3 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Bahan dan Alat

Transkripsi

1 15 Tabel 8 Daftar komposisi media pada kultur mangga Komponen A B C D E Unsur makro ½ MS B5 B5 B5 ½B5 Unsur mikro MS MS MS MS MS Fe-EDTA ½MS MS MS MS MS Vitamin dan asam amino MS MS MS MS MS Asam askorbat (ppm) L-glutamina (ppm) Sukrosa (g/l) Agar (g/l) ,4-D (ppm) GA3 (ppm) ABA(ppm) Air kelapa (%) Keterangan : A: media inisiasi kalus dan produksi Proembrionik (KP); B: media proliferasi/pemeliharaan KP; C: media produksi embrio somatik; D: media pematangan embrio; dan E: media perkecambahan dan konversi embrio somatik. Pengecambahan embrio somatik mangga dilakukan dengan memindahkan embrio somatik tahap kotiledonari dewasa ukuran 8 mm dengan kotiledon tebal berwarna putih kusam ke media perkecambahan (E, Tabel 8). Kultur dipelihara dalam kondisi terang 16 jam dan gelap 8 jam per hari sampai 4 minggu. Setelah 4 minggu dan embrio telah tumbuh akar tunjang, embrio dipindahkan ke media perkecambahan tanpa GA 3 untuk mendorong perkembangan akar. Planlet yang normal selanjutnya diaklimatisasi dengan ditanam ke media campuran pasir dan tanah dengan perbandingan 3:1 dalam wadah yang disungkup plastik untuk mempertahankan kelembaban. 3 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian diaksanakan mulai Mei 2010 sampai Juni Kegiatan kultur jaringan dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian IPB. Analisis histologi dilaksanakan di Laboratorium Histologi, Fakultas Kedokteran Hewan IPB, Bogor. Bahan dan Alat Bahan tanaman yang digunakan sebagai eksplan adalah bunga dan buah muda durian. Bunga durian aksesi Dramaga diperoleh dari Dramaga, bunga durian

2 16 varietas Simas didapatkan dari Cijeruk (Kebun Durian Warso Farm), bunga durian varietas Matahari diambil dari Cipaku (Kebun Percobaan Cipaku), Bogor. Buah durian muda didapatkan dari Cileungsi (Kebun Buah Mekarsari) dan Cijeruk (Kebun Durian Warso Farm). Media kultur yang digunakan adalah media MS (Murashige dan Skoog 1962), media B5, dan media MS dengan vitamin media B5. Zat pengatur tumbuh yang digunakan adalah pikloram, NAA, TDZ, dan BA. Bahan sterilan yang digunakan adalah cairan pemutih komersial (bleach), alkohol 96%, dan air steril. Alat yang digunakan meliputi Laminar Airflow Cabinet (LAFC), autoklaf, oven, botol kultur, lampu bunsen, petri dish, pinset, skalpel, rak kultur, dan peralatan lain yang umum untuk kultur jaringan. Mikroskop digunakan untuk pengamatan jaringan dan sel kalus. Metode Percobaan Penelitian dilakukan dalam 2 percobaan berkelanjutan. Percobaan pertama adalah induksi kalus embriogenik dari 4 macam eksplan dan percobaan kedua adalah induksi embriogenesis somatik dari kalus yang diperoleh pada percobaan pertama (Gambar 2). Percobaan 1 menggunakan eksplan dasar bunga, petal, endosperm dan embrio zigotik muda durian yang dilaksanakan sebagai percobaan terpisah untuk masing-masing eksplan.

