BAB III DASAR TEORI. Asam urat (bahasa Inggris: uric acid, urate) adalah senyawa turunan purina

Transkripsi

1 BAB III DASAR TEORI 3.1 Asam Urat Asam urat (bahasa Inggris: uric acid, urate) adalah senyawa turunan purina dengan rumus kimia C5H4N4O3 dan rasio plasma antara 3,6 mg/dl (~214µmol/L) dan 8,3 mg/dl (~494µmol/L) (1 mg/dl = 59,48 µmol/l). Struktur molekul asam urat ditunjukkan pada Gambar 1. Gambar 1. Struktur Molekul Asam Urat Asam urat merupakan substansi hasil akhir dari metabolisme purin dalam tubuh. Berdasarkan penyelidikan, 90% dari asam urat merupakan hasil katabolisme purin yang dibantu oleh enzim guanase dan xantin oksidase. Asam urat yang berlebihan tidak akan tertampung dan termetabolisme seluruhnya oleh tubuh, maka akan terjadi peningkatan kadar asam urat dalam darah yang disebut sebagai hiperurisemia. Asam urat merupakan hasil samping dari pemecahan sel yang terdapat didalam darah, karena tubuh secara berkesinambungan memecah dan membentuk sel yang baru. Kadar asam urat meningkat ketika ginjal tidak mampu mengeluarkanya melalui feces (Efendi dan Makhfudli, 2009). 9

2 10 Umumnya yang terserang asam urat adalah pria yang telah lanjut usia, sedangkan pada perempuan didapati hingga memasuki menopause. Perjalanan penyakit biasanya mulai dengan suatu serangan atau seseorang memiliki riwayat pernah memeriksakan kadar asam uratnya yang nilai kadar asam urat darahnya lebih dari 7 mg/dl, dan makin lama makin tinggi (Tamher dan Noorkasiani, 2009). Faktor yang menyebabkan penyakit asam urat yaitu pola makan, faktor kegemukan dan lain lain. Diagnosis penyakit asam urat dapat ditegakkan berdasarkan gejala yang khas dan ditemukannya kadar asam urat yang tinggi di dalam darah. Selain itu pengobatan asam urat dapat dilakukan dengan meningkatkan ekskresi melalui ginjal. Ginjal adalah organ yang memiliki fungsi utama untuk menyaring darah dan membuang racun hasil metabolisme maupun racun yang dikonsumsi secara tidak sengaja. Pada lansia sehat, ginjal akan tetap berfungsi baik. Namun bila ginjal mengalami kerusakan yang diakibatkan terutama oleh hipertensi, kencing manis, infeksi berulang, atau batu ginjal, akan terjadi perubahan dalam struktur dan fungsinya. Jaringan akan menumpuk sebagai respon dari perbaikan kerusakan sehingga filter yang ada akan tidak berfungsi. Akibat dari gagal ginjal adalah sesak, muntah hebat hingga kejang yang mengharuskan untuk dilakukan cuci darah (Wahyudi Nugroho dan Silvana E. Linda, 2006). Olahraga yang baik dilakukan oleh lansia antara lain berjalan kaki, senam lansia, senam jantung sehat, yoga sehingga dapat mengurangi resiko berbagai penyakit misalnya hiperusemia, jantung, dan lain-lain. Berdasarkan data tahunan penderita penyakit asam urat dari Puskesmas Mijen Semarang tahun , jumlah penderita penyakit asam urat yaitu 52 orang dengan 23 orang atau sekitar 44,2% merupakan

3 11 para lanjut usia, sehingga dilakukan penelitian yang menggambarkan kadar asam urat di Kelurahan Mijen Semarang. 3.2 Elektrokimia Prinsip Dasar Elektrokimia Analisis elektokimia merupakan metode analisis kuantitatif atau kualitatif yang didasarkan pada sifat-sifat kelistrikan suatu larutan zat yang dianalisis (cuplikan) didalam suatu sel elektrokimia. Di dalam sel elektrokimia dapat dipelajari hubungan-hubungan antara konsentrasi dengan potensial (potensiometri), konsentrasi dengan daya hantar listrik (konduktometri), konsentrasi dengan jumlah muatan listrik (koulometri), konsentrasi dengan potensial dan arus listrik (polarografi dan voltammetri), (Hendayana, dkk., 1994). Reaksi oksidasi dan reduksi merupakan konsep dasar reaksi yang terjadi dalam elektrokimia. Adanya elektron yang berpindah dari suatu spesi atom ke spesi atom yang lain atau pelepasan elektron (oksidasi) dan penangkapan elektron (reduksi) berarti ada elektron yang mengalir (Khopkar, 1990). Aliran elektron merupakan indikasi terjadinya arus listrik. Serah terima elektron mengakibatkan terjadinya perubahan muatan atom-atom yang berikatan atau spesi kimia yang terlibat. Perubahan muatan tersebut yang selanjutnya disebut peristiwa oksidasi dan reduksi atau dikenal sebagai redoks yang dapat memberikan informasi mengenai konsentrasi, kinetika, mekanisme reaksi, dan aktifitas dari spesi dalam larutan.

