BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Bahan dan alat

Transkripsi

1 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi Tanaman Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, mulai bulan Juni sampai Oktober Bahan dan alat Bahan tanaman yang digunakan adalah planlet Paphiopedilum glaucophyllum berumur 1 tahun 9 bulan yang diperoleh dari Pusat Konservasi Tumbuhan (PKT) Kebun Raya Bogor. Zat pengatur tumbuh yang digunakan adalah BAP dan 2.4-D, dengan media dasar dari komposisi MS dan KC. Bahan yang lain adalah aquades sebagai pelarut media dasar MS dan KC, agar sebagai pemadat media, dan alkohol 70 % sebagai sterilan alat tanam. Komposisi media dasar MS dan KC disajikan pada Lampiran 2. Alat-alat yang dipakai adalah botol kultur dengan volume 300 ml, autoklaf, magnetik stirrer, gelas ukur, labu erlenmeyer, laminar air flow cabinet (LAFC), pisau scalpel, petridish, lampu bunsen, dan pinset. Gambar 3. Planlet Paphiopedilum glaucophyllum J.J. Smith yang telah Berumur 1 Tahun 9 Bulan pada Media KC sebagai Sumber Bahan Tanaman

2 14 Metodologi Percobaan di disain menggunakan Rancangan Acak Lengkap dan rancangan perlakuan yang disusun secara Faktorial dengan dua faktor perlakuan. Faktor pertama adalah media, yaitu dua jenis media dasar (media MS dan KC) yang terdiri dari empat taraf konsentrasi dari hara makro dan mikro, yaitu ¼, ½, ¾, dan 1. Faktor kedua adalah BAP yang terdiri dari dua taraf konsentrasi, yaitu 1 mg/l dan 2 mg/l. Zat pengatur tumbuh lain yang diberikan ke dalam setiap media adalah 0.5 mg/l 2.4-D. Kombinasi perlakuan disajikan pada Tabel 1. Tabel 1. Kombinasi Perlakuan Media (MS dan KC) dan BAP yang digunakan didalam Penelitian Perbanyakan Paphiopedilum glaucophyllum J.J. Smith secara In Vitro No. Jenis media Konsentrasi Hara Makro dan Mikro (L) Zat Pengatur Tumbuh 1 MS 1 MS ¼ Konsentrasi 1 mg/l BAP + 0,5 mg/l 2,4 D 2 MS 2 MS ½ Konsentrasi 1 mg/l BAP + 0,5 mg/l 2,4 D 3 MS 3 MS ¾ Konsentrasi 1 mg/l BAP + 0,5 mg/l 2,4 D 4 MS 4 MS 1 Konsentrasi 1 mg/l BAP + 0,5 mg/l 2,4 D 5 MS 5 MS ¼ Konsentrasi 2 mg/l BAP + 0,5 mg/l 2,4 D 6 MS 6 MS ½ Konsentrasi 2 mg/l BAP + 0,5 mg/l 2,4 D 7 MS 7 MS ¾ Konsentrasi 2 mg/l BAP + 0,5 mg/l 2,4 D 8 MS 8 MS 1 Konsentrasi 2 mg/l BAP + 0,5 mg/l 2,4 D 9 KC 1 KC ¼ Konsentrasi 1 mg/l BAP + 0,5 mg/l 2,4 D 10 KC 2 KC ½ Konsentrasi 1 mg/l BAP + 0,5 mg/l 2,4 D 11 KC 3 KC ¾ Konsentrasi 1 mg/l BAP + 0,5 mg/l 2,4 D 12 KC 4 KC 1 Konsentrasi 1 mg/l BAP + 0,5 mg/l 2,4 D 13 KC 5 KC ¼ Konsentrasi 2 mg/l BAP + 0,5 mg/l 2,4 D 14 KC 6 KC ½ Konsentrasi 2 mg/l BAP + 0,5 mg/l 2,4 D 15 KC 7 KC ¾ Konsentrasi 2 mg/l BAP + 0,5 mg/l 2,4 D 16 KC 8 KC 1 Konsentrasi 2 mg/l BAP + 0,5 mg/l 2,4 D Setiap perlakuan diulang tiga kali sehingga jumlah satuan percobaan adalah 48 satuan percobaan. Setiap ulangan terdiri dari tiga planlet sebagai satuan pengamatan. Jumlah satuan pengamatan dalam penelitian ini adalah 144 planlet. Tata letak penelitian disajikan pada Lampiran 3.

3 15 Model linier Y ij = μ + α i + β j + (αβ) ij + ε ijk Keterangan Y ijk μ α i β j (αβ) ij ε ijk i j = Respon pengamatan faktor perlakuan jenis media ke-i dan BAP ke-j = Nilai tengah umum = Pengaruh perlakuan jenis media ke-i = Pengaruh perlakuan BAP ke-j = Interaksi antara perlakuan media ke-i dan BAP ke-j = Pengaruh galat percobaan = Jenis media (media MS & Knudson C) pada taraf ¼, ½, ¾, dan 1 (hara makro & mikro). = BAP pada taraf 1 mg/l dan 2 mg/l k = Ulangan ke (1,2,3) Data yang diperoleh dari pengamatan setiap minggunya secara langsung dianalisis secara statistik menggunakan program SAS. Setiap data baru yang diperoleh langsung dibandingkan dengan data pengamatan sebelumnya. Jika hasil uji tersebut menunjukkan sidik ragam yang berbeda nyata pada taraf 5 % maka dilakukan uji lanjut DMRT pada taraf nyata 5 %. Pelaksanaan Penelitian Persiapan Bahan dan Alat Persiapan bahan tanaman dalam bentuk planlet botolan, bahan keperluan lain (alkohol, plastik, karet, kertas tisu), dan alat tanam. Pembuatan Larutan Stok Pembuatan larutan stok bertujuan untuk memudahkan pekerjaan dalam pembuatan media. Stok yang dibuat sesuai dengan komposisi media MS (Murashige dan Skoog) dan KC (Knudson C) yang disimpan dalam tabung erlenmeyer. Pembuatan larutan stok zat pengatur tumbuh 2.4-D (golongan auksin) dengan melarutkannya menggunakan pelarut KOH 1 N, sedangkan BAP (golongan sitokinin) dengan menggunakan pelarut DMSO (Dimethyl sulfoxide). Aquades ditambah sesuai volume yang diinginkan.

