Bab IV Hasil dan Analisa 4.1 Ekstraksi likopen dari wortel dan pengukurannya dengan spektrometer NIR

Transkripsi

1 Bab IV Hasil dan Analisa 4.1 Ekstraksi likopen dari wortel dan pengukurannya dengan spektrometer NIR Ekstraksi likopen dari tomat dilakukan dengan menggunakan pelarut aseton : metanol dengan perbandingan 7 : 3 (v/v). Berdasarkan beberapa kali ekstraksi jumlah pigmen yang berhasil terekstrak dari 1 kg tomat kurang dari 0,01 g. Jumlah tersebut tidak cukup untuk digunakan untuk proses-proses selanjutnya. Bila dilihat dari sisa ampas buah tomat yang sudah diekstraksi, warna kuning kemerahan masih nampak jelas. Hal tersebut menunjukkan bahwa pigmen belum dapat terekstrak dengan sempurna. Untuk mendapatkan pigmen yang lebih banyak, waktu pengadukan pelarut dan buah tomat yangtelah dihancurkan diperpanjang. Alat pengaduk pun dibuat khusus sehingga dapat mengaduk dengan lebih efektif. Percobaan juga melibatkan peningkatan jumlah konsentrasi aseton. Namun masih saja hasil ekstraksi kurang dari 1mg. Proses selanjutnya adalah pengukuran spektrum sampel dengan menggunakan spektrometer Near 24

2 Infrared (NIR). Mode yang dipakai dalam pengukuran ini adalah reflektan. Spektrum reflektan aseton dapat dilihat pada gambar dibawah ini. 0,6 0,4 0,2 Gb Spektrum reflektan aseton Spektrum yang diperoleh dari spektrometer adalah data dari reflektan atau pantulan dari sampel. Data puncak yang terlihat dari sektrum tersebut bukanlah puncak dari absorbansi sampel. Jika kita ingin mengetahui data dari absorbansi sampel, data reflektan harus diubah menjadi absorban dengan menggunakan rumus A = log 1/R ( A= absorbansi, R = reflektan). Hal ini dilakukan karena nilai absorbansi pada NIR memiliki hubungan linier dengan kandungan pada sampel. Spektrum NIR akan berbeda untuk 25

3 sampel yang mempunyai kandungan yang berbeda. Perbedaan penyusun bahan ini dapat dilihat pada puncak absorbansi spektrum nya [21]. Dengan menggunakan rumus A=log (1/R), maka didapatkanlah spektrum absorbansi untuk aseton seperti pada gambar berikut ini. 2 1 Gb Spektrum absorban aseton Jika spektrum reflektan aseton dan absorban aseton dibandingkan, maka dapat dilihat bahwa posisi lembah pada spektrum reflektan merupakan posisi puncak pada spektrum absorban. Oleh karena itu, kita dapat menemukan puncak spektrum absorban dengan melihat lembah spektrum reflektan. Bila kita ingin mengetahui puncak pada spektrum absorban secara lebih teliti, kita tidak bisa hanya melihat secara langsung pada puncak-puncak dominan pada 26

4 spektrum. Hal itu disebabkan karena ada kemungkinan ditemukannya puncak pada bagian spektrum yang landai yang merupakan kombinasi dari beberapa puncak yang berdekatan. Untuk mengetahui posisi puncak secara lebih teliti, cara yang digunakan adalah dengan mencari turunan kedua dari spektrum absorban tersebut. Seperti yang sudah tertulis diatas, pelarut yang digunakan dalam percobaan ini adalah aseton. Aseton adalah keton yang paling sederhana. Keton yang merupakan gugus karbonil, mepunyai regangan yang sangat kuat pada daerah mid-infrared ( cm -1 ). Walaupun overtone pertamamasih terdapat pada daerah mid-infrared, tapi overtone kedua dapat diamati pada daerah near-infrared. Overtone kedua ini cukup lemah apalagi bila terdapat unsur air didalamya. Walaupun begitu, masih ada beberapa anihidrat yang mungkin berguna untuk menganalisa gugus karbonil dengan spektroskopinir. Berdasarkan gambar spektrum absorban NIR pada gambar 4.1.2, dapat dilihat bahwa aseton mempunyai beberapa puncak yang menojol, antara lain 5100 cm -1 dengan tambahan ban yang terpisah pada 5260 cm -1 yang berhubungan dengan C=O. Ikatan C-H pada metil dapat dilihat pada puncak-puncak spektrum di daerah 5908, 5960 and 5771 cm -1. Puncak pada daerah 7242 dan 7370 dimiliki 27