4 Sel Elektrokimia Sel elektrokimia merupakan seperangkat komponen peralatan dan bahan elektrolit yang dapat menghantarkan arus listrik. Secara umum sel elektrokimia terdiri dari dua elektroda dan penghantar luar. Awal tahun 1950an sebagian besar percobaan elektrokimia menggunakan tiga elektroda dan instrumennya dilengkapi dengan potensiostat (Rieger, 1994). Elektrolit dalam sel elektrokimia dapat berupa leburan atau larutan. Elektroda dicelupkan dalam larutan elektrolit yang sesuai sehingga terjadi kontak antar muka elektroda dengan elektrolit kontak antar muka tersebut menimbulkan potensial sel yang menetukan berlangsungnya reaksi oksidasi dan rduksi (redoks). Setiap proses reduksi dan oksidasi terjadi pada permukaan elektroda dari sel elektrokimia. Kesatuan elektrolit dan elektroda dinamakan setengah sel. Setiap sel elektrokimia terdiri dari dua buah setengah sel. Elektroda yang merupakan tempat terjadinya proses oksidasi disebut anoda. Elektroda yang merupakan tempat terjadinya proses reduksi disebut katoda. Anoda dan katoda dalam sel elektrokimia dihubungkan dengan penghantar untuk mengalirkan elektron sehingga menghasilkan arus listrik. Sel elektrokimia diklasifikasikan sebagai sel galvani dan sel elektrolisis, keduanya berguna dalam analisis elektrokimia. Sel galvani merupakan sel elektrokimia dapat menghasilkan listrik karena terjadinya reaksi kimia yang spontan, sedangkan sel elektrolisis adalah sel elektrokimia yang menggunakan listrik sebagai sumber energi untuk terjadinya reaksi kimia. Sel elektrokimia juga dapat bersifat reversibel dan irreversibel. Reversibel jika arah reaksi elektrokimia

5 13 dapat berbalik ketika arah dari aliran elektron diubah. Irrevrsibel jika pengubahan arus menyebabkan perbedaan ½ reaksi yang terjadi pada salah satu atau kedua elektroda (Skoog,et al., 1992). Elektroanalisis sendiri mempelajari fenomena yang terjadi pada interfase antara permukaan elektroda dan lapisan tipis di sekitar elektroda. Sel elektrokimia biasa digunakan beker gelas yang ditutup dengan tutup yang cocok. Penutup yang digunakan terdapat lubang sebagai tempat elektroda dan dan lubang udara (sebagai lubang inlet/outlet). Terdiri dari tiga elektroda yang dicelupkan dalam larutan elektrolit. Sel elektrokimia juga terdiri dari pelarut, larutan elektrolit, dan spesi elektroaktif, dan jika dibutuhkan ditambahkan reagen. Jika reaksi yang akan diselidiki terdapat gas O2 terlarut yang akan terjadinya reduksi oksigen, untuk itu sebelum melakukan percobaan sebaiknya oksigen terlarut dihilangkan terlebih dahulu karena dapat menyebabkan sinyal katodik yang dapat menginterferensi pengukuran arus, biasanya dengan cara menghilangakan air inert melalui lubang udara misalnya gas nitrogen (N2), argon (Ar), dan helium (He) selama proses analisis (Fifield and Haines, 1995) Bahan yang digunakan untuk pembuatan sel elektrokimia harus dapat dipakai pada temperatur yang lebar, bentuk stabil, tahan terhadap larutan, pelarut organik dan reagen, tahan lama, dan yang terpenting adalah terbuat dari bahan yang transparan, sehingga larutan dan elektrodanya dapat diamati (Sawyer, et al., 1995)

6 Larutan Elektrolit Analisis secara elektrokimia, tidak ada pelarut tunggal yang ideal. Pemilihan pelarut biasanya berdasarkan beberapa faktor diantaranya didasarkan pada konduktifitas, kemampuan melarutkan elektrolit dan elektroaktif analit, aktifitas redoks, dan reaktifitas dengan materi yang diteliti. Pelarut tidak boleh menimbulkan efek adsorbs dari elektroaktif analit pada elektroda. Pelarut juga harus tidak bereaksi dengan analit atau dengan produk dan harus tidak mengalami reaksi elektrokimia pada range potensial berlebih (Gosser, 1993; Rieger, 1993). Larutan elektrolit merupakan kombinasi dari pelarut dan elektrolit pendukung. Pemilihan larutan elektrolit bergantung pada aplikasinya. Larutan elektrolit digunakan untuk mengurangi hambatan dari larutan, menambah konduktifitas dan mengontrol potensial selama penelitian untuk mengurangi efek migrasi elektron yang mempengaruhi arus yang terukur tidak hanya terukur dari analit yang berdifusi melainkan juga dari migrasi (Skoog, et al., 1991), serta mempertahankan agar kekuatan ion konstan (Wang, 1994) Elektoda Pada percobaan secara elektrokimia terdapat 4 parameter yang dapat diukur, yaitu potensial (E), arus (I), muatan (Q), dan waktu (t). elektroda yang dapat digunakan dalam teknik elektrokimia terdiri dari tiga elektroda, yaitu elektroda kerja (WE), elektroda pembanding (RE), dan elektroda kounter/auxiliary electrode (CE), (Siswoyo, et al., 2000).

