HASIL. Karakteristik, Morfologi dan Fisiologi Bakteri Nitrat Amonifikasi Disimilatif

Transkripsi

1 HASIL Karakteristik, Morfologi dan Fisiologi Bakteri Nitrat Amonifikasi Disimilatif Hasil konfirmasi kemurnian dari keempat isolat dengan metoda cawan gores, morfologi koloninya berbentuk bulat, elevasi tombol dan cembung, tepian licin. Faktor pembeda keempat isolat adalah warna koloni (Gambar 5). Gambar 5 Morfologi koloni dari isolat LF6, HF7, FR2 dan FR1 pada medium denitrifikasi Secara mikroskopis sel isolat LF6, HF7, FR2 dan FR1 berupa bakteri Gram negatif dan berbentuk batang (Tabel 1).

2 Tabel 1 Karakterisasi morfologi dan fisiologi isolat LF6, HF7,FR2, dan FR1 No Isolat Bentuk Sel Pewarnaan Morfologi Koloni Gram Bentuk Warna 1 LF6 Batang negatif Bulat, elevasi cembung, tepian licin 2 HF7 Batang negatif Bulat, elevasi cembung, tepian licin 3 FR2 Batang negatif Bulat, elevasi tombol, tepian licin 4 FR1 Batang negatif Bulat, elevasi tombol, tepian licin Putih susu Krem kuning Kuning oranye Kuning pucat Hasil uji fermentatif dengan menggunakan glukosa dan indikator brom cressol purple menunjukkan keempat isolat merupakan kelompok bakteri fermentatif (Gambar 6). Hal ini ditunjukkan dengan adanya perubahan warna medium dari ungu menjadi kuning. Kecepatan untuk merubah warna medium dari keempat isolat berbeda. Isolat LF6 dan HF7 (asal muara Sungai Cisadane) merubah warna medium glukosa dan indikator brom cressol purple dari ungu menjadi berwarna kuning dalam waktu 24 jam. Perubahan warna medium oleh isolat FR1 dan FR2 (asal muara Sungai Cimandiri) memerlukan waktu 36 jam dan 48 jam. Selain perubahan warna akibat asam organik hasil fermentasi yang meningkatkan derajat keasaman (menurunkan ph) medium, pembentukan gas karbon dioksida (CO 2 ) sebagai hasil fermentasi juga dapat diamati pada tabung durham.

3 Gambar 6 Hasil uji fermentatif pada isolat FR1, FR2, HF7 dan LF6, setelah inkubasi 48 jam Densitas Sel Isolat Bakteri DNRA pada Konsentrasi O 2 yang Berbeda Empat isolat bakteri DNRA yang ditumbuhkan pada konsentrasi oksigen berbeda, sumber karbon asetat, masa inkubasi 96 jam menunjukkan kerapatan (densitas) sel yang berbeda (Gambar 7). Secara umum densitas sel keempat isolat lebih rendah pada konsentrasi oksigen (saturasi udara) %, yaitu antara OD,6 sampai,28 (62 nm). Densitas sel tertinggi pada konsentrasi saturasi udara % adalah isolat FR1 yaitu dengan OD sebesar,28. Pada konsentrasi saturasi udara 1-1% densitas sel cenderung lebih tinggi dari konsentrasi saturasi udara %. Pada konsentrasi saturasi udara 3%, 5% dan 8% kecenderungan densitas keempat isolat tidak seluruhnya lebih tinggi dari konsentrasi saturasi udara sebelumnya. Densitas tertinggi dari keempat isolat terdapat pada konsentrasi saturasi udara 1% yaitu dengan OD antara,27 sampai,42 (62 nm). Kecenderungan peningkatan densitas sel isolat FR1 sejalan dengan penambahan konsentrasi saturasi udara lebih nyata dari isolat lainnya. Densitas sel isolat FR1 lebih tinggi dari pada tiga isolat lainnya pada saturasi udara %, 3%, 5%, 8% dan 1%. Densitas sel terendah pada konsentrasi saturasi udara 1 % adalah isolat LF6 dengan OD,27.