5 oleh senyawa hidrokarbon, oleh karena itu kedua puncak terpisah ini muncul pada aseton. Puncak pada 4142, 4188 dan 4638 cm -1 berhubungan dengan gugus aril pada aseton. Sebanyak 1 mg likopen yang telah dikeringkan kemudian dicampurkan dengan 10 ml aseton dan diukur spektrumnya dengan menggunakan spektrometer. Gambar adalah spektrum dari campuran aseton-likopen. Pencampuran pigmen dengan pelarut ini dilakukan karena jumlah pigmen yang ada tidak mencukupi untuk pengukuran dengan menggunakan pigmen saja. 2 1 Gb Spektrum campuran aseton dan likopen Dalam spektrumcampuran ini, nampak kontribusi besar dari aseton. Hal tersebut dapat diketahui dari bentuk spektrum yang menyerupai 28

6 spektrum aseton. Spektrum ini mempunyai puncak pada 5097 dan 5240 cm -1 yang berhubungan dengan ikatan C=O. Puncak ini nampak karena aseton merupakan suatu senyawa organik yang mempunyai sebuah gugus karbonik (C=O) terikat pada gugus alkil dan aril. Pada spektrum nampak jelas kontribusi ikatan C=O dan C-H. C-H metil pada gugus karbonil nampak pada bilangan gelombang 5908, 5962, 5771 dan 5623 cm -1. Sedangkan bilangan gelombang 4066, 4142, 4183 dan 4633 cm -1 berhubungan dengan C-H aril. Jika dibandingkan antara spektrum aseton dan campuran aseton pigmen, dapat dilihat perbandingan mencolok pada daerah cm -1. Hal tersebut menunjukkan bahwa kontribusi pigmen yang utama adalah pada daerah tersebut, terutama pada panjang gelombang Puncak pada bilangan gelombang 4000 cm -1, berhubungan dengan C-H mode regangan. Untuk mendapatkan spekrum likopen saja maka spektrum campuran tersebut disubtraksi dengan spektrum aseton. Hal tersebut dilakukan untuk menghilangkan kontribusi aseton dan mendapatkan spektrum likopen saja. Gambar merupakan spektrum aseton yang diperoleh dari hasil subtraksi. 29

7 1 0 Gb Spektrum absorban likopen Pada spektrum likopen tersebut nampak puncak yang sangat kuat pada 5242 cm -1. Puncak ini berhubungan dengan C-H yang dimiliki oleh senyawa hidrokarbon alifatik. Likopen merupakan senyawa hidrokarbon alifatik oleh karena itu, puncak C-H dapat diamati disini. Beberapa noise juga muncul pada daerah kurang dari 4500 cm -1. Beberapa puncak kecil juga nampak pada daerah cm -1 Dapat dilihat juga daerah ban yang luas antara cm -1. Beberapa puncak dengan intensitas kecil terdapat pada bilangan gelombang 4040, 4101 yang berhubungan dengen senyawa hidrokarbon aromatik. C-H aril nampak pada spektrum tersebut pada bilangan gelombang 4157 dan 5976 cm -1. Hidrokarbon 30.

8 alifatik juga nampak pada bilangan gelombang 4254 dan area antara cm -1. Spektrum tersebut merupakan spektrum likopen, dan puncak utama nya terdapat pada 5242 cm -1. Sebagai langkah awal untuk mencampurkan pigmen dengan madu, maka dalam percobaan ini madu digunakan sebagai campuran pigmen. Untuk mendapatkan spektrum likopen, selain campuran aseton-likopen diatas digunakan campuran likopen dan madu. Langkah pertamayang dilakukan adalah mengukur spektrum madu. Gambar dibawah ini merupakan spektrum dari madu. 2 1 Gb Spektrum absorban madu Penyusun utama madu adalah karbohidrat, oleh karena itu spektrum yang berhubungan dengan karbohidrat nampak kuat pada 4762 dan 4393 cm -1 yang timbul karena kandungan glukosa pada madu. 31

9 Spektrum protein muncul pada bilangan gelombang cm -1. Puncak pada 5921 cm -1 muncul karena kandungan air dalam madu. Sedangkan daerah cm -1 berkaitan dengan C-O dan C-C mode regangan dari sakarida. Sebanyak 2 mg pigmen kemudian dicampurkan dengan 10 ml madu randu. Karena kedua sifat pigmen dan madu bertentangan (madu=hidrofilik, likopen =hidrofobik) maka keduanya sulit untuk tercampur. Usaha telah dilakukan dengan mencampurkan pigmen dengan minyak, tapi hasil nya tidak sesuai dengan yang diharapkan. Oleh karena itu, dalam percobaan ini, sebagai suatu langkah awal, maka pigmen likopen hanya dicampurkan dengan madu secara langsung. Tentu saja likopen tidak terlarut dalam madu, hanya saja dengan pertimbangan spektrometer akan mengukur spektrum campuran antara madu dan likopen. Spektrum tersebut nanti dapat diproses dengan menghilangkan spektrum madu untuk mendapatkan spektrum likopennya saja. Gambar adalah spektrum dari campuran madu dan pigmen. Bila dilihat pada spektrum tersebut nampak spektrum madu sangat dominan. Kontribusi air (5159 cm -1 ), protein (5909 dan 6844 cm -1 ) dan glukosa (4393 dan 4762 cm -1 nampak kuat spektrum ini. 32

