosis 8 mg/hari 113,3 mm 3 + 35,23 dan dosis 1 mg/hari 151,7 mm 3 + 110,04. Pada minggu ketiga, volume tumor tetap meningkat yaitu pada kelompok kontrol 472,0 mm 3 + 103,28 ; dosis 4 mg/hari 402,7 mm 3 + 109,29 ; dosis 8 mg/hari 29,2 mm 3 + 90,92 ; dan dosis 1 mg/hari 334,0 mm 3 + 130,3. 49
500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 1 2 3 Minggu Gambar 5.2. Rerata volume tumor pada minggu 1, 2 dan 3 pada mencit C3H kelompok kontrol dan kelompok uji yang mendapat ekstrak sarang semut (* p < 0,05) Tabel 5.2. Uji normalitas volume tumor tiap kelompok percobaan pada minggu 1, 2 dan 3 Trans Volume Tumor Minggu 1 Trans Volume Tumor Minggu 2 Trans Volume Tumor Minggu 3 Perlakuan Shapiro-Wilk Statistic df Sig 0,920 0,571 0,98 0,875 0,973 0,910 0,958 0,801 0,901 0,855 0,903 0,3 0,903 0,893 0,948 0,928 0,377 0,173 0,394 0,198 0,389 0,332 0,724 0,51 Uji normalitas data volume tumor minggu 1, 2 dan 3 menggunakan uji Saphiro Wilk, menunjukkan bahwa data berdistribusi normal setelah ditransformasi. 50
Tabel 5.3. Uji homogenitas varian volume tumor tiap kelompok percobaan pada minggu 1, 2, 3 Trans Volume Tumor Minggu 1 Trans Volume Tumor Minggu 2 Trans Volume Tumor Minggu 3 Levene Statistic 1,737 0.715 0,450 df1 df2 Sig 3 20 0,192 3 20 0,555 3 20 0,720 Uji homogenitas juga memberikan hasil data homogen pada kelompok kontrol dan uji. Analisis varian menggunakan uji Anova yang memberikan hasil tidak berbeda secara bermakna (p > 0,05) pada kelompok kontrol dan ketiga kelompok uji untuk volume tumor minggu pertama dan kedua sedangkan pada minggu ketiga berbeda secara bermakna p = 0,02 (p < 0,05) Tabel 5.4 Hasil uji beda rerata volume tumor minggu ketiga antar kelompok pada semua mencit Antar kelompok P K-,28 K-,004 K-,041 -,047 -,290 -,317 LSD test Perbedaan rerata volume tumor pada minggu ketiga kelompok kontrol dengan kelompok uji terletak pada uji kedua (8 mg/hari) dan ketiga (1 mg/hari) yang berbeda secara bermakna. 51
Gambar 5.3 Volume tumor mencit antar kelompok 5.2. Berat badan mencit pada minggu 1, 2 dan 3 Berat badan mencit yang diamati tiap minggu menunjukkan terjadinya fluktuasi berat badan pada tiap minggunya. Pada minggu pertama dan kedua hampir semua mencit mengalami peningkatan berat badan. Pada minggu ketiga, hampir semua mencit mengalami penurunan berat badan. 52
Tabel 5.5. Berat mencit pada minggu ke 1, 2 dan 3 pada tiap-tiap kelompok percobaan. Kelompok Percobaan Perlakuan 1 (4 mg/hari) Perlakuan 2 (8 mg/hari) Perlakuan 3 (1 mg/hari) Berat Mencit (g) Minggu I Minggu II Minggu III Mean SD Mean SD Mean SD 1,5 17,01 18,78 19,88 1,34 1,30 1,39 2,09 17,73 17,23 18,75 20,1 1,77 1,52 1,5 2,25 1,3 1,71 1,0 17,11 P # 0,00 0,050 0,97 Ket. : # ANOVA minggu I p<0,05 ANOVA minggu II p=0,05 ANOVA minggu III p>0,05 1,7 2,03 3,0 1,94 Pada minggu 1, kelompok kontrol 1,7 gram + 1,34 ; dosis 4 mg/hari 17,0 gram + 1,30 ; dosis 8 mg/hari 18,8 gram + 1,39 ; dan dosis 1 mg/hari 19,9 mm 3 + 2,09. Pada minggu kedua, terjadi peningkatan berat badan mencit, kelompok kontrol 17,7 gram + 1,77 ; dosis 4 mg/hari 17,2 gram + 1,52 ; dosis 8 mg/hari 18,8 gram + 1,5 dan dosis 1 mg/hari 20,2 gram + 2,25. Pada minggu ketiga, berat badan mencit sebagian besar menurun yaitu pada kelompok kontrol 1, gram + 1,7 ; dosis 4 mg/hari 1,7 gram + 2,03 ; dosis 8 mg/hari 1, gram + 3,0 ; dan dosis 1 mg/hari 17,1 gram + 1,94. 53
20.5000 20.0000 19.5000 19.0000 18.5000 18.0000 17.5000 17.0000 1.5000 1.0000 1 2 3 Minggu Gambar 5.4. Rerata berat badan mencit pada minggu 1, 2 dan 3 kelompok kontrol dan kelompok uji yang mendapat ekstrak sarang semut (* p < 0,05) Uji normalitas data berat badan mencit minggu 1, 2 dan 3 menggunakan uji Saphiro Wilk, menunjukkan bahwa data berdistribusi normal. Tabel 5.. Uji normalitas berat mencit tiap kelompok parcobaan pada minggu 1, 2 dan 3 Berat mencit Minggu 1 Berat Mencit Minggu 2 Berat Mencit Minggu 3 Perlakuan Shapiro-Wilk Statistic df Sig 0,851 0,159 0,951 0,748 0,793 0,051 0,935 0,1 0,841 0,989 0,802 0,889 0,957 0,938 0,907 0,804 0,134 0,987 0,01 0,315 0,798 0,43 0,41 0,04 dan uji. Uji homogenitas juga memberikan hasil data homogen pada kelompok kontrol 54
Tabel 5.7. Uji homogenitas varian berat mencit tiap kelompok percobaan pada minggu 1, 2, 3 Berat Mencit Minggu 1 Berat Mencit Minggu 2 Berat Mencit Minggu 3 Levene Statistic 0,987 0.1 1,32 df1 df2 Sig 3 20 0,419 3 20 0,58 3 20 0,294 Analisis varian menggunakan uji Anova yang memberikan hasil berbeda secara bermakna p = 0,0 (p < 0,05) pada kelompok kontrol dan ketiga kelompok uji pada minggu pertama, sedangkan pada minggu kedua dan ketiga memberikan hasil tidak berbeda secara bermakna p = 0,05 dan 0,97 (p > 0,05). Tabel 5.8. Hasil uji beda rerata berat mencit antar kelompok minggu I Antar kelompok P K-,89 K-,029 K-,002 -,05 -,005 -,238 LSD test Kelompok kontrol pada minggu pertama berbeda secara bermakna dengan uji (8 mg/hari) dan (1 mg/hari). 55
5.3. Nilai AgNOR Sediaan-sediaan yang telah dipulas dengan AgNOR diperiksa secara manual menggunakan mikroskop cahaya pada pembesaran 1000 kali yang ditetesi minyak emersi. Tidak dilakukan penghitungan pada daerah nekrosis, peradangan atau daerah dengan pulasan yang tidak adekuat. Penghitungan butir AgNOR dilakukan pada 100 inti sel tumor secara acak kemudian dihitung nilai rerata AgNOR dalam setiap sediaan. Tabel 5.9. Nilai AgNOR pada tiap-tiap kelompok percobaan. Kelompok Percobaan Perlakuan 1 (4 mg/hari) Perlakuan 2 (8 mg/hari) Perlakuan 3 (1 mg/hari) Nilai AgNOR Mean 5,84 3,17 3,15 4,58 P # 0,002 Ket. : # Kruskal Wallis p<0,05 SD 0,51 1,40 0,52 1,0 Penghitungan butir AgNOR pada kelompok kontrol diperoleh nilai AgNOR 5.8 + 0,51, sedangkan pada kelompok uji dosis 4 mg/hari 3,2 + 1,40 ; dosis 8 mg/hari 3,2 + 0,52 dan dosis 1 mg/hari 4, + 1,0. data tersebut dapat dilihat pada lampiran 9 dan gambar 5.5. Gambaran proliferasi dengan menggunakan pulasan AgNOR dapat dilihat pada gambar 5.. 5