4 .5.4 OD (62nm) % 1% 1% 3% 5% 8% 1% Konsentrasi Saturasi udara (%) Gambar 7 Densitas sel isolat LF6, HF7, FR2, dan FR1 pada konsentrasi saturasi udara yang berbeda, setelah diinkubasi selama 96 jam pada suhu ruang (29-31) C. LF6 HF7 FR2 FR1 Aktivitas Reduksi Nitrat Bakteri DNRA pada Konsentrasi Oksigen yang Berbeda Berdasarkan hasil uji nitrat (NO 3 - ) terhadap isolat FR1, FR2, HF7, dan LF6 menunjukkan kemampuan yang berbeda dalam mereduksi nitrat. Konsentrasi nitrat tereduksi oleh keempat isolat dengan nitrat awal sebanyak 49,41 mm, sumber karbon asetat setelah diinkubasi 4 hari adalah diatas 45 mm (Gambar 8). Jumlah nitrat tereduksi (mm % 1% 1% 3% 5% 8% 1% Konsentrasi Saturasi udara (%) Gambar 8 Jumlah nitrat tereduksi oleh isolat LF6, HF7, FR2, dan FR1 pada konsentrasi saturasi udara yang berbeda, setelah diinkubasi selama 96 jam pada suhu ruang (29-31) C LF6 HF7 FR2 FR1

5 Secara umum kecenderungan konsentrasi nitrat tereduksi lebih besar pada konsentrasi saturasi udara lebih kecil. Reduksi nitrat terbesar terjadi pada konsentrasi saturasi udara %. Konsentrasi nitrat tereduksi cenderung menurun seiring dengan peningkatan konsentrasi saturasi udara. Dari hasil uji nitrit (NO - 2 ), isolat FR1 mengakumulasi nitrit paling tinggi dibandingkan isolat lainnya. Akumulasi nitrit tertinggi terjadi pada konsentrasi saturasi udara 1% (Gambar 9), yaitu 4,95 mm. Isolat LF6, HF7 dan FR2 pada akhir masa inkubasi masih mengakumulasi nitrit. Konsentrasi nitrit tertinggi pada isolat LF6 adalah,5 mm. Isolat HF7 dan FR2 mengakumulasi nitrit paling tinggi pada akhir masa inkubasi dengan konsentrasi yang sama yaitu,3 mm (Lampiran 5 dan 6). 5. Akumulasi nitrit (mm % 1% 1% 3% 5% 8% 1% Konsentrasi Saturasi udara (%) Gambar 9 Jumlah nitrit terakumulasi dari isolat LF6, HF7, FR2, dan FR1 pada konsentrasi saturasi udara yang berbeda, setelah diinkubasi selama 96 jam pada suhu ruang (29-31) C LF6 HF7 FR2 FR1 Pada uji amonium (NH + 4 ), isolat LF6 dan HF7 menghasilkan amonium lebih tinggi dari isolat lainnya (Gambar 1), sehingga diperkirakan gas yang terbentuk pada kedua isolat bakteri tersebut lebih kecil dibandingkan isolat FR1 dan FR2. Konsentrasi amonium tertinggi yang dihasilkan isolat LF6 adalah sebesar 15,2 mm (3,95%) pada konsentrasi saturasi udara %. Isolat HF7 menghasilkan amonium sebesar 14,77 mm (3,29%) pada konsentrasi saturasi udara % (Lampiran 5).

6 Amonium yang dihasilkan (mm % 1% 1% 3% 5% 8% 1% Konsentrasi Saturasi udara (%) Gambar 1 Jumlah amonium yang dihasilkan dari isolat LF6, HF7, FR2, dan FR1 pada konsentrasi saturasi udara yang berbeda, setelah diinkubasi selama 96 jam pada suhu ruang (29-31) C. LF6 HF7 FR2 FR1 Perkiraan pembentukan gas N 2 O dari keempat isolat menunjukkan bahwa keempat isolat tersebut dapat menghasilkan gas yang besar, pada medium dengan konsentrasi nitrat yang tinggi. Isolat yang paling sedikit menghasilkan gas N 2 O adalah isolat HF7 sebesar 29,62 mm (64,63%) pada konsentrasi saturasi udara 5%, dan isolat LF6 sebesar 31,61 mm (66,15 %) pada konsentrasi saturasi udara 1% (Lampiran 5). Perbandingan konsentrasi nitrat tereduksi, nitrit terakumulasi, amonium dan estimasi gas N 2 O yang dihasilkan dari setiap isolat pada kondisi saturasi udara berbeda setelah diinkubasi 96 jam pada suhu ruang (29-31) C dapat dilihat di Lampiran 7 dan Lampiran 8. Berdasarkan hasil uji fermentatif, analisis nitrat, nitrit, amonium dan estimasi gas N 2 O pada keempat isolat dipilih isolat HF7 dan LF6 untuk diamati kinetika aktivitas reduksi nitratnya. Dasar pemilihan kedua isolat adalah pada uji fermentatif kedua isolat lebih cepat memfermentasi glukosa. Aktivitas reduksi nitrat isolat HF7 dan LF6 lebih tinggi dibandingkan isolat FR1 dan FR2. Kedua isolat menghasilkan amonium lebih banyak dengan akumulasi nitrit yang kecil. Isolat HF7 dan LF6 diduga menghasilkan gas N 2 O lebih kecil dari isolat FR1dan FR2. Kedua isolat memiliki perbedaan pengaruh pertumbuhan dan aktivitas

