BAB I PENDAHULUAN. A. Latar Belakang Masalah. Trichomoniasis vaginalis, Amoebiasi dan Giardasis. Metronidazol bekerja efektif

Transkripsi

1 BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Masalah Metronidazol (2-Metil-5-nitroimidazol-1-etanol) atau turunan nitroimidazol merupakan salah satu obat yang efektif untuk mengatasi bakteri Trichomoniasis vaginalis, Amoebiasi dan Giardasis. Metronidazol bekerja efektif baik lokal maupun sistemik. (Tjay dan Rahardja, 2007). Obat yang beredar di masyarakat perlu dilengkapi dengan adanya suatu kontrol kualitas obat sehingga menjamin efikasi dan keamanan obat tersebut. Salah satu kontrol kualitas suatu obat dapat dilakukan dengan cara pengukuran analitik yang meliputi pengukuran konsentrasi dan penetapan kadar obat. Oleh karena itu, dibutuhkan metode analisis untuk diaplikasikan dalam kontrol kualitas obat. Obat metronidazol khasiatnya dapat berkurang disebabkan faktor penyimpanan yang tidak tepat sehingga dapat menyebabkan perubahan komposisi atau aktivitas. Untuk menjaga kadar obat maka perlu dilakukan suatu kontrol kualitas obat untuk menjamin khasiat dari obat metronidazol yang memenuhi persyaratan Farmakope Indonesia. Injeksi metronidazol mengandung tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0% dari jumlah yang tertera pada etiket. Berdasarkan Farmakope Edisi IV, penetapan kadar metronidazol dalam sediaan injeksi dapat menggunakan KCKT dengan fase gerak berupa campuran air : metanol (97:3, v/v), laju alir lebih kurang 2,0 ml per menit, menggunakan kolom 4,6 mm x 25 cm dan fase diam 1

2 2 yang digunakan adalah C18 dengan detektor ultraviolet pada panjang gelombang 320 nm. Sedangkan menurut USP XXX (Anonim, 2007) penetapan kadar metronidazol dapat dilakukan secara kromatografi lapis tipis, spektrofotometri inframerah dan spektrofotometri ultraviolet. Metode KCKT merupakan metode yang sering digunakan untuk penetapan kadar senyawa obat baik dalam bentuk sediaan maupun dalam sampel hayati. Hal ini karena KCKT merupakan metode yang memiliki sensitifitas yang tinggi. Selain itu, KCKT memberikan banyak keuntungan antara lain cepat, resolusinya baik, mudah melaksanakannya, detektor yang sensitif dan beragam sehingga akan mampu menganalisa berbagai cuplikan secara kualitatif maupun kuantitatif, kolom dapat digunakan kembali dan mudah mendapatkan perolehan kembali, serta ideal untuk molekul besar dan ion (Gandjar dan Rohman, 2007). Dilihat dari strukturnya, metronidazol mempunyai unsur elektronegatif yang menjadikannya bersifat polar sehinnga dapat dipisahkan dengan metode KCKT dan juga memiliki gugus kromofor yang dapat dianalisis oleh detektor UV. Hassan dkk., (2011) melakukan penelitian tentang penetapan kadar metronidazol dalam bentuk larutan yaitu sediaan sirup. Penelitian ini menghasilkan validasi yang memenuhi persyaratan Farmakope Indonesia Edisi IV tahun Berdasarkan latar belakang di atas maka peneliti menggunakan KCKT untuk menetapkan kadar metronidazol dan menerapkannya dalam sediaan injeksi. Selain itu peneliti juga akan memvalidasi metode tersebut yang meliputi presisi, akurasi,selektivitas, linieritas dan sensitivitas.

3 3 B. Perumusan Masalah 1. Apakah validasi metode penetapan kadar metronidazol menggunakan KCKT dengan fase diam C18 dan fase gerak berupa campuran air dan metanol dapat dilakukan? 2. Apakah metode yang sudah divalidasi tersebut dapat diaplikasikan dalam sediaan injeksi? C. Tujuan Penelitian 1. Melakukan validasi metode penetapan kadar metronidazol menggunakan KCKT dengan fase diam C18 dan fase gerak berupa campuran air dan metanol. 2. Mengaplikasikan metode yang sudah divalidasi pada sediaan injeksi. D. Manfaat Penelitian Penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan informasi penetapan kadar metronidazol menggunakan KCKT yang dapat diaplikasikan ke dalam sediaan injeksi dan memberikan informasi tentang kesesuaian kadar metronidazol dalam sediaan injeksi. 1. Metronidazol E. Tinjauan Pustaka Metronidazol merupakan obat antibakteri dan anti protozoa sintetik derivat nitroimidazol yang mempunyai aktivitas bakterisid, amoebisid dan trikomonosid. Dalam sel atau mikroorganisme metronidazol mengalami

