Lampiran 1. Skema tahapan penelitian Jintan hitam Digiling Bubuk jintan hitam Didistilasi uap Ulangan Ulangan Direfluks dengan pelarut air Direfluks dengan pelarut etanol (100 ºC, 3 jam) (80 ºC, 2 jam) (80 ºC, 3 jam) (100 ºC, 2 jam) Minyak atsiri (Komponen volatil) Dianalisa aktivitas antimikroba Dianalisa kualitatif komponen alkaloid, flavonoid, terpenoid&steroid, saponin, tanin Ampas (Komponen non-volatil) Direfluks dengan pelarut organik (heksana, etil asetat, metanol) (60 ºC, 3 jam dan 2 jam) Ekstrak heksan, ekstrak metanol, ekstrak etil asetat Dihembus gas N 2 Disaring Disaring Ampas Ekstrak Ampas Ekstrak dikeringkan dikeringkan (oven vakum) (oven vakum) Ekstrak pekat Ekstrak pekat Ditimbang Dianalisa aktivitas antimikroba Dianalisa kualitatif komponen alkaloid, flavonoid, terpenoid&steroid, saponin, tanin Dianalisa aktivitas antimikroba Dianalisa kualitatif komponen alkaloid, flavonoid, terpenoid&steroid, saponin, tanin
Lampiran 2. Diagram alir persiapan kultur bakteri dan uji konfirmasi jumlah mikroba Kultur bakteri Diambil satu ose Dimasukkan ke dalam 10 ml NB steril Diinkubasi 24 jam, suhu 37 ºC Diambil 1 ml Dimasukkan ke dalam 9 ml NB steril Diinkubasi 24 jam, suhu 37 ºC Diamati kekeruhannya Keruh Dipipetl 1 ml Agak bening Dipipet 1 ml Dimasukkan ke dalam Dimasukkan ke dalam 9 ml pengencer steril 9 ml pengencer steril Dilakukan pengenceran dari 10 1-10 8 Dilakukan pengenceran dari 10 0-10 5 Dipipet masing-masing 1ml Dipipet masing-masing 1 ml dari pengenceran 10 5-10 8 dari pengenceran 10 0-10 5 Masing-masing dimasukkan ke dalam cawan petri steril Masing-masing dimasukkan ke dalam cawan petri steril Dituang agar Didiamkan hingga agar membeku Diinkubasi 48 jam, 37 ºC Diamati dan dihitung jumlah koloni Ditentukan jumlah µl NB yang akan dimasukkan ke dalam 25 ml NA cair ( A ) 71
Lampiran 3. Diagram alir uji difusi sumur Kultur mikroba yang telah disegarkan Dipipet sejumlah A (sesuai hasil pada persiapan kultur) Dimasukkan ke dalam botol berisi 25 ml NA cair steril Dituang ke dalam cawan petri steril Dibiarkan beku Dibuat 4 lubang/sumur Lubang A Lubang B Lubang C Lubang D Ditetesi 50 µl Ditetesi 50 µl Ditetesi 50 µl Ditetesi 50 µl DMSO lar antibiotik sampel sampel Diinkubasi 37 ºC, 24 jam Diamati dan diukur area penghambatan tiap sumur Ditentukan ekstrak yang akan diuji nilai MIC 72
Lampiran 4. Contoh perhitungan penentuan jumlah mikroba Jumlah mikroba umur 24 jam = 10 8 sel/ml NB. Jumlah sel yang diinginkan dalam agar (NA) = 10 5 sel/ml agar Jumlah agar dalam 1 cawan = 25 ml Jumlah NB (yang mengandung 10 8 sel) yang dimasukkan = 10 5 sel / ml NA x 25 ml NA 10 8 sel / ml NB = 25 x 10-3 ml NB = 25 µl NB 73
Lampiran 5. Hasil uji konfirmasi metode hitungan cawan Jenis bakteri Jumlah sel bakteri yang digunakan saat pengujian Bacillus cereus 2.1 x 10 8 Escherichia coli 3.9 x 10 8 Salmonella Typhimurium 6.2 x 10 8 Pseudomonas aeroginosa 4.1 x 10 8 Staphylococcus aureus 4.2 x 10 8 74