Tabel 5.10. Uji normalitas nilai AgNOR tiap kelompok parcobaan pada minggu 1, 2 dan 3 Nilai AgNOR Perlakuan Shapiro-Wilk Statistic df Sig 0,91 0,827 0,85 0,175 0,981 0,95 9,05 0,405 Uji normalits data nilai AgNOR dengan uji Saphiro Wilk menunjukkan bahwa data terdistribusi normal. Tabel 5.11. Uji homogenitas varian nilai AgNOR tiap kelompok percobaan pada minggu 1, 2, 3 Levene df1 df2 Sig Statistic Trans2 AgNOR 7,53 3 20 0,001 Uji homogenitas memperlihatkan data tidak homogen. Analisis yang digunakan adalah Kruskal Wallis menunjukkan hasil yang bermakna antara kelompok kontrol dan ketiga kelompok uji dengan nilai p = 0,002 (p < 0,05). 7.0000.0000 5.0000 4.0000 3.0000 2.0000 1.0000 0.0000 Kelompok Gambar 5.5. Rerata nilai AgNOR pada mencit C3H kelompok kontrol dan kelompok uji yang mendapat ekstrak sarang semut (* p < 0,05) 57
Tabel 5.12. Hasil uji beda nilai AgNOR antar kelompok Antar kelompok P K-,004 K-,004 K-,025 -,873 -,054 -,037 Mann-whithney test Rerata nilai AgNOR pada kelompok adalah lebih rendah secara bermakna dibandingkan kelompok K (p=0,004) dan hal yang sama didapatkan pada perbandingan antara kelompok dengan K (p=0,004), kelompok dengan kelompok K (p=0,025) serta kelompok dibandingkan (p=0,037). Didapatkan perbedaan tidak bermakna pada kelompok dengan (p=0,873) dan kelompok dengan (p=0,054). Gambar 5.. Pulasan AgNOR pemeriksaan menggunakan mikroskop cahaya dengan pembesaran 1000 kali. 58
Pada parameter proliferasi sel tumor yaitu nilai AgNOR menunjukkan bahwa terdapat daya hambat ekstrak sarang semut terhadap proliferasi sel tumor kelenjar susu mencit C3H pada dosis 4 mg/hari, 8 mg/hari dan 1 mg/hari selama 3 minggu berturut-turut setelah transplantasi tumor. 5.4. Indeks apoptosis Pemeriksaan dilakukan secara acak dengan menggunakan mikroskop fluorescent pembesaran 40 kali. Sel yang mengalami apoptosis dihitung pada 100 sel tumor dalam 1 lapang pandang, sebanyak 5 lapang pandang. Indeks apoptosis dihitung menggunakan rumus : IA = (sel apoptosis/ total sel tumor) x 100%. 43 Tabel 5.13. Rerata Indeks apoptosis pada tiap-tiap kelompok percobaan. Kelompok Percobaan Perlakuan 1 (4 mg/hari) Perlakuan 2 (8 mg/hari) Perlakuan 3 (1 mg/hari) Indeks Apoptosis Mean 1,3 2,90 3,23 2,90 P # 0,000 Ket. : # ANOVA p<0,05 SD 0,55 0,4 0,19 0,35 Penghitungan indeks apoptosis memberikan hasil pada kelompok kontrol diperoleh indeks apoptosis sebesar 1, + 0,55 sedangkan kelompok uji dosis 4 mg/hari 2,9 + 0,4 ; dosis 8 mg/hari 3,2 + 0,19; dosis 1 mg/hari 2,9 + 0,35. 59