4 4 reduksi menjadi produk polar. Hasil reduksi ini mempunyai aksi antibakteri dengan jalan menghambat sintesa asam nukleat, mempengaruhi anaerob yang mereduksi nitrogen membentuk intermediet (Ganiswara, 1995). Metronidazol bekerja efektif baik lokal maupun sistemik. Metronidazol terhadap trichomoniasis mempunyai daya trikomoniasid langsung dengan konsentrasi 2,5 mcg/ml terhadap amoebiasis, metronidazol mempunyai daya amoebisid langsung dengan konsentrasi 1-2 mcg/ml (Siswandono dan Soekardjo, 2000). Metronidazol memiliki rumus molekul C6H9N303 dengan berat molekul 171,16. Nama lain atau nama kimia dari metronidazol adalah 2-metil-5- nitroimidazol-1-etanol. Pemeriannya berupa serbuk hablur atau hablur, berwarna putih hingga kuning pucat, tidak berbau, stabil di udara, tetapi lebih gelap bila terpapar oleh cahaya. Zat ini sukar larut dalam eter, agak sukar larut dalam air, etanol, dan kloroform. Persyaratan injeksi metronidazol mengandung metronidazol tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0% dari jumlah yang tertera pada etiket (Anonim, 1995). Struktur kimia metronidazol ditunjukkan oleh Gambar 1. Gambar 1. Struktur Kimia Metronidazol (Anonim, 1995)

5 5 Efek samping hebat yang memerlukan penghentian pengobatan jarang ditemukan. Efek samping yang paling sering dikeluhkan ialah sakit kepala, mual, mulut kering, dan rasa kecap logam. Muntah, diare, dan spasme usus jarang dialami. Lidah berselaput, glositis, dan stomatitis dapat terjadi selama pengobatan, dan ini mungkin berkaitan dengan moniliasis. Efek samping lain dapat berupa pusing, vertigo, ataksia, parestesia pada ekstrimitas, urtikaria, flusing, pruritus, disuria, sistitis, rasa tekan pada pelvic, juga kering pada mulut, vagina dan vulva (Syarif, Amir dkk. 2011). Sediaan metronidazol tersedia dalam bentuk tablet 250 mg dan 500 mg sedangkan dalam tablet vaginal 500 mg (Ditjen POM, 1989). Untuk amubiasis, dosis oral yang digunakan untuk dewasa yaitu 3 x 750 mg/hari selama 5-10 hari. Sedangkan untuk anak ialah mg/kg BB/hari terbagi dalam tiga dosis (Gunawan, 2007). 2. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Kelebihan metode KCKT adalah mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran, resolusinya baik, kecepatan analisis dan kepekaannya tinggi, dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang dianalisis, dapat digunakan bermacam-macam detektor, mudah melaksanakannya, kolom dapat digunakan kembali, mudah melakukan perolehan kembali,instrumennya memungkinkan untuk bekerja secara automatis dan kuantitatif. Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika KCKT dihubungkan dengan spektrofotometer massa (MS). Keterbatasan

6 6 lainnya adalah jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh (Gandjar dan Rohman, 2007). Instrumental KCKT pada dasarnya terdiri atas beberapa komponen pokok yaitu: wadah fase gerak, sistem penghantaran fase gerak, alat untuk memasukan sampel, kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, tabung penghubung dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Skema KCKT dapat dilihat pada Gambar 2. Gambar 2. Skema Komponen KCKT (Ardianingsih, 2009). Keterangan: 1. Eluent (wadah fase gerak) 2. Pompa 3. Injektor 4. Kolom 5. Detektor 6. Pengolah data

7 7 a. Wadah Fase Gerak Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Adanya pengotor dalam reagen dapat menyababkaan gangguan pada sistem kromatografi. Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil (Gandjar dan Rohman, 2007). b. Pompa Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yaitu pompa harus netral terhadap fase gerak. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 ml/menit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan (Gandjar dan Rohman, 2007). c. Injektor Sampel-sampel cair dan larutan disuntikan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir dibawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang

8 8 dilengkapi dengan keluk sample internal atau eksternal. Pada saat pengisian sampel, sampel digelontor melewati keluk sampel dan kelebihannya dikeluarakan ke pembuang. Pada saat penyuntikan, katup diputar sehingga fase gerak mengalir melewati keluk sampel dan menggelontor sampel ke kolom (Gandjar dan Rohman, 2007). d. Kolom Kolom merupakan bagian sangat terpenting dari kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Dalam prakteknya kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin (Gandjar dan Rohman, 2007). e. Detektor Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan untuk menghitung kadamya (analisis kuantitatif). Suatu detektor yang baik mempunyai sensitifitas yang tinggi, terdapatnya gangguan yang rendah, dalam memperoleh respons linier sangat luas, dan memberikan respons untuk semua tipe senyawa. Kepekaan yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh (Putra, 2007).