7 15 a) Elektroda Kerja (WE) Elektroda kerja merupakan elektroda tempat reaksi yang diinginkan terjadi (Underwood, 1986). Karakteristik yang ideal dari elektroda kerja adalah memiliki daerah potensial yang lebar, hambatan kecil, dan permukaan yang reprodusibel. Daerah potensial dari masing-masing elektroda tergantung pada hambatan elektroda dan komposisi dari elektrolit. Daerah potensial dapat disesuaikan dengan elektroda dan larutan elektrolit yang digunakan (Fifield and Haines, 1995). Elektroda kerja digunakan untuk menunjukkan secara tidak langsung jika elektroda ini merespon beberapa ½ reaksi spesifik (Reiger, 1994). b) Elektroda Pembanding Elektroda pembanding merupakan elektroda yang mempunyai potensial elektrokimia konstan sepanjang tidak ada arus yang mengalir dan sama sekali tidak peka terhadap komposisi larutan yang akan diselidiki. Elektroda pembanding digunakan untuk mengukur potensial pada elektroda kerja. Pasangan elektroda pembanding adalah alektroda kerja. Potensial yang akan diukur bergantung pada konsentrasi zat yang akan diselidiki (Hendayana, dkk, 1994). Pemilihan elektroda pembanding harus memperhatikan beberapa faktor yaitu : - Elektroda pembanding harus reversibel dan sesuai dengan persamaan Nerst, - Tegangannya harus konstan setiap waktu,

8 16 - Potensial harus kembali ke nilai dasar setelah arus kecil dilewatkan melalui elektroda (Sawyer, et al., 1995). c) Elektroda kounter (Counter Electrode) Counter Electrode adalah konduktor yang melengkapi sel. Counter Electrode biasanya digunakan konduktor yang bersifat inert seperti platinum dan grafit, tapi dapat digunakan logam yang sama dengan elektroda kerjanya. Arus yang mengalir menuju larutan melalui elektroda kerja selanjutnya akan meninggalkan larutan melalui elektroda kounter. Elektroda kounter dapat sekaligus digunakan sebagai elektroda kerja pada saat arus yang mengalir dalam sel adalah kecil. 3.3 Voltammetri Voltammetri merupakan salah satu metode elektroanalisis skala mikro yang mengkaji informasi tentang analit berdasarkan pengukuran arus (I) sebagai fungsi potensial (V) pada kondisi dimana elektroda indikator atau elektroda kerja mengalami polarisasi. Arus yang diukur adalah arus difusi yaitu arus yang timbul karena adanya proses oksidasi atau reduksi analit elektroaktif pada permukaan elektroda (Skoog, 1991). Voltammetri dikembangkan berdasarkan prinsip polarografi yang dikenal menggunaan tetesan air raksa (Dropping Mercury Electrode, DME) sebagai elektroda kerja, mikroelektroda lebih banyak digunakan dalam teknik voltammetri sebagai elektroda kerja. Elektroda yang terpolarisasi adalah elektroda kerja (WE) pasangannya adalah elektroda pembanding (RE) yang bisa berupa kalomel (Saturated Calomel Electrode, SCE) atau Ag/AgCl. Elektroda kounter (CE) juga digunakan untuk ikut mendukung proses-proses pertukaran

9 17 elektron atau aliran arus dalam sel terutama untuk sistem yang menghasilkan arus yang cukup besar. Teknik voltametri merupakan teknik elektrokimia dinamik (tidak pada arus nol). Proses oksidasi dan reduksi yang terjadi pada permukaan elektroda pada dasarnya merupakan transfer elektron atau transfer muatan. Arus yang diukur dalam ampere atau coulomb/detik dari kecepatan alir muatan. Reaksi elektrokimia pada permukaan elektroda dikendalikan dengan mengaplikasikan potensial pada elektroda. Potensial yang diaplikasikan disebut sinyal eksitasi atau arus yang diukur disebut sinyal hasil (Fifield and Haines, 1995). Respon dari sel elektrokimia sebagai arus direkam dan ditunjukkan dalam kurva arus-potensial disebut voltamogram. Sumbu horizontal sebagai potensial dalam volt sedangkan sumbu vertikal sebagai arus. Arus konstan yang diperoleh setelah peningkatan arus secara tajam adalah arus batas (limiting current) sedangkan arus konstan yang diperoleh sebelum peningkatan arus secara tajam (pengukuran larutan blanko sebelum analit ditambahkan) disebut arus residu (residual current). 3.4 Voltametri Siklik Voltametri merupakan metode elektroanalisis dimana informasi tersebutanalit diterbitkan melalui pengukuran arus sebagai fungsi kemampuan yang dikenakanke elektroda dalam kondisi yang mendorong pengutuban elektroda kerja (Skoog, 1996). Sejarah awal perkembangan metode voltammetri dimulai dariperkembangan metode polarografi yang dipelopori oleh seorang ahli kimia yangberasal dari Republik Ceko bernama Jaroslav Heyrovsky pada tahun Denganpenemuan ini beliau telah dianugerahi hadiah Nobel pada tahun

10 (Heyrovskydan Kuta, 1966). Perbedaan utama antara metode polarografi dan voltammetri adalahpada elektroda kerja. Metode polarografi menggunakan elektroda tetesan raksa (DME)yang membentuk permukaan elektroda baru bagi setiap tetesan raksa, sementaravoltametri menggunakan elektroda tetesan raksa tergantung (HMDE) atau elektrodapadat lain seperti platinum dan karbon sebagai elektroda kerja.pada kondisi yang maksimum (plateau), setiapanalit yang sampai ke permukaan elektroda akan segera mengalami reaksiperpindahan elektron dan ketika itu harga maksimum pembauran akan tercapai(wang, 1994). Informasi kuantitatif dan kualitatif reaksi yang terjadi dapat diperoleh dari kurva yang dihasilkan. Nilai arus membatasi yaitu arus yang terbit dari keterbatasan harga transportasi analit dari larutan massal ke permukaan elektroda sebanding dengan konsentrasi analit di dalam larutan massal dan nilai kemampuan setengah gelombang (E½) adalah fitur bagi spesies yang mengalami reaksi redoks. Dalam metode polarografi, arus menghad dikenal sebagai arus resapan, karena analit diangkut dari curah larutan ke permukaan elektroda melalui proses difusi. Arus resapan ini adalah perbedaan nilai diantara arus membatasi dengan arus sisa. Arus membatasi proporsional dengan konsentrasi analit melalui persamaan Ilkovic (Wang, 1994; Harvey, 2000; Marpongahtun, 2005)menurutPersamaan (1),yaitu: id = 708nCD 1/2 m 2/3 t 1/6 (1) Di mana : id = arus menghad ( A) n = bilangan elektron