10 2 1 2 Gb Spektrum absorban campuran likopen dan madu 1 Gb Spektrum absorban likopen Puncak-puncak yang berhubungan dengan madu tersebut mendominasi spektrum campuran ini karena konsentrasi pigmen sangatlah kecil. Untuk mendapatkan spektrum likopen saja, cara yang sama 33

11 dilakukan kembali. Spektrum dari campuran pigmen dan madu kemudian disubtraksi dengan spektrum madu. Hasil subtraksi ini dapat dilihat pada gambar diatas. Pada spektrum ini, tidak nampak secara jelas kontribusi likopen, karena sebagian besar spektrum menunjukkan kontribusi air (5150 cm -1 ) dan karbohidrat (4763 and 4393 cm -1 ). Hal tersebut menunjukkan bahwa metode kedua ini belum dapat mencampurkan pigmen dengan sempurna sehingga kontribusi pigmen sangat lah kecil. Walaupun begitu masih nampak persamaan antara spektrum likopen hasil subtraksi dengan aseton dan spektrum likopen hasil subtraksi dengan madu. Persamaan antara kedua spektrum tersebut adalah mempunyai puncakdi sekitar 5200 cm -1. Hal tersebut menunjukkan bahwa tinggi dugaan spektrum likopen terdapat pada daerah tersebut. Beberapa perbedaan spektrum likopen dari gambar dan antara lain nampak adanya pergeseran ban pada daerah sekitar 5200 cm -1 dan cm -1. Belum diketahui secara pasti apa yang menyebabkan pergeseran ini. Kemungkinan band shift ini disebabkan karena interaksi pelarut dengan pigmen pada likopen yang diperoleh dari substraksi aseton. Perbedaan diantara cm -1 juga kemungkinan besar terjadi karena perbedaan pelarut, 34

12 tapi juga ada kemungkinan hal ini disebabkan karena terjadi sedikit perubahan pada sistem pengukuran mengingat daerah sekitar 4500 cm -1 merupakan daerah puncak untuk petri yang digunakan untuk mengukur. Pada percobaan ini, petri yang digunakan mengukur identik satu sama lain, jadi ada kemungkinan sistem yang sedikit berubah karena perubahan suhu, kesalahan pengukuran ataupun kemungkinan lainnya. Percobaan ini tidak bisa lanjutkan ke langkah berikutnya karena jumlah pigmen yang tidak memadai. Hal ini terjadi karena metode pengekstrakan likopen yang dirasa kurang efektif. Untuk penelitian yang lebih lanjut, sangat disarankan menggunakan metode yang lain untuk mengekstrak likopen. Dalam penelitian berikutnya, perlakuan yang sama kembali diulang dengan menggunakan wortel. 4.2 Ekstraksi beta karoten dari wortel Ekstraksi wortel dilakukan sesuai dengan prosedur yang tertulis pada bab III. Percobaan dilakukan beberapa kali untuk mendapatkan jumlah pigmen yangcukup untuk proses berikutnya. Berdasarkan beberapa kali percobaan, hasil yang diperoleh untuk ekstraksi 1 kg masing-masing buah sangat lah sedikit kurang dari 0,02 g. Oleh karena itu 35

13 hasil ekstraksi tidak mencukupi jika akan digunakan dalam proses berikutnya. Usaha yang sama telah dilakukan untuk meningkatkan hasil yang sudah diperoleh seperti menambah durasi pengadukan, menggunakan pengaduk yang lebih baik dan mengganti pelarut dengan aseton seluruhnya, namun hasilnya masih kurang mencukupi. Sisa hasil ekstraksi juga masih menunjukkan warna oranye yang jelas, hal tersebut menujukkan bahwa pigmen tidak terekstrak secara maksimal. Oleh sebab itu, penelitian ini kemudian menggunakan sampel beta karoten murni yang yang dibeli dari Sigma, selain untuk menjaga kemurnian nya juga untuk mencukupi jumlah yang dibutuhkan untuk proses berikutnya. Untuk penelitian lanjutan, perlu dicari cara lebih efektif untuk mengekstrak beta karoten dari wortel, maupun likopen dari tomat. Kedua sampel tersebut dipilih karena kesediaannya yang melimpah disekitar kita. Oleh karena keterbatasan hasil eksraksi maka untuk percobaan berikutnya sampel yang digunakan adalah beta karoten murni. 4.3 Uji foto stabilitas beta karoten dalam pelarut heksana Untuk mengetahui stabilitas pigmen dalam campuran, maka perlu diketahui terlabih dahulu 36