3.5000 3.0000 2.5000 2.0000 1.5000 1.0000 0.5000 0.0000 Kelompok Gambar 5.7. Rerata indeks apoptosis pada mencit C3H kelompok kontrol dan kelompok yang mendapat ekstrak sarang semut (*p < 0,05) Secara histopatologis terlihat lebih banyak sel yang mengalami apoptosis pada kelompok,, dan dibandingkan kontrol (gambar 5.8). Sel yang mengalami apoptosis berwarna hijau dan dihitung dari sel tunggal, tidak berada pada daerah nekrosis dan tidak berada pada jaringan penunjang seperti fibroblas. 0
(a) (b) (c) (d) Gambar 5.8. (a) Tunel kelompok skor 5 (b) Tunel kelompok skor 5 (c) Tunel kelompok skor 3 (d) Tunel kelompok kontrol skor 1 Pemeriksaan menggunakan mikroskop fluorescent dengan pembesaran 400 kali. Tabel 5.14. Uji normalitas indeks apoptosis tiap kelompok parcobaan pada minggu 1, 2 dan 3 Indeks Apoptosis Perlakuan Kolmogorov-Smirnov Statistic df Sig 0,191 0,200 0,190 0,200 0,320 0,094 0,303 0,090 1
Uji normalitas data indeks apoptosis dengan uji Kolmogorov-Smirnov menunjukkan bahwa data terdistribusi normal antara kelompok kontrol dengan kelompok uji. Tabel 5.15. Uji homogenitas varian indeks apoptosis tiap kelompok percobaan pada minggu 1, 2, 3 Levene df1 df2 Sig Statistic Indeks apoptosis 2,15 3 20 0,124 Uji homogenitas menunjukkan data homogen. Analisis varian yang dilakukan dengan uji Anova satu arah memberikan hasil terdapat perbedaan bermakna p = 0,000 (p < 0,05) diantara kelompok penelitian, selanjutnya dilakukan uji LSD untuk mengetahui kelompok-kelompok yang memiliki perbedaan bermakna. Tabel 5.1. Hasil uji beda indeks apoptosis antar kelompok Antar Kelompok P K-,000 K-,000 K-,000 -,181-1,000 -,181 LSD test Rerata indeks apoptosis pada kelompok adalah lebih tinggi secara bermakna dibandingkan kelompok K (p=0,000), hal yang sama didapatkan pada perbandingan antara kelompok dengan K (p=0,000) dan kelompok dengan K 2
(p=0,000). Didapatkan perbedaan tidak bermakna pada kelompok dengan (p=0,181), dengan (p=1,000) dan dengan (P=0,181). Hal ini memperlihatkan bahwa pemberian ekstrak sarang semut per oral selama 3 minggu berturut-turut setelah transplantasi tumor, memacu terjadinya apoptosis pada tumor kelenjar susu mencit C3H. 5.5. Perbandingan indeks apoptosis dengan nilai AgNOR Sebelum dilakukan analisa perbandingan indeks apoptosis dengan nilai AgNOR pada kelompok percobaan, dilakukan eksplorasi data terlebih dahulu dengan hasil sebagai berikut: Tabel 5.17. Perbandingan indeks apoptosis dengan nilai AgNOR pada tiap-tiap kelompok percobaan. Kelompok Percobaan Perlakuan 1 (4 mg/hari) Perlakuan 2 (8 mg/hari) Perlakuan 3 (1 mg/hari) Indeks Apoptosis / Nilai AgNOR Mean SD 0,28 0,11 1,14 0, 1,04 0,13 0, 0,19 P # 0,001 Ket. : # Kruskal Wallis p<0,05 Bila besarnya indeks apoptosis dibandingkan dengan proliferasi (nilai AgNOR), maka diperoleh data kelompok kontrol 0,3 + 0,11; pada kelompok uji ekstrak sarang semut dosis 4 mg/hari 1,1 + 0, ; dosis 8 mg/hari 1,0 + 0,13 ; dosis 1 mg/hari 0,7 + 0,19. 3