11 19 C = kepekatan analit (mm) D = pekali peresapan (cm2 s-1) m = kadar aliran merkuri (mg s-1) t = masa titisan (s) Voltametri siklik termasuk dalam metode pengukuran potensiodinamik elektrokimia. Eksperimen voltametri siklik memiliki proses yang lebih panjang dari Voltammetri penyapuan-linear. Voltammetri siklik dikarakterisasi dari peningkatan potensial elektroda kerja dari potensial awal ke potensial berikutnya dan kembali lagi. Hal ini menunjukkan bahwa potensial awal dan potensial penyapuan adalah parameter yang dapat disesuaikan begitu juga bahan-bahan elektrolit terutama konsentrasi dan temperaturnya dapat juga mempengaruhi. Voltametri siklik mengukur nilai listrik sebagai fungsi aliran potensial dengan rentang potensial awal sama dengan potensial akhir. Perpindahan elektron pada bagian antar muka elektroda-elektrolit terjadi pada saat potensial diubah secara linier dengan laju tertentu sampai suatu potensial tertentu yang memungkinkan senyawa elektroaktif dalam sel mengalami reaksi redoks. Perpindahan elektron ini menyebabkan kenaikan arus mencapai suatu nilai tertentu yang kemudian akan turun kembali. Pada saat turun kembali, potensial dialurkan ke arah sebaliknya sehingga senyawa yang terbentuk mengalami reaksi reduksi bila sebelumnya mengalami oksidasi atau sebaliknya (Wang et al., 2000). Contoh kurva arus pada voltammetri siklik dapat dilihat pada Gambar 2.

12 20 e Gambar 2. Kurva arus pada metode voltametri siklik Voltamogram siklus yang khas terlihat dalam Gambar 2, bentuk kurvanya pada awalnya menyerupai kurva eksperimen penyapuan linear, tetapi setelah potensial mulai turun, terdapat perubahan arus yang cepat disebabkan konsentrasi spesies teroksidasikan tinggi di dekat elektroda. Ketika potensialnya mendekati potensial yang diperlukan untuk mengoksidasikan spesies tereduksi, terdapat arus anoda yang besar sampai oksidasinya sempurna dan arus kembali nol. Bentuk keseluruhan kurva itu memberikan perincian kinetika proses elektroda (Atkins, 1999). Ross et al. (1975) menyatakan bahwa voltamogram siklik dapat digunakan untuk mengetahui perilaku senyawa di permukaan elektroda. Kajian potensiometri dilakukan dengan tidak ada arus yang mengalir dalam sel elektrokimia dan keseimbangan terjadi antara muka elektroda dengan larutan atau elektrolit. Potensial elektroda hanya bergantung pada konsentrasi spesies elektroaktif dalam larutan sesuai dengan persamaan Nerst (Riyanto, 2013).

13 21 Menurut reaksi redoks O + ze R, potensial elektroda dapat ditunjukan oleh persamaan (2). E = E 0 RT zf ln (C R C O ) (2) Dimana E 0 adalah potensial tetap sistem dapat berbalik (reversible system), CR dan Co adalah konsentrasi spesies yang mengalami oksidasi dan reduksi. Jika arus yang mengalir melalui sel elektrolisis dan keseimbangan diantara muka elektroda dengan larutan diganggu, seterusnya potensial elektroda dinaikkan dan konsentrasi spesies elektroaktif dari permukaan elektroda dikontrol dalam nilai yang baru maka kecepatan perpindahan spesies elektroaktif yang terjadi di elektroda akan tetap. Keadaan tetap adalah keadaan dimana fenomena keseimbangan terjadi diantara permukaan elektroda dan larutan, dan keadaan ini bergantung pada waktu. Waktu yang tertentu diperlukan untuk terjadinya perubahan dari keadaan seimbang menjadi keadaan mantap. Dalam keadaan tersebut potensial elektroda, arus, dan konsentrasi spesies diantara elektroda dan larutan bergantung pada waktu. Kebergantungan potensial dan arus terhadap waktu merupakan dasar elektrokimia. Kajian tersebut adalah sangat berguna karena informasi tentang penyerapan perantara dan reaktan dalam reaksi atau semua proses yang terjadi di permukaan elektroda dapat diketahui (Riyanto, 2013). 3.5 Nikel (Ni) Nikel adalah unsur kimia metalik dalam tabel periodik yang memiliki simbol Ni yang terletak pada periode 4 Golongan VIII-B, dengan nomor atom 28 dan massa atom 58,71. Nikel memiliki massa jenis 8,902 g/cm 3, titik lebur 1455 ⁰ C, dan titik didih 2827 ⁰ C. Nikel mempunyai sifat tahan karat. Dalam keadaan murni,