14 2 stabilitas pigmen itu sendiri. Untuk mengetahui stabilitas pigmen beta karoten dengan menggunakan spektrometer NIR, maka beberapa cara dilakukan. Cara pertama adalah mengukur stabilitas beta karoten dalam pelarut dan cara kedua dilakukan tanpa pelarut. Dalam bab ini akan dijelaskan pengukuran stabilitas dengan pelarut. Pelarut yang digunakan dalam penelitian ini adalah heksana. Heksana dipilih karena sifatnya yang tidak reaktif. Dalam pengukuran ini diharapkah kontribusi pelarut dapat dihilangkan dengan metode subtraksi seperti yang telah dilakukan sebelumnya. Pengukuran spektrum pertama yang dilakukan dengan spektrometer NIR adalah spektrum heksana. Spektrum absorbansi heksana dapat dilihat dari gambar berikut ini. 1 Gb Spektrum absorban heksana 37

15 Berdasarkan gambar diatas nampak bahwa spektrum heksana dapat dibagi menjadi empat bagian utama. Bagian pertama adalah puncak antara yang merupakan daerah kombinasi ban antara overtone kedua dari ikatan pada C-H dan CH2 mode regangan asimetrik dan mode vibrasi lainnya. Daerah kedua adalah daerah antara cm -1 yang berhubungan dengan C-H mode vibrasi regangan. Sedangkan daerah ketiga dan keempat yang walaupun tidak sekuat daerah pertama dan kedua namun juga merupakan kontribusidari C-H dari senyawa hidrokarbon karena juga menunjukkan ikatan C-H. Daerah cm -1 merupakan C-H overtone pertama sedangkan daerah merupakan C-H overtone ketiga. Secara keseluruhan spektrum tersebut menujukkan ikatan C-H. Puncak yang sangat kuat pada daerah 4334 cm -1 dimiliki olehhidrokarbon alifatik. Ikatan C-H ini juga muncul pada 8392, 5909, 5872, 5808 dan 5678 cm -1. Sedangkan puncak yang berkaitan dengan CH2 antara lain 8269, 7185 dan 7084 cm -1. Sekitar 1 mg sampel kemudian dicampurkan dengan 10ml heksana. Spektrum campuran tersebut kemudian diukur dengan spektrometer NIR kemudian diukur dengan spektrometer NIR dan didapatkanlah spektrum seperti pada gambar dibawah ini. 38

16 2 1 Gb Spektrum absorban campuran heksana dan beta karoten Berdasarkan campuran tersebut nampak bahwa kontribusi heksana sangat besar sehingga bentuk spektrum secara keseluruhan nampak sangat mirip dengan spektrum heksana. Disini juga nampak 4 daerah yang berhubungan dengan ikatan C-H. Puncak pada 4334 cm -1 juga nampak sangat kuat pada spektrum. Secara keseluruhan spekrum nampak ikatan C-H pada metil dan CH2 sangat yang sangat dominan. Untuk mengetahui spektrum beta karoten, maka spektrum campuran tersebut kemudian disubstraksi dengan menggunakan spektrum heksana. Berikut adalah spektrum beta karoten hasil subtraksi tersebut. 39

17 Gb Spektrum absorban beta karoten dengan pembesaran pada daerah cm -1 Berdasarkan spektrum tersebut nampak jelas bahwa kontribusi beta karoten sangat kuat pada daerah antara 4000 sampai 4500 cm -1. Dimana daerah tersebut merupakan daerah kombinasi ban antara C-H dan beberapa mode vibrasi dari CH2. Dalam spektrum tersebut juga nampak bahwa tidak ada puncak pada daerah cm -1. Hal tersebut bukan berarti bahwa kontribusi beta karoten hanya ada pada daerah sekitar cm -1 saja, namun tinggi dugaan bahwa tidak semuapuncak dapat diamati karena intensitasnya yang kecil. Berdasarkan jumlah beta karoten yang dipakai dalam larutan,maka ada kemungkinan sebenarnya beta karoten juga mempunyai puncak diantara cm -1 hanya 40

