Pembuatan Larutan Stok, Media Kultur Dan Sterilisasi Alat Kultur Jaringan Tumbuhan. Nikman Azmin

Transkripsi

1 Pembuatan Larutan Stok, Media Kultur Dan Sterilisasi Alat Kultur Nikman Azmin Abstrak; Kultur jaringan menjadi teknologi yang sangat menentukan keberhasilan dalam pemenuhan bibit. Kultur jaringan merupakan salah satu sarana rekayasa genetik. Berbagai komposisi media kultur telah diformulasikan untuk mengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman yang dikulturkan. Unsur-unsur yang dibutuhkan pada media kultur jaringan antara lain seperti unsur mikro, unsur makro, gula, vitamin, zat pengatur tumbuh, dan agar-agar. Media yang digunakan pada praktikum ini adalah media MS (Murashige and Skoog). Media ini mempunyai konsentrasi yang tepat untuk semua jenis eksplan. Tujuan penelitian ini adalah memahami teknik pembuatan larutan stok, media kultur dan sterilisasi alat kultur jaringan. Kegunaan penelitian ini yaitu memberikan informasi tentang teknik pembuatan larutan stok, media kultur jaringan. Penelitian ini dilakukan Laboratorium Fisiologi Tumbuhan dan Bioteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta mulai pada tanggal 04 September 2013 sampai dengan tanggal 03 Desember Metode yang digunakan adalah metode eksperimen dengan pembuatan Media Larutan Stok. Hasil penelitian menunjukan bahwa Media Murashige and Skoog (MS) tidak menunjukkan adanya tanda-tanda kontaminasi oleh jamur atau bakteri meski sampai jangka waktu satu minggu. Hal ini menunjukkan bahwa media yang dibuat dalam kondisi steril dan siap untuk digunakan. Kata Kunci: Larutan Stok, Media Kultur dan Sterilisasi PENDAHULUAN Kultur jaringan merupakan teknologi yang mau tidak mau harus kita kuasai, karena sudah tidak terbendung lagi kebutuhan yang sangat besar akan bibitbibit berkualitas dalam bidang kehutanan, perkebunan, pertanian dll. Kultur jaringan merupakan metode untuk mengisolasi bagian tanaman seperti jaringan serta menumbuhkannya dalam kondisi aseptik sehingga dapat menjadi tanaman lengkap (Anjar, 2008). Dengan kultur jaringan dapat diperoleh perbanyakan mikro atau produksi tanaman dalam jumlah besar dan waktu yang diperlukan relative lebih singkat (Susila, 2006) Maka kultur jaringan menjadi teknologi yang sangat menentukan keberhasilan dalam pemenuhan bibit. Kultur jaringan merupakan salah satu sarana rekayasa genetik. Benih yang unggul dari proses rekayasa genetik diperbanyak melalui sistem kultur jaringan. Masih banyak pertentangan mengenai tekhnologi ini baik orang awam maupun para ilmuwan. Yang menjadi kekhawatiran sebagian besar ilmuwan adalah proses rekayasa genetic tidak memperhitungkan dampak secara umum, tetapi para perekayasa hanya 38 Oryza Jurnal Pendidikan Biologi Volume 4 Nomor 1 April 2015