14 22 nikel bersifat lembek, tetapi jika dipadukan dengan besi, krom, dan logam lainnya, dapat membentuk baja tahan karat yang keras (Anonymous B, 2012). Padatan nikel dapat dilihat pada Gambar 3. Gambar 3. Padatan Nikel Unsur nikel berhubungan dengan batuan basa yang disebut norit. Nikel ditemukan dalam mineral pentlandit, dalam bentuk lempeng-lempeng halus dan butiran kecil bersama pyrhotin dan kalpopirit. Nikel biasanya terdapat pada tanah yang terletak diatas batuan basa. Nikel pertama kali ditemukan oleh A.F. Cronstedt pada tahun 1751 merupakan logam berwarna putih keperak-perakan yang berkilat, keras, dan mulur, tergolong dalam logam peralihan, sifat tidak berubah bila terkena udara, tahan terhadap oksidasi dan kemampuan mempertahankan sifat aslinya dibawah suhu yang ekstrim. Karena itu, Nikel lazim digunakan dalam berbagai aplikasi komersial dan industri, seperti : pelindung baja (stainlessteel), industri baterai, elektronik, aplikasi industri pesawat terbang, industri tekstil, turbin pembangkit listrik tenaga gas, alat laboratorium (nikrom), kawat lampu listrik, katalisator lemak, pupuk pertanian, dan berbagai fungsi lainya. Nikel juga sangat

15 23 penting dalam pembentukan logam campuran (Alloy dan super alloy), terutama baja tidak berkarat (stainlesssteel) (Ghanie, 2011). 3.6 Validasi Metode Validasi metode metode menurut USP dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis bersifat akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan pada kisaran analitik yang akan dianalisis. Secara singkat validasi merupakan aksi metode analisis yang akan digunakan sesuai dengan tujuan yang diinginkan (Abdul, 2009). Definisi metode menurut SK Menkes No. 43/MENKES/SK/1998, tentang CPOB adalah tindakan pembuktian dengan cara yang sesuai bahwa bahan, prosedur, kegiatan, sistem, perlengkapan, atau mekanisme dalam produksi dan pengawasan senantiasa mencapai hasil yang diinginkan (Anonim, 2007). Validasi biasanya diperlukan untuk metode analisa yang baru dibuat dan dikembangkan. Sedangkan untuk metode yang memang telah tersedia dan baku (missal dari AOAC, ASTM, dan lainnya), namun metode tersebut baru pertama kali akan digunakan di laboratorium tertentu, biasanya tidak perlu dilakukan validasi, namun hanya verifikasi. Tahapan verifikasi mirip dengan validasi hanya saja parameter yang digunakan tidak selengkap validasi (Wahyu, 2009). Suatu metode analisis harus divalidasi untuk melakukan verifikasi bahwa parameter-prameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi problem analisis karenanya suatu metode harus divalidasi (Abdul, 2009). 1. Metode baru dikembangkan untuk mengatasi problem analisis tertentu.

16 24 2. Metode yang sudah baku direvisi untuk menyesuaikan perkembangan atau ketika munculnya suatu problem yang mengarah bahwa metode baku terebut harus direvisi. 3. Penjaminan mutu yang mengindikasikan bahwa metode baku tela berubah seiring berjalannya waktu. 4. Untuk mendemonstrasikan kesetaraan antara 2 metode Proses Validasi Proses validasi dimulai dengan perangkat lunak yang tervalidasi dan sistem yang terjamin, lalu metode yang divalidasi menggunakan sistem yang terjamin dikembangkan. Akhirnya validasi total diperoleh dengan melakukan kesesuaian sistem. Masing-masing tahap dalam proses validasi ini merupakan suatu proses yang secara keseluruhan bertujuan untuk mencapai kesuksesan validasi (Ibnu, 2008). Ada beberapa alasan valid untuk mengembangkan suatu metode analisis baru yaitu (Ibnu, 2008) : a. Tidak ada metode yang sesuai untuk analit tertentu dalam matriks sampel tertentu. b. Metode yang ada terlalu banyak menimbulkan kesalahan atau metode yang sudah atau tidak reliable (presisi dan akurasinya rendah). c. Metode yang sudah ada terlalu mahal, membutuhkan waktu banyak, energi, atau tidak dapat diotomatisasikan. d. Metode yang sudah ada tidak memberikan sensivitas atau spesifits yang mencukupi pada sampel yang dituju.

17 25 e. Instrumentasi dan teknik yang lebih baru memberikan kesempatan untuk meningkatan kinerja metode tersebut yang meliputi peningkatan identifikasi analit, peningkatan batas deteksi, serta presisi dan akurasi yang lebih baik. f. Ada suatu kebutuhan untuk meningkatkan metode alteratif baik untuk alas an legal atau alasan saintifik Parameter Validasi Menurut USP ada 8 langkah dalam validasi metode analisis yaitu sebagai berikut (Abdul, 2009): Validasi metode, ketahanan, kekasaran, linieritas dan rentang, spesifikasi, batas deteksi, akurasi, presisi, batas kuantifikasi. Sementara itu, ICH membagi karakteristik validasi metode yang sedikit berbeda dengan USP sebagaimana sebagai berikut (Abdul, 2009) : Validasi metode, ketahanan kisaran, linieritas, spesifitas, batas deteksi, akurasi, presisi, batas kuantifikasi, kesesuian sistem. 1. Ketepatan (akurasi) Akurasi merupakan ketelitian metode analisis atau ketepatan antara nilai terukur dengan nilai yang diterima baik nilai konfensi, nilai sebenarnya, atau nilai rujukan akurasi diukur sebagai banyaknya analit yang diperoleh kembali pada suatu pengukuran dengan melakukan spiking pada suatu sampel. Untuk pengujian senyawa obat, akurasi diperoleh dengan membandingkan hasil pengukuran dengan bahan rujukan standar (Standard Rreference Material, SRM)