18 saja dalam pengukuran ini ban tersebut sangat lemah dibanding ban antara cm -1 sehingga tidak teramati. Pada spektrum beta karoten tersebut nampak puncak kuat pada 4334 cm -1 yang merupakan kontribusi dari ikatan C-H. Ban tersebut mempunyai puncak kecil didekatnya yang juga masih berhubungan dengan C-H yaitu pada daerah 4264 cm -1. C-H aril aromatik (4210 cm -1 ) juga mempunyai kontribusi dalam spektrum ini walaupun tidak sekuat pada C-H. Puncak pada 4093 cm -1 berkaitan dengan hidrokarbon aromatik dan 4073 muncul dari hidrokarbon alifatik. Berdasarkan spektrum ini, maka pada percobaan berikutnya akan diukur foto stabilitas dari pigmen. Sebagai fokus pembahasan akan dilihat pada daerah karena pada daerah ini berhubungan dengan beta karoten. Uji fotostabilitas dilakukan dengan menggunakan alat seperti yang dijelaskan pada bab III. Dengan menggunakan heksana, pengukuran stabilitas hanya bisa dilakukan dalam jangka waktu kira kira 1jam, mengingat bahwa pelarut akan menguap. Dari spektrum terlihat bahwa sampai dengan 1 jam masih terdapat pelarut dalam sampel walaupun bila dilihat dengan mata sudahhanya endapan yang tersisa. Jumlah pelarut yang berubah ini tentu saja akan 41

19 menghasilkan spektrum absorbansi yang berbeda pula. Maka dalam analisa ini, setiap sampel akan disubtraksi dengan spektrum dasar heksana dengan ratio yang disesuaikan dengan spektrum hasil. Berikut ini adalah spektrum yang diperoleh setelah pengukuran selama 1 jam dengan interval 10 menit. Pengukuran dilakukan pada saat 0 menit (mula-mula), 10 menit, 20 menit, 30 menit, 40 menit, 50 menit dan 60 menit. Intensitas cahaya yang digunakan adalah 350 lux. 1 Gb Spektrum absorban campuran heksana dan beta karoten untuk durasi 0-60 menit 42

20 Setelah dikurangi dengan spektrum heksana, spektrum beta karoten dapat diperoleh. Gambar merupakan spektrum beta karoten yang diperoleh untuk durasi 0-60 menit. 0,1 0 Gb Spektrum absorban beta karoten untuk durasi 0-60 menit Berdasarkan spektrum tersebut nampak bahwa satu spektrum berbeda dengan yang lain. Spektrum berwarna biru yang terdapat pada puncak tersebut merupakan spektrum yang diambil untuk fotostabilitas 50 menit. Hasil tersebut menunjukkan adanya kesalahan dalam pengukuran spektrum. Kemungkinan penyebab error yang lain adalah penggunaan referensi eksternal dan internal yang salah dalam pengukuran spektrum. 43

21 Spektrum tersebut kemudian dicari turunan keduanya untuk pengaruh penyinaran untuk terhadap stabilitas spektrum. Gb Turunan kedua spektrum beta karoten dengan pembesaran daerah cm -1 Berdasarkan spektrum tersebut dapat diamati pada puncak 4334 cm -1 yang sebelumnya ditemukan sebagai puncak yang berkaitan dengan beta karoten, intensitas pada setiap pengukuran berbeda satu sama lain. Pada nampak hasil dari Intensitas terkecil ke adalah 50, 60, 30, 40, 0, 20 dan 10 menit. Hasil tersebut menunjukkan urutan yang tidak beraturan. Hasil serupa ditemukan untuk daerah yang lain (Gb.4.3.6) seperti pada puncak 4264 cm -1 yang berhubungan dengan ikatan tunggal pada C-H. Urutan dari Intensitas rendah ke tinggi adalah 50, 60, 30, 40, 0, 20 dan 10 menit. Sedangkan pada daerah 4178 cm -1 yang 44

22 berhubungan dengan C-H aril dan C-H aromatik (Gb.4.3.7) nampak urutan dari intensitas besar ke kecil adalah 0, 10, 20, 30, 40, 60, 50. Nampak bahwa spektrum pada 0 dan 10 menit; 30 dan 40 menit sangat dekat satu sama lain dan hampir tumpang tindih. Gb Turunan kedua spektrum beta karoten dengan pembesaran daerah cm -1 Gb Turunan kedua spektrum beta karoten dengan pembesaran daerah cm -1 45