9 9 f. Fase Gerak Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas), sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Pada saat membuat pelarut untuk fase gerak, maka sangat dianjurkan untuk menggunakan pelarut, dapar, dan reagen dengan kemurnian yang sangat tinggi, dan lebih terpilih lagi jika pelarut yang akan digunakan untuk KCKT berderajat KCKT (HPLC grade) (Gandjar dan Rohman, 2007). 3. Validasi Validasi metode analisis adalah proses untuk menjamin bahwa prosedur uji yang dilakukan memenuhi standar yang dapat diterima dan sesuai dengan tujuan yang telah ditetapkan. Metode uji yang berbeda membutuhkan validasi yang berbeda pula (Lister, 2005). Uji validasi yang dilakukan berdasarkan prosedur yang telah ditetapkan terdiri dari lima uji validasi, diantaranya yaitu: a. Presisi (Ketelitian) Presisi merupakan derajat kesesuaian diantara masing-masing hasil uji, jika prosedur analisis diterapkan berulang kali pada sejumlah cuplikan yang diambil dari sampel homogen. Presisi dinyatakan sebagai

10 10 deviasi standar atau deviasi standar relatif (koefisien variasi). Presisi dapat diartikan pula sebagai derajat reprodusibilitas atau keterulangandari prosedur analisis (Harmita, 2004). Presisi dibagi menjadi tiga, yaitu keterulangan (repeatability), ketertiruan (reproducibility), dan presisi antara (intermediate precision). Repeatabillity adalah ukuran kemampuan metode untuk memberikan hasil yang mirip pada beberapa kali preparasi dan atau pengukuran untuk sampel yang sama. Keterulangan dapat diukur dengan menetapkan enam sampel pada konsentrasi 100% atau dengan preparasi sampel pada tingkat konsentrasi 80; 100; 120 dari target konsentrasi analit (Lister, 2005). Presisi antara adalah ukuran kemampuan metode untuk memberikan hasil yang reprodusibel dengan analisis yang berbeda, peralatan yang berbeda, atau hari yang berbeda (Lister, 2005). Tujuan dilakukannya uji presisi antara adalah untuk menetapkan presisi suatu metode pada kondisi laboratorium yang berbeda (Lee, 2004). Kriteria dari nilai RSD yang dapat diterima pada uji presisi adalah sebagaimana yang terlihat pada Tabel I (Gonzalez, dkk., 2010).

11 11 Tabel I. Nilai RSD suatu metode analisis yang dapat diterima berdasarkan besarnya konsentrasi analit. % Analit Fraksi Unit %RSD % RSD AOAC Analit Konsentrasi Horwitz % 2 1, % 2,8 1, % 4 2,7 0, ,10% 5,7 3,7 0, ppm 8 5,3 0, ppm 11,3 7,3 0, ppm , ppb 22,6 15 0, ppb , ppb 45,3 30 b. Akurasi Akurasi adalah ukuran derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit sebenarnya. Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (% recovery) analit yang ditambahkan dan dapat ditemukan melalui dua cara yaitu metode simulasi (spiked placebo recovery) dan metode penambahan bahan baku (standard addition method) (Synder dkk., 1997). Jika metode simulasi tidak dapat dilakukan maka akurasi dapat diukur dengan metode penambahan baku (Lister, 2005). Kriteria nilai perolehan kembali yang dapat diterima berdasarkan besarnya konsentrasi analit dapat dilihat pada Tabel II (Gonzales, dkk., 2010).

12 12 Tabel II. Nilai perolehan kembali suatu metode analisis yang dapat diterima berdasarkan besarnya konsentrasi analit. % Analit Fraksi Analit Unit Konsentrasi Rata-rata Perolehan Kembali (%) % % % , ,10% , ppm , ppm , ppm , ppb , ppb , ppb c. Selektivitas Selektivitas adalah kemampuan suatu metode analisis untuk mengukur analit secara akurat dan spesifik bila analit berada dengan komponen lain dalam matriks sampel seperti pengotor, produk degaradasi dan konponen matriks (Synder, dkk., 2010). Selektivitas seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan (degree of bias) metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan. Pada metode analisis yang melibatkan kromatografi, selektivitas ditentukan melalui perhitungan daya resolusinya (Rs) (Harmita, 2004). d. Linieritas Linieritas suatu metode analisis adalah kemampuan untuk menunjukkan bahwa nilai hasil uji langsung atau setelah diolah secara matematika, proporsional dengan konsentrasi analit dalam sampel dalam batas rentang konsentrasi tertentu. Rentang suatu metode analisis adalah