18 26 Untuk mendokumentasikan akurasi, ICH merekomendasikan kumpulan data dari sembilan kali penetapan kadar dengan tiga konsentrasi yang berbeda (misalnya tiga konsentrasi dengan tiga kali replikasi) data harus dilporkan sebagai presentase perolehan kembali. 2. Presisi Presisi merupakan ukuran kedekatan antara serangkaian hasil analisis yang diperoleh dari beberapa kali pengukuran pada sampel homogen yang sama. Presisi biasanya dilakukan pada tiga tingkatan yang berbeda yaitu : a. Keterulangan (repeatibility) yaitu ketepatan (precision) pada kondisi percobaan yang sama (berulang) baik orangnya, peralatannya, tempatnya, maupun waktunya. b. Presisi antara (intermediate precision) yaitu ketepatan (precision) pada kondisi percobaan yang berbeda, baik orangnya, peralatannya, tempatnya, maupun waktunya. c. Ketertiruan (reproducibility) merujuk pada hasil-hasil dari laboratorium yang lain. 3. Spesifitas Selektivitas atau spesifitas suatu metode adalah kemampuan yang hanya megukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel seperti ketidak murnian produk degradasi dan komponen matriks. Selektivitas seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpanan (degree of bias) metode yang dilakukan terhadap sampel yang

19 27 mengandung bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya dan dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan lain yang ditambahkan. ICH membagi spesifisitas dalam dua kategori yakni uji identifikasi dan uji kemurnian atau pengukuran. Untuk tujuan identifikasi, spesifitas ditunjukkan dengan suatu metode analisis untuk membedakan antar senyawa yang mempunyai struktur molekul yang hampir sama. Untuk tujuan ini kemurnian dan tujuan pengukuran kadar spesifitas ditunjukkan oleh daya pisah dua senyawa yang berdekatan. Senyawa-senyawa tersebut biasanya adalah komponen utama atau komponen aktif dan atau suatu pengotor. Penentuan spesifitas metode dapat diperoleh dengan dua jalan, yang pertama adalah dengan melakukan optimasi sehingga diperoleh senyawa yang dituju terpisah secara sempurna dari senyawa-senyawa lain. Cara kedua untuk memperolah spesifitas adalah dengan menggunakan detektif selektif, terutama untuk senyawa-senyawa yang terelusi secara bersamasama, sebagai contoh detektor elektrokimia atau detektor fluoresen hanya akan mendeteksi senyawa tertentu, sementara senyawa yang lainnya tidak terdeteksi. Selektivitas metode ditentukan dengan membandingkan hasil analisis sampel yang mengandung cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya atau pembawa plasebo dengan hasil analisis sampel tanpa penambahan bahan-bahan tadi.

20 28 Penyaringan hasil jika ada merupakan selisih dari hasil uji keduannya. Jika cemaran dan hasil urai dengan metode yang hendak diuji lalu dibandingkn dengan metode lain untuk pengujian kemurnian seperti kromatografi, analisis kelarutan fase, dan Differential Scanning Calorimetry. Derajat kesesuaian kedua hasil analisis tersebut merupakan ukuran selektivitas. Pada metode analisis yang melibatkan kromatografi, selektivitas ditentukan melalui perhitungan daya resolusi (Rs) 4. Batas Deteksi (Limit of Detection) dan Batas Kuantifikasi (Limit of Quantification) Batas deteksi adalah jmlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blanko batas deteksi merupakan parameter uji batas, batas kuantitasi merupakan parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama (Wahyu, 2009). Batas deteksi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi. Batas deteksi merupakan parameter uji batas. Batas kuantitasi merupakan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akursi yang dapat diterima pada kondisi opersional metode yang digunakan (Abdul, 2009). 5. Linieritas dan Rentang

21 29 Linieritas adalah kemampuan metode analisis memberikan respon proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Rentang metode adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linieritas dapat diterima. 6. Kisaran Kisaran atau metode didefinisikan konsentrasi terendah dan tertinggi yang mana suatu metode analisis menunjukkan akurasi, presisi, dan linieritas yang mencakupi. Kisaran-kisaran konsentrasi yang diuji tergantung pada jenis metode dan kegunaannya untuk pengujian komponen utama (mayor) maka konsentrasi baku harus diukur didekat atau sama dengan konsentrasi kandungan analit yang diharapkan. 7. Kekasaran (Ruggudness) Kekasaran merupakan tingkat reprodusibilitas hal yang diperoleh dibawah kondisi yang bermacam-macam yang diekspresikan sebagai larutan kadar deviasi relatif (persen). Kondisi-kondisi ini laboratorium analis, alat, reagen, dan waktu percobaan yang berbeda. Kekasaran metode analit adalah derajat ketertiruan hasil uji yang diperoleh dari analisis sampel yang sama dalam berbagai kondisi uji normal, seperti laboratorium, analisis, instrumen, bahan pereaksi, suhu, hari yang berbeda, dan lain-lain. Ketangguhan biasanya dinyatakan sebagai tidak adanya pengaruh perbedaan operasi atau lingkungan kerja pada hasil uji.