Lampiran 6. Hasil analisis minyak atsiri jintan hitam tanpa penghalusan bahan 75
Lampiran 8. Contoh perhitungan rendemen Rendemen ekstrak etanol Bobot jintan hitam halus = 34.58 gr Bobot ekstrak etanol pekat = 2.9005 gr Rendemen ekstrak etanol = Bobot ekstrak etanol pekat x 100 Bobot jintan hitam halus = (2.9005/34.58) x 100 = 8.39 % Rendemen ekstrak etil asetat Bobot ampas ekstrak heksan = 18.60 gr Bobot ekstrak etil asetat pekat = 0.9454 gr Rendemen ekstrak etil asetat = Bobot ekstrak etil asetat pekat x 100 Bobot ampas ekstrak heksan = (0.9454/18.60) x 100 = 5.08 % Rendemen ekstrak metanol Bobot ampas ekstrak etil asetat = 21.92 gr Bobot ekstrak metanol pekat = 1.8855 gr Rendemen ekstrak metanol = Bobot ekstrak metanol pekat x 100 Bobot ampas ekstrak etil asetat = (1.8855/21.92) x 100 = 8.60 % 77
Lampiran 9. Hasil penghitungan standar eror (SE) Mikroba Simbol Bacillus cereus 1 Escherichia coli 2 Salmonella Typhimurium 3 Pseudomonas aeroginosa 4 Staphylococcus aureus 5 Ekstrak air 14:10 Tuesday, December 10, 1996 1 Variable N Mean Std Error MIKROBA1 2 1.6500000 0.1500000 MIKROBA2 2 0 0 MIKROBA3 2 0 0 MIKROBA4 2 2.9250000 0.0250000 MIKROBA5 2 3.3700000 0.1900000 Ekstrak etanol 14:10 Tuesday, December 10, 1996 2 Variable N Mean Std Error MIKROBA1 2 5.3150000 0.1350000 MIKROBA2 2 1.6700000 0.0200000 Ekstrak etanol 14:10 Tuesday, December 10, 1996 3 Variable N Mean Std Error MIKROBA3 3 5.2000000 0.1903506 MIKROBA4 3 7.0533333 0.2167436 MIKROBA5 3 9.3366667 0.3075350 minyak_atsiri 14:10 Tuesday, December 10, 1996 4 Variable N Mean Std Error MIKROBA1 3 6.0666667 0.1748650 MIKROBA2 3 3.2500000 0.2250185 MIKROBA3 3 4.2300000 0.4063250 MIKROBA4 3 2.2866667 0.2265931 MIKROBA5 3 7.3600000 0.3340659 Ekstrak heksan 14:10 Tuesday, December 10, 1996 5 Variable N Mean Std Error MIKROBA1 3 2.0800000 0.4600000 MIKROBA2 3 0 0 MIKROBA3 3 0 0 MIKROBA4 3 3.7166667 0.8264449 MIKROBA5 3 4.0233333 0.3608478 Ekstrak etil_asetat 14:10 Tuesday, December 10, 1996 6 Variable N Mean Std Error MIKROBA1 3 3.0366667 0.7033570 MIKROBA2 3 2.1466667 0.1894143 MIKROBA3 3 4.1900000 0.3652853 MIKROBA4 3 5.0700000 0.4772141 MIKROBA5 3 3.1700000 0.2151743 Ekstrak metanol 14:10 Tuesday, December 10, 1996 7 Variable N Mean Std Error MIKROBA1 3 4.1766667 0.7096556 MIKROBA2 3 0 0 MIKROBA3 3 3.0800000 0.2454248 MIKROBA4 3 5.5633333 0.4318307 MIKROBA5 3 4.3333333 0.4935698 78
Lampiran 10. Hasil analisis ragam Rancangan Faktorial Acak Lengkap 1 08:45 Friday, December 20, 1996 General Linear Models Procedure Class Level Information Class Levels Values EKSTRAK 6 1 2 3 4 5 6 MIKROBA 5 1 2 3 4 5 Number of observations in data set = 83 Dependent Variable: DIAMETER Rancangan Faktorial Acak Lengkap 2 08:45 Friday, December 20, 1996 General Linear Models Procedure Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 29 437.87556667 