4 16 Pembuatan media perlakuan Perlakuan menggunakan dua jenis media, yaitu MS dan KC. Setiap jenis media dibuat dengan konsentrasi hara makro dan mikro yang berbeda, yaitu ¼ konsentrasi, ½ konsentrasi, ¾ konsentrasi, dan 1 konsentrasi pada masingmasing komposisi media. Media ¼ konsentrasi hara makro dan mikro komposisi media MS adalah : ¼ konsentrasi hara makro (NH 4 NO 3, KNO 3, CaCl 2.2H 2 O, MgSO 4.7H 2 O, KH 2 PO 4 ), ¼ konsentrasi hara mikro (FeSO 4.7H 2 O, Na 2 EDTA, MnSO 4.4H 2 O, ZnSO 4.7H 2 O, H 3 BO 3, KI, Na 2 MoO 4.2H 2 O, CuSO 4.5H 2 O, CoCl 2.6H 2 O), 1 konsentrasi vitamin, 1 konsentrasi Myo-inositol, dan 30 g/l gula. Media dengan konsentrasi ¼ dari konsentrasi hara makro dan mikro komposisi media KC adalah : ¼ konsentrasi hara makro (MgSO 4.7H 2 O, KH 2 PO 4, Ca(NO 3 ) 2, (NH 4 ) 2 SO 4 ), ¼ konsentrasi hara mikro (FeSO 4.7H 2 O, Na 2 EDTA, MnSO 4.4H 2 O, ZnSO 4.7H 2 O, H 3 BO 3, KI, Na 2 MoO 4.2H 2 O, CuSO 4.5H 2 O, CoCl 2.6H 2 O), dan 30 g/l gula. Kemudian ditambah 1 mg/l dan 2 mg/l BAP dan 0.5 mg/l 2.4-D pada masing-masing media. Air kelapa hanya ditambah pada media KC, sebanyak 100 ml/l. Kemasaman (ph) media diatur hingga mencapai 5.9 dengan menambah 1 N KOH atau 1 N HCl sesuai kebutuhan. Panaskan media sambil diaduk terus menerus secara merata, dan dituang pada botol kultur dengan takaran sekitar 20 ml per botol. Sterilisasi dengan autoklaf pada suhu C dan tekanan sebesar 0.1 bar selama 20 menit. Penanaman pada media perlakuan Penanaman planlet didalam Laminar Air Flow Cabinet (LAFC). Penanaman planlet pada media perlakuan menggunakan pinset. Tiga planlet Paphiopedilum glaucophyllum untuk setiap botol kultur. Penyusunan botol kultur sesuai rancangan lingkungan Rancangan Acak Lengkap (RAL). Penyimpanan (Inkubasi) Planlet Inkubasi planlet Paphiopedilum glaucophyllum pada ruang kultur yang berada di laboratorium. Ruang kultur menggunakan lampu flourescent dengan intensitas cahaya lux sebagai sumber cahaya. Lama penyinaran adalah 16 jam/hari. Suhu ruang kultur antara C untuk pertumbuhan dan

5 17 perkembangan planlet yang optimum. Penempatan botol-botol kultur secara acak pada rak-rak di ruang kultur. Sterilisasi Planlet Terkontaminasi Sterilisasi dilakukan pada planlet Paphiopedilum glaucophyllum yang mengalami kontaminasi. Bahan sterilan yang digunakan adalah alkohol dengan konsentrasi 10 % dan Sodium hypoclorit dengan konsentrasi 5 %. Planlet terkontaminasi dicuci menggunakan aquades steril, direndam kedalam alkohol 10 % selama 10 menit, dibilas aquades steril, dan direndam kedalam Sodium hypoclorit 5 % selama 5 menit. Subkultur Subkultur planlet Paphiopedilum glaucophyllum dilakukan dari botol kultur yang mengalami kontaminasi hanya pada media saja, sedangkan planlet tetap dalam kondisi steril. Subkultur dilakukan pada media yang sama. Pengamatan Pengamatan dilakukan pada seluruh planlet untuk memperoleh data yang diperlukan dalam analisis. Pengamatan dilakukan satu kali dalam seminggu dan dimulai pada satu minggu setelah tanam (1 MST) sampai enam belas minggu setelah tanam (16 MST). Peubah yang diamati adalah: 1. Jumlah planlet mati dan kontaminasi 2. Waktu munculnya tunas pertama 3. Jumlah tunas 4. Jumlah daun 5. Jumlah akar 6. Persentase planlet membentuk kalus 7. Pembentukan protocorm like bodies (plb)