2 meneseting/ merekayasa atau mengotak atik tumbuhan sesuai dengan kebutuhan yang diharapkan yang diharapkan tanpa memperhitungkan resiko secara umum yang ditimbulkan sehingga hasilnya tidak sesuai dengan harapan Dalam kultur jaringan mempunyai kelebihan dan kekurangan yaitu: bibit dapat diperbanyak dalam jumlah besar dan cepat, bibit unggul, cepat berbuah serta tahan lama dan penyakit, seragam atau sama dengan induknya, tetapi dapat juga menimbulkan keberagaman, efisien tempat dan waktu, tidak tergantung musim, dapat diperbanyak secara continyu, untuk skala besar biaya lebih murah, cocok untuk tanaman yang sulit bergenerasi, merupakan sarana meningkatkan kualitas tanaman misalnya jenis tanaman tertentu terserang virus maka dengan kultur jaringan dapat dihasilkan tanaman bebas virus, Peluang untuk menghasilkan bahan biokatif/metabolit sekunder tanpa menanam di luar atau di lapang (Torres, 2005). Dalam kultur jaringan yang menjadi penghambat biasa virus, bakteri dan jamur yang dapat menyebabkan tidak berhasilnya kultur jaringan. Media yang umum digunakan dalam kultur jaringan adalah medium padat, medium semi padat dan medium cair. Keadaan fisik media akan mempengaruhi pertumbuhan kultur jaringan, kecepatan pertumbuhan dan diferensiasinya. Keadaan fisik media ini mempengaruhi pertumbuhan antara lain karena efeknya terhadap osmolaritas larutan dalam media serta ketersediaan oksigen bagi pertumbuhan eksplan yang dikulturkan. Berbagai komposisi media kultur jaringan telah diformulasikan untuk mengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman yang dikulturkan. Unsur-unsur yang dibutuhkan pada media kultur jaringan antara lain seperti unsur mikro, unsur makro, gula, vitamin, zat pengatur tumbuh, dan agar-agar. Media yang digunakan pada praktikum ini adalah media MS Murashige and Skoog (Hemawan et al, 2006). Media ini mempunyai konsentrasi yang tepat untuk semua jenis eksplan. Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botolbotol kaca. Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf. Komposisi dan konsentrasi hormon pertumbuhan yang ditambahkan dalam media sangat mempengaruhi arah pertumbuhan dan regenerasi eksplan yang dikulturkan. Komposisi dan konsentrasi hormon pertumbuhan yang ditambahkan ke dalam media kultur sangat tergantung dari jenis eksplan yang dikulturkan dan tujuan 39 Oryza Jurnal Pendidikan Biologi Volume 4 Nomor 1 April 2015

3 pengkulturannya. Konsentrasi hormone pertumbuhan optimal yang ditambahkan ke dalam media tergantung pula dari eksplan yang dikulturkan serta kandungan hormon pertumbuhan endogen yang terdapat pada eksplan tersebut. Komposisi yang sesuai ini dapat diperkirakan melalui percobaanpercobaan yang telah dilakukan sebelumnya disertai percobaan untuk mengetahui komposisi hormone pertumbuhan yang sesuai dengan kebutuhan dan arah pertumbuhan eksplan yang diinginkan. Dalam kultur jaringan untuk menghambat terjadinya kontaminan pada media maupun eksplan dilakukan sterilisasi. Keberhasilan darai kultur jaringan sangat bergantung dari ketepatan konsentrasi nutrisi yang berada di dalam media kultur (Ahmad, 2007). Ketepatan konsentrasi ini menyangkut pada ketersediaan nutrisi bagi eksplan tanaman. Kelebihan nutrisi dari tanaman akan menyebabkan tanaman mengalami keracunan unsur hara (Hadioetomo, 2006). Oleh karena itu, pembuatan larutan stock dan sterilisasi media dianggap penting untuk diketahui sebagai sarana penenunjang kebutuhan informasi akan kultur jaringan METODE PENELITIAN Pembuatan Larutan Stok, Media Kultur Dan Sterilisasi Alat dilaksanakan pada Laboratorium Fisiologi Tumbuhan dan Bioteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta. Pembuatan Larutan Stok Media Menimbang bahan bahan kimia yang telah dikalikan menjadi beberapa kali konsentrasi, misalanya untuk unsur hara makro dikalikan 20 kali dan unsur hara mikro dikalikan 100 kali konsentrasi. Melarutkan bahan- bahan kimia tersebut kedalam aquadest dengan volume tertentu, misalnya 500 ml. Memasukkan masing- masing larutan kedalam botol dan menyimpan kedalam refrigerator. Pembuatan Larutan Stok Pengatur Tumbuh Zat Pengatur Tumbuh (ZAT) hanya diperlukan dalam jumlah sedikit sekali. Biasanyazat pengatur tumbuh ini dibuat dengan kepekatan 1-10 mg/ml. Cara membuat larutan stok masing- masing Zat Pengatur Tumbuh (ZPT) adalah sebagai berikut : Menghitung kebutuhan bahan BAP 100 ppmsebanyak 300 ml adalah sebagai berikut : 100 ppm = 100 mg/l = 30 mg / 0,3 l = 30 mg / 300 ml Melarutkan bahan dengan Alkohol atau NaOH 1 N kemudian ditambah dengan aquadest samapi 300 ml untuk BAP. Memasukkan masing- masing kedalam 40 Oryza Jurnal Pendidikan Biologi Volume 4 Nomor 1 April 2015