15.09915747 37.36 0.0001 Error 53 21.41883333 0.40412893 Corrected Total 82 459.29440000 R-Square C.V. Root MSE DIAMETER Mean 0.953366 17.70784 0.63571136 3.59000000 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F EKSTRAK 5 175.75671308 35.15134262 86.98 0.0001 MIKROBA 4 156.46550143 39.11637536 96.79 0.0001 EKSTRAK*MIKROBA 20 105.65335216 5.28266761 13.07 0.0001 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F EKSTRAK 5 152.72013515 30.54402703 75.58 0.0001 MIKROBA 4 158.82907781 39.70726945 98.25 0.0001 EKSTRAK*MIKROBA 20 105.65335216 5.28266761 13.07 0.0001 79
Lampiran 11. Hasil uji lanjut Duncan Ekstrak Simbol Ekstrak air 1 Ekstrak etanol 2 Minyak atsiri 3 Ekstrak heksan 4 Ekstrak etil asetat 5 Ekstrak metanol 6 Mikroba Simbol Bacillus cereus 1 Escherichia coli 2 Salmonella Typhimurium 3 Pseudomonas aeroginosa 4 Staphylococcus aureus 5 Rancangan Faktorial Acak Lengkap 3 08:45 Friday, December 20, 1996 General Linear Models Procedure Duncan's Multiple Range Test for variable: DIAMETER NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha= 0.05 df= 53 MSE= 0.404129 WARNING: Cell sizes are not equal. Harmonic Mean of cell sizes= 13.52601 Number of Means 2 3 4 5 6 Critical Range.4903.5157.5325.5446.5539 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N EKSTRAK A 6.0569 13 2 B 4.6387 15 3 C 3.5227 15 5 C 3.4307 15 6 D 1.9640 15 4 D 1.5890 10 1 Rancangan Faktorial Acak Lengkap 4 08:45 Friday, December 20, 1996 General Linear Models Procedure Duncan's Multiple Range Test for variable: DIAMETER NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha= 0.05 df= 53 MSE= 0.404129 WARNING: Cell sizes are not equal. Harmonic Mean of cell sizes= 16.58537 Number of Means 2 3 4 5 Critical Range.4428.4657.4808.4918 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N MIKROBA A 5.3771 17 5 B 4.5247 17 4 C 3.7506 16 1 D 2.9471 17 3 E 1.2206 16 2 80
Lampiran 13. Penentuan nilai MIC ekstrak etanol jintan hitam terhadap bakteri Salmonella Typhimurium Konsentrasi (% w/w) Diameter penghambatan (mm) Ulangan 1 Ulangan 2 Rata-rata diameter penghambatan (mm) Ln konsentrasi Kuadrat zona penghambatan (mm 2 ) 10 5.87 5.8 6.48 7.23 6.35 2.30 40.3225 20 8.97 8.82 8.87 8.98 8.91 3.00 79.3881 30 8.8 8.62 8.67 8.5 8.65 3.40 74.8225 40 8.55 8.58 7.43 7.6 8.04 3.69 64.6416 50 8.55 8.13 9.07 7.73 8.37 3.91 70.0569 Keterangan : Nilai yang ditampilkan merupakan hasil pembulatan. Y = a + bx ; Y = Kuadrat zona penghambatan (mm 2 ) dan X = Ln konsentrasi kuadrat zona hambat (mm) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 y = 15.118x + 16.537 0 1 2 3 4 5 ln konsentrasi Kurva (i) Penentuan nilai MIC ekstrak etanol jintan hitam terhadap bakteri Salmonella Typhimurium Y = 15.118X + 16.537 Jika Y=0; X= -1.09386 X = Ln konsentrasi, jadi konsentrasi = 0.3349 (Mt) MIC = 0.25*Mt MIC = 0.25*0.3349 MIC = 0.0837 = 0.084 % (w/w) 82