Tabel 5.18. Uji normalitas perbandingan indeks apoptosis dengan nilai AgNOR tiap kelompok percobaan Indeks Apoptosis / Nilai AgNOR Perlakuan Kolmogorov-Smirnov Statistic df Sig 0,283 0,144 0,253 0,200 0,252 0,200 0,312 0,09 Uji normalitas data perbandingan indeks apoptosis dengan nilai AgNOR menggunakan uji Kolmogorov-Smirnov menunjukkan bahwa data terdistribusi normal antara kelompok kontrol dengan kelompok uji. Tabel 5.19. Uji homogenitas varian perbandingan indeks apoptosis dengan nilai AgNOR tiap kelompok percobaan Trans Indeks apoptosis / Nilai AgNOR Levene df1 df2 Sig Statistic 5,940 3 20 0,005 Uji homogenitas menunjukkan data tidak homogen. Analisis varian yang digunakan adalah Kruskal Wallis memberikan hasil terdapat perbedaan bermakna p = 0,001 (p < 0,05) antara kelompok kontrol dengan ketiga kelompok uji. 4
Tabel 5.20. Hasil uji beda perbandingan indeks apoptosis dengan nilai AgNOR tiap kelompok percobaan Antar kelompok P K-,004 K-,004 K-,004 -,873 -,197 -,015 Mann-whithney test Perbedaan rerata perbandingan indeks apoptosis dengan nilai AgNOR tiap kelompok percobaan secara bermakna terjadi antara kelompok kontrol dengan ketiga kelompok uji (4 mg/hari), (8 mg/hari) dan. (1 mg/hari). 5.. Uji Delta perubahan berat badan mencit Sebelum dilakukan analisa dilakukan eksplorasi data terlebih dahulu. Pada eksplorasi data perubahan berat badan mencit, uji normalitas data dengan uji Shapiro-Wilk didapatkan bahwa berat badan mencit minggu 1 dan berat badan mencit minggu 3 tumor distribusi datanya normal. 5
Tabel 5.21. Uji normalitas berat mencit tiap kelompok percobaan pada minggu 1 dan 3 Berat Mencit Minggu 1 Berat Mencit Minggu 3 Perlakuan Shapiro-Wilk Statistic df Sig 0,851 0,159 0,951 0,748 0,793 0,051 0,935 0,1 0,957 0,938 0,907 0,804 0,798 0,43 0,41 0,04 Pada pengujian homogenitas kelompok variabel dependen dengan Levenes Test didapatkan bahwa data adalah homogen. Tabel 5.22. Uji homogenitas varian berat badan mencit tiap kelompok percobaan pada minggu 1 dan 3 Berat Mencit Minggu 1 Berat Mencit Minggu 3 Levene Statistic 0,987 1,32 df1 df2 Sig 3 20 0,419 3 20 0,294 Penelitian ini dilakukan pada sampel, dilakukan analisa statistik dengan uji delta terhadap variabel dependen perubahanan berat badan mencit. Tabel 5.23. Hasil uji delta pada variabel perubahan berat badan mencit Kelompok Minggu I Minggu III t p mean SD mean SD 1,7 1,34 1, 1,7 0,354 0,98 Perlakuan 1 Perlakuan 2 Perlakuan 3 17,0 18,8 19,9 1,30 1,39 2,09 1,7 1, 17,1 2,03 3,0 1,94 0,73 2,557 8,251 0,495 0,051 0,000
Hasil uji delta perubahan berat badan mencit didapatkan perubahan yang tidak bermakna pada kelompok kontrol (p=0,98), perlakuan 1 (p = 0,495) dan perlakuan 2 (p = 0,051), sedangkan pada perlakuan 3 terdapat perubahan yang bermakna (p < 0,001). 7