7 reduksi nitrat pada konsentrasi saturasi udara yang relatif kecil (1 % dan 1%) dibandingkan dengan konsentrasi saturasi udara besar (1%). Pertumbuhan Isolat Terpilih Dua isolat terpilih HF7 dan LF6 yang ditumbuhkan pada konsentrasi saturasi udara 1%, 1%, dan 1%, sumber karbon asetat, suhu ruang (29-31) o C, dengan konsentrasi nitrat 49,41mM menunjukkan pertumbuhan yang berbeda. Kerapatan sel pada awal pertumbuhan dikondisikan sama yaitu pada OD,3 (62 nm) dengan inokulan berumur 24 jam. Perubahan populasi sel atau pertambahan jumlah sel dari jumlah inokulan sebelumnya pada isolat HF7 dengan saturasi udara 1% lebih cepat dibandingkan dengan isolat LF6 (Gambar 11). Kecepatan pertumbuhan kedua isolat pada konsentrasi saturasi udara 1% paling tinggi. Kecepatan pertumbuhan pada konsentrasi saturasi udara 1 % pada kedua isolat lebih tinggi dari konsentrasi saturasi udara 1%. Fase eksponensial dimulai dari 12 jam pertama sampai jam ke 48 pada isolat HF7 saturasi udara 1%. Pada isolat HF7 kondisi saturasi udara 1% dan isolat LF6 pada kondisi saturasi udara 1% dan 1% fase eksponensial mulai jam ke 12 sampai jam ke 6. Sementara itu pada konsentrasi saturasi udara 1 % kedua isolat menunjukkan fase eksponensial sampai jam ke 72 (gambar 11). O D se l (6 2 n m ) Isolat HF O D se l (6 2 nm ) Isolat LF Gambar 11 Pola pertumbuhan isolat HF7 dan LF6 pada konsentrasi saturasi udara berbeda. Saturasi Udara 1% Saturasi udara 1% saturasi udara 1%.

8 Laju pertumbuhan maksimum kedua isolat pada konsentrasi saturasi udara 1%, 1% dan 1% dengan sumber karbon asetat dan nitrat media 49,41mM dapat dilihat pada Gambar 12. Laju pertumbuhan maksimum (sel/jam) % 1% 1% Konsentrasi saturasi udara Gambar 12 Laju pertumbuhan maksimum isolat HF7 dan LF6 pada konsentrasi saturasi udara berbeda. HF7 LF6 Laju pertumbuhan maksimum isolat HF7 dan LF6 pada konsentrasi saturasi udara 1% hampir sama. Pada konsentrasi saturasi udara 1% laju pertumbuhan maksimum isolat HF7 lebih kecil dari isolat LF6. Pada saat konsentrasi saturasi udara 1% laju pertumbuhan maksimum isolat HF7 lebih besar dari isolat LF6. Kinetika Aktivitas Reduksi Nitrat Laju aktivitas reduksi nitrat pada isolat HF7 dan LF6 menunjukkan kemampuan reduksi nitrat terkecil pada konsentrasi saturasi udara 1%. Pada kondisi saturasi udara 1% jumlah nitrat tereduksi lebih besar (Gambar 13). Jumlah nitrat tereduksi pada kedua isolat bertambah seiring dengan pertambahan densitas sel. Reduksi nitrat tercepat pada umumnya terjadi dari inkubasi jam ke 12 sampai jam ke 6, dengan isolat yang diinokulasikan pada umur 24 jam. Umumnya pada fase stasioner reduksi nitrat masih berlangsung lambat, meskipun densitas sel tidak mengalami pertambahan yang signifikan.