23 Berdasarkan hasil tersebut terlihat bahwa pola degradasi spektrum pada puncak 4178 cm -1 nampak teratur dengan error pada pengukuran menit ke 50. Hasil menunjukkan pengurangan intensitas dengan bertambahnya durasi penyinaran. Sedangkan pada puncak 4334 dan 4264 nampak bahwa degradasi pigmen tidak tersebut masih terlihat bahwa degradasi nampak tidak seteratur pada daerah 4178 cm -1. Walaupun demikian dapat dilihat ada kecenderungan yang serupa. Bertambahnya durasi penyinaran menununjukkan berkurangnya intensitas pada bilangan gelombang yang bersesuaian. Bila dilihat dengan lebih teliti, ada tiga kelompok dalam hasil tersebut, 50 dan 60 menit, 30 dan 40 menit dan 0, 10 dan 20 menit. Dari hasil pengukuran nampak hubungan bahwa Intensitas (I) pada menit-menit pengukuran adalah ܫ ܫ ܫ < ܫ < ܫ, ܫ. Seperti yang dijelaskan diatas ܫ, spektrum pada menit 30 dan 40 hampir tumpang tindih sehingga intensitas hampir sama, begitu pula untuk pengukuran 0, 10 dan 20 menit. Sedangkan terdapat kesalahan dalam pengukuran 50 menit sehingga spektrum nampak sangat berbeda dengan yang lain. Dalam pengukuran dalam jangka yang pendek atau sekitar 10 menit, tidak diamati adanya banyak perbedaan sehingga hasil menunjukkan spektrum yang hampir

24 sama. Sehingga untuk pengukuran lebih lanjut, lebih baik bila intensitas cahaya durasi pengukuran ditingkatkan. Dalam percobaan ini dapat ditunjukkan bahwa spektrometer NIR dapat digunakan dalam mengukur fotostabilitas pada pigmen. 4.4 Uji fotostabilitas beta karoten tanpa pelarut Untuk mengetahui kestabilan pigmen terhadap oksidasi maupun cahaya, maka sebelum pigmen tersebut dicampurkan dengan madu, ataupun bahan lainnya maka kestabilan pigmen itu sendiri harus diketahui. Setelah uji fotostabilitas dilakukan dengan bersamaan dengan pelarut, maka dalam percobaan ini uji foto stabilitas dan oksidasi akan dilakukan tanpa setelah pelarut diuapkan. Jika memungkinkan, akan lebih efektif bila pigmen diukur secara langsung dalam bentuk serbuk mengingat spektrometer NIR dapat mengukur sampel baik padat, cair, gel, tablet ataupun serbuk. Jika pigmen diukur secara langsung akan nampak bahwa spektrum pigmen akan didapatkan tanpa harus melakukan perlakuan lebih lanjut. Sampel NIR akan optimal jika ketebalan sampel sekitar10 mm. Untuk menyediakan pigmen yang setebal 10 cm untuk diameter petri sekitar 10 cm tentu saja membutuhkan biaya yang tidak sedikit oleh karena itu dalam 47

25 percobaan ini dilakukan dengan bantuan pelarut. Percobaan dilakukan dengan mencampur 25 mg beta karoten dengan 10 ml heksana. Setelah larutan tercampur secara homogen, larutan tersebut kemudian dituangkan kedalam petri. Larutan diuapkan untuk mendapatkan endapan betakaroten yang merata diseluruh permukaan petri. Penguapan membutuhkan waktu sekitar 1 jam. Dan endapan kemudian dicek dengan spektrometer NIR untuk memastikan tidak ada larutan heksana yang tertinggal. Oleh karena pigmen tersebut harus diuapkan sekitar satu jam hingga dapat dihilangkan seluruh pelarutnya. Hal tersebut memungkinkan adanya pengaruh oksidasi dan juga degradasi pigmen oleh pelarut. Untuk mengetahui perbedaan nya, campuran heksana dan beta karoten yang lain telah disimpan selama satu hari. Berdasarkan gambar pada lampiran dapat terlihat jelas adanya pemucatan warna larutan yang menunjukkan adanya degradasi pigmen. Gambar adalah spektrum dari petri kosong. Spektrum ini perlu diukur untuk mendapatkan spektrum beta karoten saja. Dari spektrum tersebut terlihat bahwa puncak spektrum melebar dari cm -1, tanpa ada tambahan ban pada bilangan gelombang lainnya. Setelah seluruh pelarut menguap, spektrum dari beta karoten kemudian diukur. 48

26 0,2 0-0,2 Gb Spektrum absorban petri kosong 0,2 0 Gb Spektrum absorban beta karoten dan petri Gambar berikut merupakan spektrum dari beta karoten. Jika dilihat dari bentuk spektrumnya saja, nampak sama dengan petri kosong. Hal tersebut 49

