METODE PENELITIAN Tempat dan Waktu Penelitian Alat dan Bahan

Transkripsi

1 13 I. METODE PENELITIAN A. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Fisiologi Tumbuhan dan Bioteknologi Fakultas Pertanian Univeristas Sebelas Maret Surakarta mulai bulan Oktober 2015 hingga Maret B. Alat dan Bahan 1. Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah botol kultur dan tutup botol yang dicuci dengan larutan deterjen (sunlight) dan pemutih pakaian (chlorox) dan peralatan diseksi yaitu pinset, pisau, kertas alas dan cawan petri yang seterlah dicuci disterilisasi dengan autoclave selama 30 menit. 2. Bahan a. Eksplan Bahan tanam berupa meristem apikal dan meritem lateral diperoleh dari bibit sawo yang diambil dari perkebunan rakyat di Wonogiri yang dipelihara di screen Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta. b. Sterilisasi Bahan yang digunakan dalam sterilisasi di luar laminar air flow cabinet (LAFC) adalah aquadest, deterjen (sunlight), bakterisida (agrept) dan fungisida (dithane). Sementara bahan sterilisasi dalam keadaan aseptik digunakan aquadest steril, cairan pemutih pakaian (chlorox 50%), asam askorbat, asam sitrat dan spirtus. c. Woody Plant Medium (WPM) Bahan dasar media WPM adalah larutan stok dari unsur hara makro yang tersusun atas NH 4 NO 3, Ca(NO 3 ) 2.2H 2 O, CaCl 2.2H 2 O, MgSO 4.7H 2 O, K 2 SO 4 dan KH 2 PO 4 ; unsur hara mikro yang tersusun atas Na 2 MoO 4.2H 2 O, ZnSO 4.7H 2 O MnSO 4.H 2 O, ZnSO 4.7H 2 0, H 3 BO 3, CuSO 4.5H 2 O, FeSO 4.7H 2 O dan Na 2 EDTA; larutan vitamin yang tersusun atas myoinositol, thiamine HCl, pyridoxine HCl, glycine dan nicotinic acid 13

2 14 serta larutan stok zat pengatur tumbuh BAP. Bahan lain yang digunakan adalah agar sebagai pengeras media, gula sebagai sumber karbon, dan NaOH dan HCl sebagai pengontrol ph (5,80-5,83). C. Perancangan Penelitian dan Analisis Data Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Fisiologi Tumbuhan dan Bioteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta. Rancangan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap 2 faktor. Faktor 1 adalah macam eksplan (meristem apikal dan meristem lateral) dan faktor 2 adalah ZPT BAP (0 ppm, 2 ppm, 3 ppm, 4 ppm dan 5 ppm) yang dikombinasikan dan diulang sebanyak 3 kali sebagai berikut: 1. M1B0 = Meristem apikal + BAP 0 ppm 2. M1B1 = Meristem apikal + BAP 2 ppm 3. M1B2 = Meristem apikal + BAP 3 ppm 4. M1B3 = Meristem apikal + BAP 4 ppm 5. M1B4 = Meristem apikal + BAP 5 ppm 6. M2B0 = Meristem lateral + BAP 0 ppm 7. M2B1 = Meristem lateral + BAP 2 ppm 8. M2B2 = Meristem lateral + BAP 3 ppm 9. M2B3 = Meristem lateral + BAP 4 ppm 10. M2B4 = Meristem lateral + BAP 5 ppm Data hasil penelitian dianalisis secara deskriptif dan variabel panjang daun menggunakan analisis ragam berdasarkan uji F taraf 5%. D. Pelaksanaan Penelitian Tata laksana penelitian adalah sebagai berikut: 1. Pengambilan sample Pengambilan sample dilakukan dengan melakukan survei di Desa Kepuh Sari Kecamatan Manyaran Kabupaten Wonogiri dengan mengumpulkan bibit yang ditumbuh disekitar indukan sawo yang kemudian dipindahtanamkan dirumah kaca. Pemotongan tanaman muda untuk diambil bagian meristem apikal dan lateral hanya dilakukan pada hari dimana akan berlangsungnya

3 15 penanaman secara kultur jaringan. Hal ini dimaksutkan agar bagian tanaman yang akan dijadikan eksplan dalam kondisi segar. 2. Pembuatan Medium Medium yang digunakan adalah Woody Plant Medium (WPM) yang dikombinasikan dengan berbagai konsentrasi BAP. Pembuatan medium ini dilakukan 2 minggu sebelum penanaman eksplan. a. Pembuatan Larutan stock Pembuatan larutan stok bertujuan untuk memudahkan pekerjaan pada saat pembuatan medium dan menghemat pekerjaan menimbang bahan yang berulang-ulang setiap kali membuat medium. Larutan stok medium WPM yang disimpan dalam botol atau Erlenmeyer. b. Persiapan Medium Medium yang digunakan adalah WPM yang dibuat sebanyak ¼ liter (250 ml) untuk 10 botol kultur. Media ini dibuat dengan cara mencampurkan larutan stok hara makro, hara mikro, vitamin, FeEDTA dan ZPT yang berupa BAP dengan gula sebanyak 7,5 gram kemudian dilarutkan dengan akuades hingga 250 ml. Larutan dikondisikan dengan ph 5,80-5,83 dengan menambahkan NaOH atau HCl. Larutan ditambah agar-agar sebanyak 2 gram, yang diaduk dengan magnetic stirrer dan dipanaskan hingga mendidih dengan hot plate stirrer. Larutan tersebut kemudian dituang ke dalam botol-botol kultur ±25 ml/botol, kemudian ditutup dengan plastik PP 0,033 mm dan diikat dengan karet. Botol-botol tersebut dimasukkan ke dalam autoclave untuk disterilisasi dengan tekanan 1,5 psi (kg/cm 3 ) pada suhu 120 o C selama 45 menit. Media yang telah steril tersebut selanjutnya disimpan pada rak-rak kultur dan disusun sesuai dengan perlakuan.. 3. Sterilisasi a. Sterilisasi Alat Sterilisasi alat dilakukan dengan membersihkan seluruh peralatan yang digunakan untuk penanaman. Botol-botol kultur direndam dalam soda api sebelum dicuci dengan deterjen dan chlorox, begitu juga