9 Nitrat& Amonium (mm) HF7 Saturasi udara 1% Nitrit (mm) Nitrat & amonium (mm) LF6 Saturasi udara 1 % Nitrit (mm) HF7 Saturasi udara 1% LF6 Saturasi udara 1% 2 N itra t & A m o n iu m (m M ) N itrit (m M ) N itrat & amom ium (m M N itrit (mm ) HF7 Saturasi udara 1% LF6 Saturasi udara 1% N itrat A m onium (mm) N itrit (m M ) N itra t & a m o n iu m (m M ) N itrit (m M ) Gambar 13 Aktivitas reduksi nitrat, pembentukan nitrit dan amonium dari isolat HF7 dan LF6 pada konsentrasi saturasi udara 1%, 1% dan 1%. nitrat tereduksi nitrit terbentuk amonium terbentuk

10 Kemampuan mereduksi nitrat isolat HF7 konsentrasi saturasi udara 1% berbeda dengan kondisi lainnya. Isolat tersebut setelah jam ke 6 masih mengalami kenaikan reduksi nitrat yang signifikan sampai jam ke 84(Gambar 13). Hubungan antara kecepatan reduksi nitrat dengan tingkat pertumbuhan sel pada konsentrasi saturasi udara berbeda jelas terlihat pada isolat HF7 dan LF6 (Gambar14). Pada konsentrasi saturasi udara kecil (1%), gradien penurunan konsentrasi nitrat medium oleh kedua isolat paling besar, diikuti konsentrasi saturasi udara 1%. Pada konsentrasi saturasi udara 1% penurunan konsentrasi nitrat lebih kecil dari 1%. Penurunan konsentrasi nitrat sejalan dengan kenaikan jumlah sel. Penurunan konsentrasi nitrat yang signifikan terjadi pada saat pertumbuhan sel-sel isolat fase eksponensial. Setelah inkubasi 96 jam kemampuan menurunkan nitrat media dari isolat HF7 pada kondisi saturasi udara 1%, 1%, dan 1% adalah masing-masing sebesar 93,2%, 8,74% dan 77,81% (Tabel 2). Umumnya kecepatan mereduksi nitrat tinggi dari awal jam ke 12 sampai jam ke 6. Isolat HF7 lebih menunjukkan kemampuan reduksi nitrat yang berbeda pada kondisi saturasi udara berbeda dari pada isolat LF6. Isolat LF6 setelah diinkubasi dalam waktu yang sama mampu menurunkan nitrat media pada kondisi saturasi udara 1%, 1%, dan 1% adalah 8,3%, 79,65% dan 78,17% (Tabel 3).

11 HF7 Saturasi udara 1% LF6 Saturasi udara 1% Konsentrasi nitrat (mm) OD sel (62 nm) Konsentrasi nitrat (mm) OD sel (62 nm) HF7 Saturasi udara 1% LF6 Saturasi udara 1% Konsentrasi nitrat (mm) OD sel (62 nm) Konsentrasi nitrat (mm) OD sel (62 nm) HF7 Saturasi udara 1% LF6 Saturasi udara 1 % Konsentrasi nitrat (mm) OD sel (62 nm) Gambar 14 Perbandingan pertumbuhan sel isolat HF7 dan LF6 dengan penurunan konsentrasi nitrat pada konsentrasi saturasi udara 1%, 1% dan 1%. Konsentrasi nitrat OD sel Konsentrasi nitrat (mm) OD sel (62 nm)