Lampiran 14. Penentuan nilai MIC minyak atsiri jintan hitam terhadap bakteri Bacillus cereus Konsentrasi (% w/w) Diameter penghambatan (mm) Ulangan 1 Ulangan 2 Rata-rata diameter penghambatan (mm) Ln konsentrasi Kuadrat zona penghambatan (mm 2 ) 10 4.83 5.3 4.13 4.43 4.68 2.30 21.8556 20 8.8 9.77 7.9 8.2 8.67 3.00 75.1111 30 8.33 8.52 9.17 8.77 8.69 3.40 75.6175 40 11.15 11.93 10.32 10.22 10.90 3.69 118.9009 50 12.37 11.63 10.03 10.2 11.06 3.91 122.2867 Keterangan : Nilai yang ditampilkan merupakan hasil pembulatan. Y = a + bx ; Y = Kuadrat zona penghambatan (mm 2 ) dan X = Ln konsentrasi kuadrat zona hambat (mm) 140 120 100 80 60 40 20 y = 62.27x - 120.25 R 2 = 0.9367 0 0 1 2 3 4 5 ln konsentrasi Kurva (ii) Penentuan nilai MIC minyak atsiri jintan hitam terhadap bakteri Bacillus cereus Y = 62.27X 120.25 Jika Y=0; X= 1.931106 X = Ln konsentrasi, jadi konsentrasi = 6.897138 (Mt) MIC = 0.25*Mt MIC = 0.25*6.897138 MIC = 1.724284 = 1.72% (w/w) 83
Lampiran 15. Penentuan nilai MIC ekstrak etil asetat jintan hitam terhadap bakteri Staphylococcus aureus Konsentrasi (% w/w) Diameter penghambatan (mm) Ulangan 1 Ulangan 2 Rata-rata diameter penghambatan (mm) Ln konsentrasi Kuadrat zona penghambatan (mm 2 ) 10 3.67 3.72 4.33 3.40 3.78 2.30 14.2884 20 4.82 4.57 5.67 4.5 4.89 3.00 23.9121 30 4.63 5.15 4.45 5.63 4.96 3.40 24.6016 40 7.3 6.82 6.27 6.9 6.82 3.69 46.5124 50 9.23 7.3 7.7 7.73 7.99 3.91 63.8401 Keterangan : Nilai yang ditampilkan merupakan hasil pembulatan. Y = a + bx ; Y = Kuadrat zona penghambatan (mm 2 ) dan X = Ln konsentrasi 70 60 50 y = 27.903x - 56.322 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 ln konsentr asi Kurva (iii). Penentuan nilai MIC ekstrak etil asetat jintan hitam terhadap bakteri Staphylococcus aureus Y = 27.903X 56.322 Jika Y=0; X= 2.0185 X = Ln konsentrasi, jadi konsentrasi = 7.5269 (Mt) MIC = 0.25*Mt MIC = 0.25*7.5269 MIC = 1.8817= 1.88 % (w/w) 84
Lampiran 16. Penentuan nilai MIC ekstrak metanol jintan hitam terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa Konsentrasi (% w/w) Diameter penghambatan (mm) Ulangan 1 Ulangan 2 Rata-rata diameter penghambatan (mm) Ln konsentrasi Kuadrat zona penghambatan (mm 2 ) 10 3.23-4.12-3.68 2.30 13.5056 20 6.4 6.52 6.37 6.27 6.32 3.00 39.9424 28 8.83 7.55 7.37-7.78 3.33 60.5284 Keterangan : Nilai yang ditampilkan merupakan hasil pembulatan. Y = a + bx ; Y = Kuadrat zona penghambatan (mm 2 ) dan X = Ln konsentrasi 70 60 50 40 y = 44.719x - 90.375 R 2 = 0.9891 30 20 10 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 ln konsentrasi Kurva (iv). Penentuan nilai MIC ekstrak methanol jintan hitam terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa Y = 44.719X - 90.375 Jika Y=0; X= 2.0209 X = Ln konsentrasi, jadi konsentrasi = 7.5455 (Mt) MIC = 0.25*Mt MIC = 0.25*7.5455 MIC = 1.8864 = 1.88 % (w/w) 85
86
Lampiran 7.Hasil analisis minyak atsiri jintan hitam dengan penghalusan bahan 76