3 Percobaan 1. Induksi kalus embriogenik durian dari berbagai eksplan pada berbagai komposisi media Eksplan dasar bunga RAK Faktorial 2 faktor 3 Genotipe: (Dramaga, Matahari, Simas) 14 Komposisi media : (Media MS,B5; ZPT NAA, pikloram; 0, 2, 4, 6 ppm) Eksplan petal RAK Faktorial 2 faktor 3 Genotipe: (Dramaga, Matahari, Simas) 14 Komposisi media : (Media MS,B5; ZPT NAA, pikloram; 0, 2, 4, 6 ppm) Eksplan endosperm RAK Faktorial 2 faktor BA (0 dan 1 ppm) TDZ (0.0, , dan 0.5 ppm) (Genotipe Otong, Media MS + vitamin media B5) Eksplan embrio zigotik muda RAL Faktor tunggal Pikloram (5, 10, 15, dan 20 ppm) (Genotipe Otong, Media MS) tipe 1 tipe 2 tipe 1 tipe 2 tipe 1 Embrio somatik tipe 2 Percobaan 2. Respon kalus tipe 1 durian terhadap konsentrasi BA pada media induksi embriogenesis somatik embriogenik dan embrio somatik Gambar 2 Diagram alir pelaksanaan penelitian 17

4 18 Percobaan 1. Induksi kalus embriogenik durian dari berbagai eksplan pada berbagai komposisi media Induksi kalus embriogenik dari eksplan dasar bunga durian Percobaan induksi kalus dari eksplan dasar bunga disusun dalam percobaan 2 faktor. Faktor pertama adalah komposisi media (14 taraf, Tabel 9) dan faktor kedua adalah genotipe durian (aksesi Dramaga, varietas Simas, dan varietas Matahari). Percobaan menggunakan rancangan acak kelompok (RAK) dengan 4 ulangan, tiap ulangan terdiri atas 5 botol, dan tiap botol berisi 2 eksplan berasal dari satu dasar bunga yang dibelah menjadi 2 bagian. Seluruh unit percobaan diinkubasi dalam kondisi gelap pada suhu ±22 ºC. Tabel 9 Komposisi media yang digunakan dalam percobaan induksi kalus dengan eksplan dasar bunga dan petal Keterangan Nomor Komposisi media 1 Media B5 tanpa ZPT 2 Media B5 + NAA 2 ppm 3 Media B5 + NAA 4 ppm 4 Media B5 + NAA 6 ppm 5 Media B5 + pikloram 2 ppm 6 Media B5 + pikloram 4 ppm 7 Media B5 + pikloram 6 ppm 8 Media MS tanpa ZPT 9 Media MS + NAA 2 ppm 10 Media MS + NAA 4 ppm 11 Media MS + NAA 6 ppm 12 Media MS + pikloram 2 ppm 13 Media MS + pikloram 4 ppm 14 Media MS + pikloram 6 ppm : semua media menggunakan 30 g/l gula dan 10 g/l agar. Bunga durian sebagai sumber eksplan diambil pada kondisi kuncup hampir mekar (ukuran panjang ±3 cm, diameter ±1.5 cm, Gambar 3a) karena bunga pada kondisi ini yang paling responsif terhadap induksi kalus (hasil percobaan pendahuluan, data tidak ditampilkan). Bunga dicuci dengan deterjen dan dibilas, direndam dalam larutan 30% pemutih selama 5 menit sambil terus dikocok, kemudian dimasukkan ke dalam alkohol 96% selama ½ sampai 1 menit. Bunga dilap dengan tisu steril, kemudian dibuang bagian epicalyx-nya, dipotong dan diambil 1/3 dari pangkal, dibuang bagian calyx, diambil bagian petal, dibuang semua benang sari dan diambil bagian dasar bunga (Gambar 3b sampai 3h) selanjutnya ditanam pada media. Kegiatan perendaman dalam alkohol sampai penanaman dilakukan di dalam LAFC.