4 larutan tersebut kedalam botol dan menyimpannya kedalam refrigerator Pembuatan Media (1). Mengambil masing-masing larutan stock sesuai dengan ukuran yang telah ditentukan dan memasukkannya ke dalam gelas piala, (2) Mengambil larutan stock ZPT sesuai dengan perlakuan, (3). Menambah aquadest sampai 1000 ml (4). Menambah gula sebanyak 30 gr, (5). Mengatur ph dalam kisaran 5,8-6,3 dengan menambahkan beberapa tetesnaoh untuk menaikkan ph atau HCl untuk menurunkan ph. Pada saat pengukuran ph, larutan media diaduk dengan magnetic stirrer, (6). Menambahkan agar-agar 8 gr kemudian dididihkan. (7). Menuangkan larutan media ke dalam botol-botol kultur kurang lebih 25 ml tiap botol. (8). Menutup botol berisi larutan media dengan plastic, (9). Memasukkan botol botol berisi media kedalam autoklaf untuk proses sterilisasi pada tekanan 1,5 kg/ cm 2 selama 45 menit. (10). Menyimpan media pada rak penyimpan media yang bertujuan untuk mengantisipasi ada tidaknya kontaminasi pada media sehingga dapat dicegah penggunaan media yang telah terkontaminasi pada saat penanaman. Untuk membuat media 1 Liter dengan konsentrasi BAP 2 ppm, maka volume larutan stock yang diambil adalah : V1 x M1 V1 x 100 ppm V1 = V2 x M2 = 1000 ml x 0,5ppm = 20 ml/l Untuk membuat media 1 L dengan konsentrasi IAA 0,5 ppm, maka volume larutan stock yang diambil adalah : V1 x M1 = V2 x M2 V1 x 100 ppm =1000ml x 0,5 ppm V1 = 5 ml/l Keterangan : V1 :volume larutan stock yang diambil V2 : volume media yang akan dibuat M1: dosis larutan stock yang tersedia M2: dosis media yang akan dibuat Media Penanaman Media yang digunakan adalah media Murashige dan Skoog (MS) yang dimodifikasi dengan penambahan ZPT BAP 2 ppm dan IAA 0,5 ppm. Media kultur tersebut digunakan untuk penanaman 4 macam eksplan dengan masing-masing eksplan diulang sebanyak 2 kali HASIL PENELITIAN Pembuatan Media Hasil pengamatan bahwa media MS tidak menunjukkan adanya tanda-tanda kontaminasi oleh jamur atau bakteri meski sampai jangka waktu satu minggu. Hal ini 41 Oryza Jurnal Pendidikan Biologi Volume 4 Nomor 1 April 2015

5 menunjukkan bahwa media yang dibuat dalam kondisi steril dan siap untuk digunakan. Hal ini juga didukung dengan hasil penelitian Hermawan & Na iem (2006) menyatakan bahwa apabila media yang sudah terkontaminasi dengan jamur dan bakteri makan eksplan yang ditanam tidak akan pernah tumbuh Sterilisasi Alat Kultur Dari hasil penelitian yang telah kami lakukan pada kultur jaringan, dimulai dengan sterilisasi alat yang akan digunakan sehari sebelum pelaksanaan praktikum agar alat steril dan tidak terjadi kontaminasi pada saat melakukan praktikum kultur jaringan. Alat-alat yang digunakan harus dalam keadaan steril. Karena kondisi yang steril akan menentukan berhasil tidaknya suatu kegiatan kultur jaringan. Karena jika kondisinya tidak steril, maka akan mudah terkena kontaminasi sehingga kemampuan totipotensi sel akan terhambat. Alat-alat logam dan gelas yang digunakan pada saat penanaman dapat disterilkan dalam autoklaf. Alat tanam seperti: pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam bacticinerator ataupun pembakar Bunsen Media Larutan Stok Pengatur Tumbuh (ZAT) Zat Pengatur Tumbuh (ZAT) yang dibuat berdasarkan hasil penelitian yaitu NAA dan termasuk dalam golongan auksin yang fungsinya untuk merangsang pemanjangan sel-sel pucuk. NAA amat lambat diuraikan oleh sel tumbuhan, dan stabil pada pemanasan dengan autoklaf. BAP termasuk dalam golongan sitokinin yang fungsinya untuk meningkatkan pembelahan sel pada jaringan tanaman serta mengatur pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Semua medium kultur in vitro dilengkapi sumber karbon dan energi. Hampir semua kultur memperlihatkan respon pertumbuhan yang optimum dengan pemberian disakarida dalam bentuk sukrosa. Hal ini didukung dengan pernyataan Hermawan & Na iem (2006), menyatakan bahwa Penambahan agar berfungsi sebagai zat pemadat pada medium. Keasaman medium adalah salah satu yang mempengaruhi keberhasilan kultur jaringan tanaman. Pada umumnya, keasaman medium ditetapkan antara 5,6-5,8. Medium yang terlalu asam (ph<4,5) atau terlalu basa (ph>7,0) dapat menghambat pertumbuhan dan perkembangan eksplan (Anjar, 2008) 42 Oryza Jurnal Pendidikan Biologi Volume 4 Nomor 1 April 2015

