BAB III METODE PENELITIAN

Transkripsi

1 17 BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Lingkungan Pusat Penelitian Lingkungan Hidup Institut Pertanian Bogor (PPLH IPB) dari bulan Maret hingga Juli Alat dan Bahan Peralatan yang digunakan dalam persiapan media yaitu meliputi timbangan analitik, gelas ukur, pipet, labu erlenmeyer, labu takar, gelas piala, pengaduk, botol kultur dan autoclave. Sedangkan untuk kegiatan penanaman alatalat yang digunakan antara lain laminar air flowcabinet, handsprayer, lampu bunsen, pinset, pisau, scalpel, tissue, dan cawan petri. Bahan-bahan yang diperlukan dalam pembuatan media antara lain agaragar, gula pasir, air steril, larutan stok media MS, BAP, propolis, dan PPM. Sedangkan untuk kegiatan sterilisasi dan penanaman bahan-bahan yang digunakan yaitu deterjen, fungisida dan bakterisida, clorox, HgCl 2, betadine, air steril, alkohol dan eksplan Pulai (Alstonia scholaris (L.) R. Br) bagian titik tumbuh. Bahan eksplan pulai merupakan jenis pulai darat yang berasal dari PT. Xylo Indah Pratama yang didatangkan dari pulau Sumatra. 3.3 Prosedur Kerja Sterilisasi alat dan media Kultur Alat-alat yang akan digunakan dalam kegiatan kultur jaringan seperti botol kultur, pinset, scalpel, cawan petri, pipet, pengaduk, gelas piala, labu takar dicuci bersih menggunakan detergen. Kemudian, alat-alat yang digunakan dalam penanaman disterilisasi dengan membungkus alat-alat tersebut menggunakan kertas tebal dan selanjutnya semua alat-alat tersebut diautoclave pada suhu 121⁰C -126⁰C dan tekanan 1,5 atm selama 60 menit. Sedangkan untuk media yang telah dimasukan ke dalam botol kultur lalu dimasukan ke dalam autoclave pada suhu 121⁰C -126⁰C dan tekanan 1,5 atm selama 20 menit.

2 Sterilisasi lingkungan kerja Pembersihan laboratorium dilakukan setiap hari terutama untuk penyeleksian botol kultur yang terkontaminasi. Pengepelan dan penyemprotan rak kultur dengan alkohol juga dilakukan secara berkala. Pembersihan tempat kerja (laminar air flow cabinet) dapat dilakukan dengan mengelap permukaan atau meja kerja menggunakan kapas atau tisu yang telah disemprot alkohol 70%. Lalu, sebelum dan selama pemakaian, blower atau peniup udara dalam laminar air flow cabinet harus dinyalakan untuk menghindari adanya kontaminan yang masuk ke dalam botol kultur ketika penanaman. Kemudian sebelum melakukan pekerjaan maka dilakukan penyemprotan dengan alkohol 70% terhadap kedua telapak tangan, botol kultur, ataupun alat-alat yang akan digunakan dalam penanaman Sterilisasi bahan tumbuhan (indukan) Proses dan tahapan karantina bahan indukan meliputi : 1. Penyemprotan dengan fungisida dan bakterisida atau antibiotika setiap sore secara bergiliran. - Fungisida (Antracol) 1 g/l dan Bakterisida (Agrept) 1 g/l dicampur dan dilarutkan - Antibiotika (Amoxiciline) 200 ml/l 2. Penyemprotan dengan hormon tunas atau Hyponex hijau + GA setiap pagi secara bergiliran - Hormon tunas 10 ml/l - Hyponex Hijau 2 g/l + GA 100 ml/l 3. Penggunaan Dekastar (N Tinggi) pada media tanam 4. Penyemprotan dengan insektisida Sterilisasi bahan eksplan Pulai yang sudah dikarantina dan akan diambil sebagai eksplan diberi perlakuan sterilisasi yang meliputi sterilisasi eksplan di luar laminar air flow cabinet dan sterilisasi eksplan di dalam laminar air flow cabinet. Adapun tahapan sterilisasi eksplan di luar lamiar air flow cabinet meliputi : 1. Pemotongan eksplan dari bahan indukan