5 19 ca ec a pt b pt c d db Gambar 3 e f g h Eksplan dasar bunga dan petal. a: ukuran bunga yang digunakan (tanda panah); b h: proses sterilisasi sampai eksplan siap tanam. ca: calyx; ec: epicalyx; pt: petal, db: dasar bunga Induksi kalus embriogenik dari eksplan petal durian Percobaan induksi kalus dari eksplan petal disusun dalam percobaan 2 faktor. Faktor pertama adalah komposisi media (14 taraf, Tabel 9) dan faktor kedua adalah genotipe durian (aksesi Dramaga, varietas Simas, dan varietas Matahari). Percobaan menggunakan rancangan acak kelompok (RAK) dengan 4 ulangan, tiap ulangan terdiri atas 5 botol, dan tiap botol berisi 5 eksplan berasal dari satu bunga. Seluruh unit percobaan diinkubasi dalam kondisi gelap pada suhu ±22 ºC. Bunga durian sebagai sumber eksplan diambil pada kondisi kuncup hampir mekar (ukuran panjang ±3 cm, diameter ±1.5 cm, Gambar 3a) karena bunga pada kondisi ini yang paling responsif terhadap induksi kalus (hasil percobaan pendahuluan, data tidak ditampilkan). Bunga dicuci dengan deterjen dan dibilas, direndam dalam larutan 30% pemutih selama 5 menit sambil terus dikocok, kemudian dimasukkan ke dalam alkohol 96% selama ½ sampai 1 menit. Bunga dilap dengan tisu steril, kemudian dibuang bagian epicalyx-nya, dipotong dan diambil 1/3 dari pangkal, dibuang bagian calyx, diambil bagian petal, dipotong bagian tepi yang tipis (gambar 3b sampai 3f), kemudian ditanam dalam media. Kegiatan perendaman dalam alkohol sampai penanaman dilakukan di LAFC. Induksi kalus embriogenik dari eksplan endosperm durian Percobaan disusun sebagai percobaan dua faktor yaitu konsentrasi BA dan TDZ pada media induksi (8 kombinasi perlakuan, Tabel 10). Komposisi media induksi adalah media dasar MS dengan vitamin media B5 yang dilengkapi dengan glutamina 100 ppm, asparagina 100 ppm, kasein hidrolisat 500 ppm, dan pikloram 0.5 ppm. Percobaan dilaksanakan dengan Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan jumlah ulangan 2 sampai 5 ulangan per perlakuan dan tiap ulangan terdiri atas 1 botol. Seluruh unit percobaan diinkubasi dalam kondisi gelap dengan suhu ±22ºC.

6 20 Keterangan Tabel 10 Komposisi ZPT pada media induksi untuk kultur endosperm No Konsentrasi BAP (ppm) Konsentrasi TDZ (ppm) : Komposisi media induksi adalah media dasar MS dengan vitamin media B5 yang dilengkapi dengan glutamina 100 ppm, asparagina 100 ppm, kasein hidrolisat 500 ppm, pikloram 0.5 ppm, gula 30 g/l dan agar 10 g/l. Buah muda durian varietas Otong diambil pada umur ± 2 bulan setelah antesis. Daging buah (aril) bersama biji dikeluarkan dari buah, selanjutnya aril dibuang. Biji dicuci dengan deterjen dan dibilas, direndam dalam larutan 30% pemutih selama 5 menit, kemudian ditiriskan. Tahap selanjutnya dilakukan dalam LAFC. Biji durian dimasukkan ke dalam alkohol 96% selama ½ sampai 1 menit. Selanjutnya biji dibuka untuk diambil endosperm dengan embrio didalamnya. Embrio dikeluarkan dari dalam endosperm dan ditanam langsung pada media perlakuan. Endosperm dipotong dengan ketebalan 0.3 sampai 0.5 cm kemudian ditanam pada media perlakuan. Induksi kalus embriogenik dari eksplan embrio zigotik muda durian Induksi kalus embriogenik dari eksplan embrio zigotik muda durian merupakan percobaan tunggal dengan perlakuan konsentrasi pikloram pada media dasar MS. Taraf konsentrasi yang digunakan adalah 5, 10, 15, dan 20 ppm. Percobaan dilaksanakan dengan Rancangan Acak Kelompok (RAK).dengan 2 ulangan dan tiap ulangan terdiri atas 1 botol. Seluruh unit percobaan diinkubasi dalam kondisi gelap pada suhu ±22 ºC. Buah muda durian varietas Otong diambil pada umur ± 2 bulan setelah antesis. Daging buah (aril) bersama biji dikeluarkan dari buah, selanjutnya aril dibuang. Biji dicuci dengan deterjen dan dibilas, direndam dalam larutan 30% pemutih selama 5 menit, kemudian ditiriskan. Tahap selanjutnya dilakukan dalam LAFC. Biji durian dimasukkan ke dalam alkohol 96% selama ½ sampai 1 menit. Selanjutnya biji dibuka untuk diambil endosperm dengan embrio didalamnya. Embrio dikeluarkan dari dalam endosperm dan ditanam langsung pada media perlakuan. Embrio zigotik muda yang ditanam adalah embrio utuh yang panjangnya kurang dari 1 cm. Pengamatan yang dilakukan pada percobaan induksi kalus adalah: a. Waktu mulai terbentuk kalus dihitung dari tanggal tanam dengan satuan hari. b. Persentase eksplan membentuk kalus, yaitu jumlah eksplan yang membentuk kalus per jumlah eksplan yang ditanam kali 100%.