27 menunjukkan bahwa kontribusi pigmen yang diukur sangat lemah konsentrasinya. Namun hal tersebut tidak berarti spektrum beta karoten tidak dapat diperoleh, dengan mengurangi spektrum beta karoten dengan petri kosong maka didapatkanlah spektrum pada gambar ,2 0, Gb Spektrum absorban beta karoten dengan pembesaran pada area cm -1 Gambar menunjukkan spektrum beta karoten tanpa kontribusi dari petri. Puncak kuat pada 4336 cm -1 berhubungan dengan mode vibrasi C-H pada beta karoten. Selain puncak utama, muncul pula beberapa puncak lain yang lebar dan lemah antara lain puncak pada 5864 cm -1 yang muncul karena kontribusi CH3 metil. pada bilangan gelombang

28 cm -1 nampak kontribusi dari ikatan 0-H hal tersebut menunjukkan bahwa sampel telah teroksidasi. Selain itu, daerah pada bilangan gelombang sekitar 4625 cm -1 muncul karena kontribusi C-H aromatik dan C-H aril. Hasil yang diperoleh pada percobaan ini selaras dengan hasil yang diperoleh pada percobaan menggunakan pelarut pada sub bab 4.3 Bahwa kontribusi beta karoten yang terbesar nampak pada bilangan gelombang sekitar 4334 yang berkaitan dengan ikatan C-H. Uji stabilitas sampel untuk mengetahui pengaruh cahaya terhadap kestabilan pigmen dilakukan dalam jangka waktu pendek dan panjang. Pendek berarti kurang dari 24 jam dan panjang berarti 8 hari. Jangka waktu ini merupakan pengukuran maksimal yang bisa dilakukan untuk uji stabilitas karena rangkaian yang digunakan untuk penyinaran tidak bisa digunakan untuk jangka panjang. Setelah hampir 8 hari pengukuran nonstop lampu akhirnya padam. Diperkirakan waktu padamnya adalah malam hari, sehingga telah beberapa jam sampel dibiarkan tanpa penyinaran, sehingga pengukuran sampel harus diakhiri. Sampel selalu diekspos cahaya dengan intensitas 1800 lux. Saat tidak diukur, sampel ditutup dengan plastik untuk meminimalisasi pengaruh oksidasi. Lempeng reflektan juga tidak diubah ubah, 51

29 untuk memastikan pengukuran selalu dalam kondisi yang sama dan posisi yang sama. Petri juga ditandai seperti berikut ini untuk memastikan petri selalu dimasukan dalam posisi yang sama. Perilaku yang sama juga diberikan saat pengukuran sampel untuk mengukur pengaruh oksidasi. Pengukuran dilakukan selama 17 hari Uji fotostabilitas beta karoten Uji fotostabilitas dilakukan dengan menyinari sampel dengan intensitas cahaya 1800 lux dalam 0,1 jangka waktu 0 jam (mula-mula), 1 jam, 2 jam, 3 jam,, 4 jam,, 5 jam, 1 hari, 2 hari, 3 hari, 4 hari, 7 hari dan 8 hari. Spektrum yang diperoleh untuk semua pengukuran dapat dilihat pada gambar dibawah ini. 0 Gb Spektrum beta karoten setelah disubtraksi Setelah disubtraksi dengan spektrum petri maka 52

30 diperolehlah spektrum hasil uji fotostabilitas beta karoten seperti pada gambar Spektrum dipilih pada area cm -1 karena area selain tersebut terdapat puncak-puncak spektrum. Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya, daerah yang akan diobservasi adalah 4336, 4625, 5195 dan 4625 cm Gb Spektrum beta karoten Untuk mengetahui pengaruh penyinaran terhadap pigmen, maka akan dilihat intensitas dari puncak masing-masih pengukuran. Hal ini dilakukan karena intensitas pada spektrum absorban mempunyai hubungan linier dengan kandungan pada sampel. Tabel berikut ini menunjukkan urutan intensitas pada masing-masing pengukuran dimulai dari intensitas tertinggi menuju intensitas terendah. 53