4 16 dilakukan terhadap alat diseksi dan tutup botol. Setelah kering, alat-alat tersebut kemudian dimasukkan ke dalam autoclave untuk disterilisasi pada tekanan 1,5 psi (kg/cm 3 ) pada suhu 120 o C selama 45 menit. b. Sterilisasi Eksplan Eksplan yang digunakan berupa meritem apikal dan meristem lateral pada sawo. Tahapan sterilisasi eksplan sebagai berikut: 1) Di luar LAF a) Eksplan dibersihkan dengan aquadest sampai bersih. b) Eksplan dicuci dengan sunlight hingga bersih kemudian dibilas hingga tidak licin. c) Eksplan direndam ke dalam botol berisi campuran dithane 1,5 gr/100 ml dan agrept 1 gr/100 ml selama 15 menit. d) Eksplan dibersihkan dengan aquadest sampai bersih. 2) Di dalam LAF a) Eksplan dibersihkan dengan aquadest steril sampai bersih. b) Eksplan dicelupkan ke dalam botol berisi chlorox 50 %selama 1 menit kemudian celup lalu angkat ke dalam botol berisi alkohol 70%. Kemudian direndam dalam larutan vitamin c selama 15 menit. 4. Penanaman eksplan Penanaman eksplan harus dilakukan dalam kondisi steril untuk menghindari kontaminasi. Oleh karena itu, penanaman eksplan dilakukan dalam LAF (Laminar Air Flow Cabinet). Botol kultur yang berisi medium dipanasi terlebih dahulu pada bagian mulut botol untuk mencegah terjadinya kontaminasi. Tutup botol dibuka dengan hati-hati kemudian eksplan ditanam dengan menggunakan pinset steril. Untuk menjaga sterilisasi dari alat, maka pinset selalu dipanaskan sebelum digunakan. Eksplan kemudian dilewatkan pada api sebelum dilakukan penanaman. Sebelum ditutup, mulut botol dan tutup botol dipanaskan kembali. Kemudian melapisi dengan wrap plastic pada leher botol. Setelai usai, menempelkan kertas label sesuai perlakuan masing-masing dan tanggal penanaman.

5 17 5. Pemeliharaan Pemeliharaan dilakukan dengan cara menyemprotkan spirtus dua hari sekali pada botol-botol kultur untuk menghindari kontaminasi. Mengeluarkan botol yang telah terkontaminasi dari ruang inkubasi untuk menekan penyebaran jamur maupun bakteri agar tidak menginfeksi eksplan yang masih sehat. E. Pengamatan Peubah Variabel pengamatan yang perlu diamati selama penelitian berlangsung antara lain: 1. Waktu Muncul Tunas Pengamatan dilakukan setiap hari untuk mengetahui kapan waktu muncultunas lalu dicatat waktunya. Waktu muncul tunas ditentukan dalam HST (Hari Setelah 2. Panjang Tunas Pengamatan dilakukan setiap minggu sekali dengan mengukur panjang tunas menggunakan kertas milimeter hingga umur 13 MST (Minggu Setelah 3. Jumlah Tunas Pengamatan dilakukan setiap minggu sekali dengan menghitung jumlah tunas yang terbentuk pada eksplan hingga umur 13 MST (Minggu Setelah 4. Waktu Muncul Daun Pengamatan dilakukan setiap hari untuk mengetahui kapan waktu munculdaun lalu dicatat waktunya. Waktu muncul daun ditentukan dalam HST (Hari Setelah 5. Panjang Daun Pengamatan dilakukan setiap minggu sekali dengan mengukur panjang daun menggunakan kertas milimeter hingga umur 13 MST (Minggu Setelah

6 18 6. Jumlah Daun Pengamatan dilakukan setiap minggu sekali dengan menghitung jumlah daun yang muncul pada eksplan hingga umur 13 MST (Minggu Setelah 7. Waktu Muncul Akar Pengamatan dilakukan setiap hari untuk mengetahui kapan waktu munculakar lalu dicatat waktunya. Waktu muncul daun ditentukan dalam HST (Hari Setelah 8. Panjang Akar Pengamatan dilakukan setiap minggu sekali dengan mengukur panjang akar menggunakan kertas milimeter hingga umur 13 MST (Minggu Setelah 9. Jumlah Akar Pengamatan dilakukan setiap minggu sekali dengan menghitung jumlah akar yang muncul pada eksplan hingga umur 13 MST (Minggu Setelah 10. Kalus Pengamatan dilakukan diakhir penelitian saat berumur 13 MST (Minggu Setelah Tanam) dengan mengidentifikasi jenis, tekstur dan warna kalus.