3 19 2. Pengolesan dengan alkohol 70 % 3. Pencucian dengan air 4. Pencucian dengan detergen (10 menit) 5. Pencucian menggunakan air hingga bersih Sedangkan tahapan sterilisasi eksplan di dalam laminar air flow cabinet meliputi : 1. Pencucian menggunakan air steril selama ± 5 menit 2. Perendaman dengan HgCl 2 0,01 mg/100 ml selama 7-10 menit 3. Perendaman menggunakan clorox 5 % selama ± 3 menit 4. Perendaman dengan larutan betadine 0,5 ml/100 ml selama 7-10 menit 5. Pembilasan dengan air steril sebanyak 3 kali masing-masing selama 5 menit Pembuatan media Pembuatan larutan stok Pembuatan larutan stok dilakukan secara terpisah sesuai dengan pengelompokannya yaitu larutan stok makro, stok mikro, stok Fe-EDTA, stok vitamin dan stok hormon (BAP).Adapun rincian komposisinya yaitu larutan stok makro terdiri dari KNO 3, NH 4 NO 3, CaCl 2. 2H 2 O, MgSO 4. 7H 2 O dan KH 2 PO 4 (masing-masing dibuat secara terpisah). Larutan Stok mikro terdiri dari campuran MnSO 4. H 2 O, ZnSO 4. 7H 2 O, H 3 BO 3, KI, Na 2 MoO 4. 2H 2 O, CoCl.6H 2 O, 4CuSO 4. 5H 2 O. Larutan Stok Fe-EDTA terdiri dari campuran senyawa C 10 H 14 N 2 Na 2 O 8 2H 2 O (Na-EDTA) dan FeSO 4. 7H 2 O. Larutan stok vitamin terdiri dari Thiamin HCl, Nicotinic acid, Pyridoxin HCl, dan Glycin. Larutan stok hormon (BAP). Unsur hara yang telah ditimbang beratnya sesuai dengan yang telah ditentukan kemudian dilarutkan dengan 1 liter aquades. Setelah larutan stok selesai dibuat selanjutnya disimpan di lemari es Pembuatan media Murashige Skoog (MS) dengan larutan BAP Pembuatan media dimulai dengan pembuatan larutan stock MS dan hormon BAP yang telah dipersiapkan sebelumnya. Untuk pelaksananaan pembuatan media yaitu sebagai berikut : 1. Menyiapkan 200 ml air aquadest dalam gelas piala

4 20 2. Memipet dan memasukan larutan A, B, C, D, E, F, myo inositol masingmasing 5 ml, vitamin 2 ml, dan hormon (BAP) sebanyak 1,5 ml. 3. Memasukan 30 gram gula pasir 4. Menambahkan air aquadest hingga volume menjadi tepat 1000 ml 5. Mengukur ph larutan yaitu antara 5-6, jika terlalu asam tambahkan NAOH dan jika terlalu basa tambahkan HCl 6. Memasukan 6 gram agar-agar kedalam larutan tersebut 7. Memasak larutan media dalam panci hingga mendidih 8. Menuangkan media kedalam botol kultur (±10 ml) 9. Menutup botol dengan plastik dan karet 10. Mensterilisasikan media didalam autoclave pada suhu 121⁰C-126⁰C dan tekanan 1,5 atm selama 20 menit. 11. Memasukan media-media yang sudah steril kedalam plastik dan simpan di lemari Pembuatan media perlakuan Pembuatan media perlakuan diawali dengan proses yang sama ketika membuat media kontrol (MS0+BAP1,5). Akan tetapi untuk media perlakuan pada larutan MS0+BAP1,5 ditambahkan antibiotika berupa PPM dan/atau propolis sesuai dengan perlakuan yakni sebesar 0 ml/l, 0,5 ml/l, 1ml/l, 1,5 ml/l dan 2 ml/l. Penambahan antibiotika ini (PPM dan/atau propolis) dilakukan sebelum larutan MS0+BAP1,5 diencerkan dengan air aquades hingga volume akhir 1 liter terdapat pada media yang sudah lengkap. Setelah larutan media perlakuan selesai dibuat, larutan tersebut lalu diukur dengan menggunakan ph meter. Pada umumnya ph media yang digunakan yakni 5,6-5,8, bila larutan Ph>5,8 maka dilakukan penambahan HCL dan jika ph< 5,6 maka dilakukan penambahan NAOH. Selanjutnya larutan media ditambahkan dengan agar-agar sebanyak 6 gr/l dan dimasak hingga mendidih. Setelah itu larutan dituang kedalam botol-botol kultur sebanyak 10 ml. Lalu botol ditutup dengan rapat dan beri label. Langkah selanjutnya yaitu melakukan sterilisasi media tersebut dalam autoclave pada suhu 121⁰C-126⁰C dengan 1,5 atm selama 20 menit.