22 30 Ketangguhan metode merupakan ukuran ketertiruan pada kondisi operasi normal antara laboratoruim dan antar analis. 8. Kekuatan (Robustness) Ketahanan merupakan kapasitas metode analisis untuk tetap tidak terpengaruh oleh adanya variasi parameter metode yang kecil. 9. Uji Kesesuaian Sistem Sebelum melakukan analisis setiap hari seorang analis harus memastikan bahwa sistem dan prosedur yang digunakan harus mampu memberikan data yang dapat diterima Pendekatan Validasi Metode Ada beberapa pendekatan untuk melakukan validasi metode yaitu (Ibnu, 2008) : 1. Metode speaking buta nol (zero blind speaking) Pendekatan metode speaking buta nol ini melibatkan analisis tunggal menggunakan suatu metode yang akan divalidasi untuk melakukan analisis suatu sampel yang menggunakan level analit tertentu yang sudah diketahui, untuk dapat didemonstrasikan perolehan kembalinya, presisinya, dan akurasinya. Secara umum, pendekatan ini cepat, sederhana, dan berguna. Akan tetapi rentang terjadinya hasil yang subjektif. 2. Metode spiking buta tunggal (single blind speaking) Pendekatan metode speaking buta tungal ini melibatkan satu analis yang menyiapkan sampel pada konsentrasi yang bervariasi yang tidak diketahui konsentrasinya untuk diberikan pada analis kedua yang juga

23 31 melakukan analisis sampel. Hasil analisis kedua analis ini selanjutnya dikumpulkan dan dibandingkan. 3. Metode spiking buta ganda (double blind speaking) Pendekatan metode speaking buta ganda ini melibakan tiga analis. Analis pertama menyiapkan sampel pada konsentrasi yang diketahui, analis kedua melakukan analisis sampel dan analis ketiga membandingkan kedua data yang dihasilkan oleh kedua analis. 4. Metode pendekatan kolaburatif antar laboratorium Uji banding antar laboratorium mungkin merupakan prosedur yang paling diterima untuk melakukan validasi metode analisis pendekatan ini. Pendekatan ini sangat mahal dan membutuhkan waktu yang lebih lama bahkan sampai tahunan sehingga metode ini jarang digunakan. 5. Metode pendekatan membandingkan metode baru yang diterima. 6. Membandingkan metode analisis yang akan divalidasi dengan metode analisis yang sudah ada yang telah diterima merupakan suatu pendekatan lain untuk mengembangkan metode analisis. Adanya kesesuaian hasil antara metode baru dengan metode yang telah ada mengarahkan bahwa metode baru tersebut, sebalikya ketidaksesuaian hasil antara metode baru.

24 BAB IV METODE PENELITIAN 4.1 Alat-Alat yang Digunakan 1. Gelas beker 100 ml 2. Pipet ukur 10 ml 3. Pipet ukur 5 ml 4. Pipet tetes 5. Gelas arloji 6. Pengaduk kaca 7. Labu takar 100 ml 8. Labu takar 250 ml 9. Magnetik stirer 10. Perangkat alat Voltametri Siklik (Metrohm) 11. ph meter (KANA) 4.2 Bahan-Bahan yang Digunakan 1. KCl (Merck) 2. H2SO4 (Merck) 3. NaOH (Merck) 4. KHP (Merck) 5. KH2PO4 padatan (Merck) 6. Akuades 7. Asam Urat (Merck) 8. Sampel Urin 32

25 Cara Kerja Pembuatan Larutan KCl 0,1 M, H2SO4 0,1 M dan NaOH 0,1 M 1. Ditimbang KClsebanyak 1,86 gram dan H2SO4 sebanyak 1,39 ml dan 1 gram NaOH menggunakan gelas arloji dan dimasukkan dalam tiga gelas beker 250 ml yang berbeda. 2. Dimasukkan dalam tiga labu takar 250 ml yang berbeda. 3. Larutan yang sudah dimasukkan kedalam labu takar 250 ml kemudian ditambah akuades sampai tanda batas PembuatanBuffer ph 4, 7, dan Untuk membuat 100 ml larutan KHP 0,l M;ditimbang 2,0422 gram padatan KHP dengan menggunakan kaca arloji. Dimasukkan dalam gelas beker 100 ml dan dilarutkan dalam aquades hingga homogen. Larutan di pindahkan ke dalam labu takar 100 ml dan ditambah dengan akuades sampai tanda batas. 2. Untuk membuat 100 ml larutan KH2PO4 0,1M; ditimbang sebanyak 1,3609 gram padatan KH2PO4 dengan menggunakan kaca arloji. Dimasukkan kedalam gelas beker 100 ml dan ditambah dengan akuades, larutan diaduk hingga homogen. Larutan yang sudah homogen di pindahkan ke dalam labu takar 100 ml dan diencerkan dengan akuades sampai tanda batas. 3. Untuk membuat 100 ml larutan NaHCO3 0,05 M; ditimbang 0,42005 padatan NaHCO3 dengan menggunakan kaca arloji. Kemudian dimasukkan dalam gelas beker 100 ml dan dilarutkan dengan akuades hingga homogen. Larutan dipindahkan ke dalam labu takar 100 ml dan diencerkan dengan

26 34 akuades hingga tanda batas. 4. Untuk membuat larutan buffer ph 4, 7, dan 10. Dimasukkan 100 ml larutan KHP 0,1 M; KH2PO4 0,1M; dan NaHCO3 0,1 M kedalam tiga gelas beker ukuran 250 ml yang berbeda. Kemudian dipasang ph meter sambil dialiri NaOH 0,1 M sedikit demi sedikit meggunakan buret sampai terbentuk ph buffer 4, 7, dan Pembuatan Larutan Standar Asam Urat 0,1 M 1. Untuk membuat larutan standar asam urat 0,1 M ditimbang 1,6811 gram serbuk asam urat menggunakan kaca arloji. 2. Dilarutkan dengan 100 ml NaOH 1 M. 3. NaOH 1 M dimaukkan kedalam gelas beker kemudian diaduk sambil dipanaskan. 4. Serbuk asam urat dimasukkan sedikit demi sedikit sampai benar-benar larut Penentuan Elektrolit Optimum dan ph Optimum 1. Dipasang elektroda nikel disisi kanan dan elektroda Pt disisi kiri serta elektroda rujukan (AgCl) dipasang ditengah dan elektroda dihubungkan dengan kabel yang sesuai. 2. Dibersihkan sel dan eletroda yang akan dipakai dengan menggunakan aquades dan dikeringkan dengan tisu sampai benar-benar bersih. 3. Diambil 5 ml larutan elektrolit dengan menggunakan pipet volume 5 ml dan 20 akuades dengan menggunakan pipet volume 20 ml, dimasukkan dalam sel elektrolisis kemudian dianalisis dengan menggunakan siklik voltametri.