7 c. Ukuran kalus yang terbentuk, dibuat skor 1 sampai 5 berdasar perbandingan ukuran kalus terhadap ukuran eksplan awal, diamati pada minggu ke 4. Skor 1 = < 25%, skor 2 = 25-50%, skor 3 = 50-75%, skor 4 = %, skor 5 = lebih dari 100%. d. Pengamatan kualitatif terhadap tipe kalus yang terbentuk, (Gambar 4) meliputi pengamatan visual kalus dan pengamatan sel-sel kalus dengan mikroskop terhadap tiap tipe kalus. Pengamatan sel-sel kalus dengan mikroskop dilakukan dengan preparasi langsung untuk kalus remah dan dengan preparasi metode parafin (Lampiran 1) untuk kalus kompak. Tipe 1: kompak, warna putih agak kekuningan, kadang-kadang bernodul. Jika sepotong kecil kalus disiapkan di atas kaca obyek, ditutup dengan kaca penutup dan ditekan sel-sel kalus akan hancur, tidak terlihat sel-sel yang berjajar. Tipe 2: kompak, warna putih seperti kapas. Jika sepotong kalus disiapkan di atas kaca obyek, ditutup dengan kaca penutup dan ditekan, sel-sel kalus akan hancur, tidak terlihat sel-sel yang berjajar. Tipe 3: remah berair, transparan agak kecoklatan, jika sepotong kalus disiapkan di atas kaca obyek, ditutup dengan kaca penutup dan ditekan akan terlihat sel-sel yang terpisah berjajar. Tipe 4: Muncul embrio somatik globular dan kalus agak transparan. Percobaan 2. Respon kalus tipe 1 durian terhadap konsentrasi BA pada media induksi embriogenesis somatik tipe 1 dari percobaan 1 eksplan petal varietas Simas disubkultur ke media induksi dengan perlakuan konsentrasi BA 0.0, 0.3, 0.5, 1.0, dan 2.0 ppm. Komposisi media induksi adalah media dasar MS dengan vitamin media B5 yang dilengkapi dengan glutamina 100 ppm, asparagina 100 ppm, kasein hidrolisat 500 ppm, dan pikloram 0.5 ppm. Percobaan disusun dengan rancangan acak kelompok dengan 7 ulangan, tiap ulangan terdiri atas 4 botol. Pengamatan meliputi jumlah kalus embriogenik dan jumlah embrio somatik yang terbentuk serta persentase pertambahan ukuran luas kalus yang dihitung dengan rumus: Luas kalus akhir luas kalus awal Persentase pertambahan luas kalus = x 100% Luas kalus awal Luas kalus diukur menggunakan plastik transparan milimeter block. Plastik milimeter block dipasang pada bagian bawah botol kemudian dipotret dengan kamera. Ukuran luas kalus ditentukan dengan menghitung petak milimeter yang terdapat pada gambar kalus. 21

8 22 a 5 mm b c 2 d e 5 mm f g Gambar 4 Kondisi kalus penampakan langsung dan mikroskopis. a: kalus tipe 1; b: pengamatan mikroskopis dari kalus tipe 1; c: kalus tipe 2; d: pengamatan mikroskopis dari kalus tipe 2; e: kalus tipe 3; f: pengamatan mikroskopis dari kalus tipe 3; g: kalus tipe 4, merupakan kalus embriogenik dan muncul embrio somatik