13 13 interval antara batas konsentrasi tertinggi dan konsentrasi terendah analit masih menggunakan ketelitian, ketepatan dan linieritas (Rohman dan Gandjar, 2007). Data linearitas devaluasi menggunakan metode statistik, yang paling umum digunakan adalah persamaan garis regresi antara respon detektor (sumbu-y) versus konsentrasi sampel (sumbu -x). Dalam suatu metode analisis, kriteria nilai r yang didapat harus lebih besar dari 0.99 (Miller dan Miller, 2005). e. Sensitivitas Kepekaan suatu metode analisis adalah kemampuannya untuk mengukur analit dalam konsentrasi yang sangat kecil (Marlia, 2009). Sensitivitas meliputi Batas Deteksi (Limit of detection/lod) dan Batas Kuantifikasi (Limit of quantitation/loq). Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blanko. Batas deteksi merupakan parameter uji batas. Cara yang paling umum untuk menghitung LOD adalah menetapkan jumlah sampel yang dapat memberikan perbandingan sinyal terhadap gangguan atau signal to noise (S/N) 2:1 atau 3:1, dan yang lebih sering digunakan adalah 3:1 (Lister, 2005). Definisi LOD yang umum digunakan adalah kadar analit yang memberikan respon sebesar respon blanko, Y B, ditambah simpangan baku blanko (S B ). Jadi, Y Y B = 3S B (Miller dan Miller, 1988).

14 14 Batas kuantitasi (LOQ/limit of quantitation) merupakan parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama (Harmita, 2004). LOQ seringkali didasarkan pada nilai signal to noise (S/N) = 10 (Snyder dkk., 1997). Batas kuantifikasi sering digunakan sebagai batas bawah untuk pengukuran kuantitatif yang tepat. Nilai Y B + 10 S B disarankan untuk batas kuantifikasi ini (Miller dan Miller, 1988). 4. Sediaan Injeksi Sediaan injeksi merupakan sediaan steril dapat berupa larutan, emulsi yang disuntikkan dengan memasukkan kedalam kulit atau melalui kulit atau selaput lendir. Pemilihan bentuk sediaan injeksi dalam klinik memerlukan pertimbangan khusus mengingat keuntungan dan kerugian pada penggunaan obat dengan cara ini. Komponen sediaan injeksi meliputi bahan obat, bahan tambahan dan pelarut. Metode pembuatan sediaan injeksi ada dua cara yaitu sterilisasi akhir dan cara aseptik, pemilihan metode yang cocok didasarkan pada sifat-sifat fisika kimia obat (Anonim, 1979). Injeksi metronidazol adalah larutan steril, isotonis dalam air untuk injeksi yang didapat mengandung metronidazol C6H9N3O3, tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0% dari jumlah yang tertera pada etiket (Anonim, 1995).

15 15 F. Landasan Teori Metronidazol mengandung unsur elektronegatif yang menjadikannya bersifat polar sehingga dapat dipisahkan dengan KCKT dan juga memiliki gugus kromofor sehingga dapat dianalisis dengan detektor UV. Berdasarkan Farmakope Edisi IV (1995), penetapan kadar metronidazol dalam sediaan injeksi dapat menggunakan KCKT dengan fase gerak berupa campuran air : metanol (97:3, v/v), laju alir lebih kurang 2,0 ml per menit, menggunakan kolom 4,6 mm x 25 cm dan fase diam yang digunakan adalah C18 dengan detektor ultraviolet pada panjang gelombang 320 nm. Penelitian tentang penetapan kadar metronidazol menggunakan KCKT dalam bentuk larutan yaitu sediaan sirup yang dilakukan oleh Hassan dkk., (2011) melakukan validasi metode KCKT untuk penetapan kadar metronidazol dalam sediaan sirup menggunakan fase diam C18 (150 mm X 4,6 mm yaitu 0,5 µm ukuran partikel) dan fase gerak berupa campuran air dan metanol (40:64, v/v), laju alir 1 ml/menit dengan detektor UV 254 nm. Penelitian menghasilkan validasi yang memenuhi persyaratan Farmakope Indonesia Edisi IV G. Hipotesis Validasi metode penetapan kadar metronidazol menggunakan KCKT dengan fase diam C18 dan fase gerak berupa campuran air:metanol (40:60, v/v) pada panjang gelombang 315 nm, dapat dilakukan dan dapat diaplikasikan dalam sediaan injeksi.