12 Kecepatan rata-rata mereduksi nitrat media oleh koloni isolat HF7 adalah,48 mmj -1,,41 mmj -1,,4 mmj -1 pada saturasi udara 1%, 1%, 1% setelah diinkubasi 96 jam. Selisih kecepatan reduksi nitrat isolat HF7 pada tiap konsentrasi saturasi udara lebih besar. Sementara pada isolat LF6 selisih kecepatan reduksi nitrat pada setiap konsentrasi saturasi udara berbeda tidak menunjukkan perbedaan yang nyata. Kecepatan reduksi isolat LF6 pada saturasi udara 1%, 1%, 1% setelah diinkubasi 96 jam yaitu masing-masing sebesar,41 mmj -1,,41 mmj -1,,4 mmj -. Perbandingan kecepatan rata-rata reduksi nitrat untuk setiap sel isolat HF7 dan LF6 hampir seluruhnya berbanding lurus dengan perbandingan rata-rata kecepatan reduksi koloni isolatnya. Kecepatan rata-rata mereduksi nitrat pada saturasi udara 1%, 1%, 1% setelah diinkubasi 96 jam untuk setiap sel isolat HF7 secara berurut adalah 6,3 x 1-1 mmj -1, 5,1 x 1-1 mmj -1, dan 3,3 x 1-1 mmj -1. Sementara untuk setiap sel isolat LF6 dengan kondisi yang sama secara berurut adalah 2, x 1-1 mmj -1, 2,1 x 1-1 mmj -1 dan 1, x 1-1 mmj -1. Kecepatan rata-rata reduksi nitrat pada setiap sel isolat HF7 dan isolat LF6 pada konsentrasi 1% lebih tinggi. Perbedaan kecepatan reduksi nitrat pada konsentrasi saturasi udara kecil (1%) dengan konsentrasi saturasi udara lebih besar (1%) jelas terlihat. Selisih kecepatan setiap sel isolat HF7 adalah 3 x 1-1 mmj -1. Sementara selisih kecepatan reduksi nitrat untuk setiap sel isolat LF6 pada konsentrasi saturasi udara 1% dengan 1% adalah 1 x 1-1 mmj -1. Jumlah senyawa-senyawa yang dihasilkan dari aktivitas reduksi nitrat bervariasi pada kedua isolat. Isolat HF 7 mengakumulasi nitrit pada jam ke 12 sampai jam ke 24 dan konsentrasinya menurun seiring peningkatan konsentrasi amonium. Setelah inkubasi 96 jam tidak terdapat akumulasi senyawa nitrit. Konsentrasi senyawa nitrit sudah menurun pada inkubasi jam ke 12 (Gambar 13) Pada isolat LF6 terjadi fluktuasi akumulasi senyawa nitrit pada inkubasi jam ke12 sampai dengan jam ke 6. Setelah inkubasi 96 jam pada isolat LF6 terdapat akumulasi senyawa nitrit dalam jumlah kecil yaitu,32% (Tabel 3). Secara umum senyawa amonium terus meningkat berbanding lurus dengan peningkatan jumlah nitrat yang tereduksi. Pada saat senyawa amonium meningkat

13 senyawa nitrit menurun. Konsentrasi nitrit sudah menurun pada inkubasi jam ke 12 (Gambar 13). Amonium yang dihasilkan oleh isolat HF7 dan LF6 setelah inkubasi selama 96 jam dengan sumber karbon asetat pada konsentrasi saturasi udara 1%, 1%, 1% secara berurutan adalah 56,6%, 36,7%, 35,93% dan 41,66%, 36,75%, 38,19%. Perkiraan gas N 2 O yang dihasilkan HF7 dan LF6 secara berurutan adalah 53,2%, 63,93%, 64,6% dan 58,34%, 63,25%, 61,49% (Tabel 2 dan 3). Tabel 2 Aktivitas reduksi nitrat dan senyawa yang dihasilkan isolat HF7 pada konsentrasi saturasi udara 1%, 1% dan 1% setelah inkubasi 96 jam, suhu ruang (29-31) o C Perlakuan saturasi udara Nitrat Awal nitrat tereduksi Nitrit terbentuk Amonium terbentuk Estimasi gas terbentuk mm mm % mm % mm % mm % 1% 49,41 46,7 93,22,, 21,56 56,6 24,51 53,2 1% 49,41 39,9 8,74,, 14,39 36,7 25,51 63,93 1% 49,41 38,45 77,81,, 13,82 35,93 24,63 64,6 Tabel 3 Aktivitas reduksi nitrat dan senyawa yang dihasilkan isolat LF6 pada konsentrasi saturasi udara 1%, 1% dan 1%, setelah inkubasi 96 jam, suhu ruang (29-31) o C Perlakuan Nitrat nitrat Nitrit Amonia Estimasi gas saturasi Awal tereduksi terbentuk terbentuk terbentuk udara mm mm % mm % mm % mm % 1% 49,41 39,68 8,3,, 16,53 41,66 23,15 58,34 1% 49,41 39,36 79,65,, 14,46 36,75 24,9 63,25 1% 49,41 38,63 78,17,12,32 14,75 38,19 23,75 61,49