31 Tabel 1 Urutan intensitas (dari tinggi ke rendah) hasil uji fotostabilitas pada panjang bilangan gelombang tertentu. Bilangan gel (cm -1 ) Urutan ke jam 0 jam 0 jam 0 jam 2 1 jam 1 jam 1 jam 1 jam 3 3 jam 4jam 4jam 4jam 4 4jam 5jam 5jam 5jam 5 5jam 3 jam 3 jam 3 jam 6 2 hari 2 hari 2 hari 2 hari 7 4 hari 4 hari 4 hari 4 hari 8 3 hari 3 hari 3 hari 3 hari 9 7hari 7hari 7hari 7hari 10 1 hari 1 hari 1 hari 1 hari 11 8hari 8hari 8hari 8hari Dari hasil tersebut menunjukkan bahwa urutan intensitas yang diperoleh tidak beraturan. Fotostabilitas pigmen tidak dapat diamati dengan menggunakan cara yang digunakan pada percobaan ini. Dalam usaha untuk uji fotostabilitas nampaknya bahwa terdapat pengaruh oksigen. Oleh karena itu, dalam percobaan selanjutnya akan diuji tentang kestabilan pigmen terhadap pengaruh oksigen Uji pengaruh oksidasi beta karoten Uji oksidasi dilakukan dengan meletakkan sampel pigmen di ruangan pengukuran sehingga sampel dapat terekspos dengan udara disekitar nya. Uji pengaruh oksidasi ini dilakukan dalam jangka waktu 1, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 17 dan 18 hari. Spektrum yang diperoleh sebelum dikurangi spektrum petri dapat 54

32 dilihat pada gambar dan spektrum hasil pengurangan dengan petri pada gambar ,3 0 0,13 Gb Spektrum beta karoten pada uji oksidasi sebelum dikurangi petri 0,10 Gb Spektrum beta karoten pada uji oksidasi setelah dikurangi petri 55

33 Gambar menunjukkan bahwa spektrum hasil pengaruh oksidasi ini nampak sama dengan uji fotostabilitas. Puncak-puncak yang sama dengan antara lain puncak kuat pada 4334 cm -1 (C-H)dan puncak-puncak lemah dan luas pada daerah sekitar 5872 (C-H metil), 5211(0-H) dan 4655 cm -1 (C-H aril). Hal tersebut menunjukkan bahwa uji oksidasi pun tidak lepas dari pengaruh cahaya. Sehingga dalam kedua uji pengaruh satu sama lain tidak terelakkan. Salah satu yang menjadi alasan adalah ruang penyimpanan pigmen tidak sepenuhnya ruang gelap. Masih ada beberapa cahaya yang masuk pada sela-sela ruangan tersebut. Untuk mengetahui pengaruh oksidasi terhadap pigmen maka intensitas masingmasing pengukuran akan dibandingkan. Intensitas diurutkan dari terbesar menuju terkecil. Hasilnya dapat dilihat pada tabel 1 dibawah ini. Tabel 2 Urutan intensitas dari tinggi ke rendah pada uji oksidasi pada panjang gelombang tertentu. Bilangan gel (cm -1 ) Urutan ke hari 1 hari 1 hari 1 hari 2 10 hari 10 hari 10 hari 10 hari 3 11 hari 11 hari 11 hari 11 hari 4 14 hari 17 hari 17 hari 17 hari 5 17 hari 7 hari 7 hari 7 hari 6 7 hari 13 hari 13 hari 13 hari 7 13 hari 14 hari 14 hari 14 hari 8 18 hari 18 hari 18 hari 18 hari 9 12 hari 12 hari 12 hari 12 hari 56

34 Berdasarkan urutan tersebut nampak bahwa pada uji pengaruh oksidasi ini tidak nampak korelasi linier antara penambahan durasi oksidasi dengan kandungan pada spektrum. Secara garis besar dapat disimpulkan bahwa dengan cara yang digunakan, pengaruh oksidasi dan cahaya tidak dapat diamati dengan baik. Ada beberapa hal yang menjadi alasan ketidak berhasilan pengukuran ini, antara lain: 1. sampel tidak sepenuhnya terisolasi dari pengaruh cahaya dan oksigen; 2. Ketebalan sampel dalam pengukuran kurang dari 10 mm sehingga kontribusi pigmen dalam spektrum dirasa lemah; 3. alat yang digunakan untuk fotostabilitas kurang efektif; 4. Ada kemungkinan pengaruh panas selain oksigen dan cahaya. Langkah berikutnya untuk percobaan ini adalah pencampuran beta karoten dengan madu untuk diuji fotostabilitas nya. Hasil penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa hasil pencampuran madu dan pigmen tadi tidak dapat digunakan untuk mendapatkan spektrum murni pigmen. Salah satu penyebabnya adalah belum ditemukannya cara untuk mencampur madu secara homogen. Selain itu, sistem untuk pengukuran fotostabilitas dan oksidasi perlu diperbaiki. Untuk penelitian lebih lanjut perlu dipikirkan beberapa cara yang lebih efektif untuk 57

35 mengekstrak pigmen, pencampuran pigmen dan uji stabilitas maupun oksidasi pigmen. Penelitian yang telah penulis lakukan adalah suatu percobaan pendahuluan yang perluuntuk diteruskan dan diperbaiki kekurangan nya. 58