27 35 4. Dilakukan pengulangan analisis langkah 2 dan 3, pada langkah 3 elektrolit yang digunakan yaitu KCl, H2SO4, NaOH 0,1 M dan buffer ph 4,7, dan 10 di analisis secara bergantian kemudian akuades diganti dengan dengan menggunakan 20 ml asam urat 0,003 M. 5. Dibandingkan voltamolgram yang dihasilkan Pengujian Variasi Konsentrasi Asam Urat 1. Dipasang elektroda nikel disisi kanan dan elekroda platina disisi kiri serta elektroda rujukan (AgCl) dipasang ditengah dan elektroda dihubungkan dengan kabel yang sesuai. 2. Dibersihkan sel dan elektroda yang akan dipakai dengan menggunakan aquades dan dikeringkan tisu sampai benar-benar bersih. 3. Diambil 5 ml larutan elektrolit NaOH 0,1 M menggunakan pipet volme 5 ml dan 20 ml akuades dengan menggunakan pipet volume 20 ml, dimasukkan dalam sel elektrolisis. 4. Dilakuan pengulangan analisis pada langkah kerja 2-3, dimana pada langkah 3 akuades diganti dengan menambah larutan standar asam urat dengan konsentrasi masing-masing 0,001 M; 0,002 M; 0,003 M; 0,004 M; dan 0,005 M serta dengan ph 4, 7, dan 10 secara bergatian. 5. Dibandingkan voltamolgram yang dihasilkan. 6. Ditentukan elektrolit optimum serta ph optimum Preparasi Sampel 1. Diambil sebanyak 5 ml sampel urin dan 5 ml larutan elektrolit NaOH 0,1

28 36 M. 2. Dimasukkan dalam labu takar 25 ml. 3. Dibuat sampel dari larutan standar asam urat konsentrasi masing-masing 0 M; 0,001 M; 0,002 M; 0,003 M; 0,004 M; 0,005 M dalam labu takar yang berbeda yang telah terisi urin dan NaOH 0,1 M Penentuan Presisi Pengukuran 1. Dipasang elektroda nikel disisi kanan dan elekroda platina disisi kiri serta elektroda rujukan (AgCl) dipasang ditengah dan elektroda dihubungkan dengan kabel yang sesuai. 2. Dibersihkan sel dan elektroda yang akan dipakai dengan menggunakan aquades dan dikeringkan tisu sampai benar-benar bersih. 3. Diambil 5 ml larutan elektrolit NaOH 0,1 M dan 5 ml urin menggunakan pipet volume 5 ml dan 20 akuades dengan menggunakan pipet volume 20 ml, dimasukkan dalam sel elektrolisis. 4. Dilakuan pengulangan analisis pada langkah kerja 2-3 dengan menambah larutan standar asam urat dengan konsentrasi masing-masing 0,001 M; 0,002 M; 0,003 M; 0,004 M; 0,005 M sebanyak 15 ml secara bergatian. 5. Dilakukan pengulangan analisis pada langkah 1-4 sebanyak 6 kali Penentuan Akurasi 1. Dipasang elektroda nikel disisi kanan dan elektroda platina disisi kiri serta elektroda rujukan (AgCl) dipasang ditengah dan elektroda dihubungkan dengan kabel yang sesuai. 2. Dibersihkan sel dan elektroda yang akan dipakai dengan menggunakan

29 37 aquades dan dikeringkan tisu sampai benar-benar bersih. 3. Diambil 5 ml NaOH 0,1 M; 5 ml urin dan 15 ml larutan standar asam urat 0,003 M kemudian dianalisis sebagai C1. 4. Diambil 5 ml NaOH 0,1 M; 5 ml urin, dan 15 ml akuades kemudian dianalisis sebagai C2 5. Diambil 5 ml NaOH 0,1 M; 5 ml akuades; dan 15 ml standar asam urat 0,003 M kemudian dianalisis sebagai C3 6. Dilakukan perhitungan berdasarkan data voltamogram yang diperoleh untuk menentukan recovery Penentuan Linieritas, Limit Deteksi (LOD), dan Limit Kuantifikasi (LOQ) 1. Dipasang elektroda nikel disisi kanan dan elekroda platina disisi kiri serta elektroda rujukan (AgCl) dipasang ditengah dan elektroda dihubungkan dengan kabel yang sesuai. 2. Dibersihkan sel dan elektroda yang akan dipakai dengan menggunakan akuades dan dikeringkan tisu sampai benar-benar bersih. 3. Diambil 5 ml larutan elektrolit NaOH 0,1 M menggunakan pipet volume 5 ml dan 20 ml akuades dengan menggunakan pipet volume 20 ml, dimasukkan dalam sel elektrolisis. 4. Dilakuan pengulangan analisis pada langkah kerja 2-3, dimana pada langkah 3 akuades diganti dengan menambah larutan standar asam urat dengan konsentrasi masing-masing 0,001 M; 0,002 M; 0,003 M; 0,004 M; dan 0,005 M secara bergatian.

30 38 5. Voltamolgram yang dihasilkan ditentukan kurva kalibrasi, limit deteksi (LOD), dan limit kuantifikasi (LOQ).