6 Komposisi media yang digunakan dalam 1 liter, yaitu: hara makro sebanyak 50 ml, hara mikro 10 ml, FEDTA 50 ml, vitamin 50 ml, BAP 1 ppm (20 ml), NAA 0,5 ppm (10 ml), gula 30 gr, agar 8 gr, dan dengan ph 6,2. Larutan stok dibuat karena unsur hara makro, mikro, maupun zat pengatur tumbuhan yang diperlukan jumlahnya sangat sedikit, sehingga dapat mempermudah dalam penimbangan bahan kimia. Selain itu sisa larutan stok dapat disimpan dan dapat digunakan lagi apabila membuat medium yang lain. Medium MS yang dimodifikasi banyak digunakan untuk hampir semua macam tanaman seperti tanaman dikotil dan tanaman herbaceus. Hal ini terjadi karena medium MS memiliki kandungan garam-garam yang lebih tinggi daripada media lain, selain itu kandungan nitratnya juga tinggi. Peralatan dan medium disterilisasi dengan menggunakan autoklaf model listrik pada suhu 121 o C, tekanan 15 lb, selama 30 menit dilanjutkan dengan drying selama 15 menit. Teknik pelaksanaan sterilisasi dengan autoklaf adalah sebagai berikut: autoklaf di isi air sampai batas sang-sang, kemudian peralatan dan medium dimasukkan ke dalamnya. Setelah autoklaf tertutup rapat, kemudian dinyalakan dan ditunggu selama 30 menit. Setelah sterilisasi lalu dinyalakan drying dan ditunggu selama 15 menit. Setelah selesai drying ditunggu sampai tekanan menunjukkan angka nol, kemudian autoklaf boleh dibuka dan dikeluarkan peralatan beserta mediumnya. KESIMPULAN Berdasarkan pengamatan yang telah dilakukan dapat diambil kesimpulan sebagai berikut: kondisi yang seteril akan menentukan berhasil tidaknya suatu kegiatan kultur jaringan, media adalah tempat bagi jaringan untuk tumbuh dan mengambil nutrisi yang mendukung kehidupan jaringan karena media menyediakan berbagai bahan yang diperlukan jaringan untuk hidup dan memperbanyak dirinya DAFTAR PUSTAKA Ahmad, R variasi somaklonal sebagai salah satu sumber keragaman genetik untuk perbaikan sifat tanaman. Jurnal Agronomi Vol. 11 No. 2 Anjar Masalah-masalah dalam Kultur Jaringan. blogspot.com. Diakses tanggal 05 November Hermawan T & Na iem Pengaruh Jenis Media dan Konsentrasi Zat Pengatur Tumbuh Terhadap Perakaran pada Kultur Jaringan Cendana (Santalum album Linn.). Jurnal Agrosains. Vol 19 (2) : Oryza Jurnal Pendidikan Biologi Volume 4 Nomor 1 April 2015

7 Hadioetomo P S Mikrobia Dasar Dalam Praktek, Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. Jakarta: Gramedia. Susila Anas Panduan Budidaya Tanaman Sayuran. Bogor : IPB. Torres K C Tissue Culture techniques for Horticultural Crops. New York: Von Hostrand Reinheld. 44 Oryza Jurnal Pendidikan Biologi Volume 4 Nomor 1 April 2015