5 Penanaman Penanaman eksplan pulai dilakukan di dalam laminar air flow cabinet. Setelah dilakukan sterilisasi pada eksplan kemudian eksplan dimasukan ke dalam petridish dan potong bagian tumbuhan yang terkena bahan sterilan lalu tanam dalam media kultur, setelah selesai penanaman botol kultur diletakan dalam ruang kultur. 3.4 Pengamatan Pengamatan dilakukan selama kurang lebih 8 minggu setelah tanam dan pengambilan data dilakukan setiap satu minggu sekali. Hal yang diamati yaitu : - Jumlah eksplan yang hidup ditandai dengan jumlah eksplan yang berwarna kehijauan. - Jumlah eksplan yang mati ditandai dengan jumlah eksplan yang mengalami browning (pencoklatan) atau berwarna merah dan tidak muncul tunas. - Jumlah eksplan yang mengalami kontaminasi ditandai dengan adanya jamur (cendawan) dan bakteri. Selain itu, untuk mengetahui pengaruh pemberian antibiotika pada pertumbuhan eksplan pulai maka dilakukan pengamatan terhadap : - Jumlah tunas yang tumbuh - Pertambahan tinggi tunas - Jumlah daun yang tumbuh 3.5 Rancangan Percobaan Percobaan ini dilakukan pada tahap inisiasi dengan jenis eksplan pucuk. Adapun rancangan percobaan ini dirancang dengan menggunakan percobaan faktorial dua faktor dengan dasar rancangan acak lengkap (RAL). Faktor pertama adalah jenis antibiotika yang terdiri dari : Plant preservative mixture (PPM) dan Propolis. Faktor yang kedua yakni konsentrasi yang terdiri dari lima taraf yaitu 0ml/l, 0,5 ml/l, 1 ml/l, 1,5 ml/l, dan 2 ml/l. Dengan demikian terdapat 5 2 = 25 perlakuan dan setiap perlakuan terdiri dari 10 ulangan sehingga seluruhnya terdapat 250 satuan percobaan. Setiap satuan percobaan terdiri dari satu botol

6 22 yang berisi satu eksplan. Berikut merupakan gambaran interaksi antar faktor dari percobaan yang dilaksanakan : Tabel 4. Interaksi faktor jenis antibiotika dengan konsentrasinya PPM (ml/l) Propolis (ml/l) (B) (A) 0 (B0) 0,5 (B1) 1 (B2) 1,5 (B3) 2 (B4) 0 (A0) A0B0 A0B1 A0B2 A0B3 A0B4 0,5 (A1) A1B0 A1B1 A1B2 A1B3 A1B4 1 (A2) A2B0 A2B1 A2B2 A2B3 A2B4 1,5 (A3) A3B0 A3B1 A3B2 A3B3 A3B4 2 (A4) A4B0 A4B1 A4B2 A4B3 A4B4 Keterangan : A0B0 = Kontrol 3.6 Analisis Data Perhitungan parameter kualitatif meliputi persentase kontaminasi oleh jamur dan bakteri, browning (pencoklatan), dan kematian pada eksplan dengan menggunakan rumus sebagai berikut : %Tingkat kontaminasi = eksplan yang terkontaminasi x 100% N %Tingkat pencoklatan = eksplan yang mengalami pencoklatan x 100% N %Tingkat kematian = eksplan yang mengalami kematian x 100% N %Tingkat keberhasilan = eksplan yang bertunas x 100% N Keterangan : N adalah jumlah total eksplan yang tersedia pada setiap perlakuan Adapun model linear rancangan percobaan yang digunakanyaitu sebagai berikut (Mattjik & Sumertawijaya 2002) : Dimana : i = 1,2 j = 1,2,3,4,5 k = 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 Y ijk =µ + α i + β j + (αβ)ij + ε ijk

7 23 Keterangan : Y ijk : Hasil pengamatan terhadap eksplan Alstonia scholaris (L) R.Br pada pengaruh jenis antibiotika ke-i, konsentrasi ke-j, dan ulangan ke-r µ : Nilai tengah umum (rata-rata populasi) α i : Pengaruh perlakuan antibiotika ke-i β j : Pengaruh perlakuan konsentrasi antibiotika ke-j (αβ) ij : Pengaruh interaksi perlakuan antibiotika ke-i dan konsentrasi ke-j ε ijk : Pengaruh acak pada perlakuan antibiotika ke-i, konsentrasi ke-j dan ulangan ke-r. Hipotesis : H 0 : P 1 = P 2 = P i = 0 H 1 : ada satu P i 0 Uji Hipotesis : Terima H 0 = Perbedaan taraf pemberian antibiotika pada kultur tidak berpengaruh nyata terhadap tingkat kontaminasi pada selang kepercayaan 95% (α=0,05) Terima H 1 = Sekurang-kurangnya ada taraf pemberian antibiotika pada kultur yang berpengaruh nyata terhadap tingkat kontaminasi pada selang kepercayaan 95% (α= 0,05) Untuk mengetahui pengaruh yang diberikan pada percobaan dilakukan uji- F yang diperoleh dari hasil analisis ragam atau analysis of variance (ANOVA). Kemudian dibandingkan dengan F tabel pada selang kepercayaan 95% (α=0,05) dengan kaidah : 1. Jika F hitung < F tabel maka H 0 diterima, H 1 ditolak sehingga pemberian antibiotika pada kultur tidak berpengaruh nyata terhadap tingkat kontaminasi. 2. Jika F hitung > F tabel maka H 0 ditolak H 1 diterima sehingga pemberian antibiotika pada kultur berpengaruh nyata terhadap tingkat kontaminasi.

8 24 Jika sidik ragam memberikan hasil berpengaruh nyata, selanjutnya dilakukan uji Duncan untuk mengetahui beda antar perlakuan. Pengolahan data dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak SPSS 16.0.