METODOLOGI PENELITIAN

Transkripsi

1 III. METODOLOGI PENELITIAN A. Tempat dan Waktu Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Teknik Pengolahan Pangan dan Hasil Pertanian (TPPHP) Departemen Teknik Mesin dan Biosistem Fakultas Teknologi Pertanian IPB dan Laboratorium PAU IPB. Waktu penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2011 sampai Mei B. Bahan dan Alat Bahan yang akan digunakan adalah biji nyamplung. Dan bahan-bahan kimia yang akan digunakan untuk menganalisis komposisi kimia sampel biji nyamplung seperti pendugaan kadar air, bilangan asam dan asam lemak bebas, dan kadar lemak dengan analisis kimiawi (metode konvensional), antara lain aquades, larutan n-heksana, alkohol 95%, indikator phenoopthalein 1%, dan larutan NaOH 0.1 N. Sedangkan alat yang akan digunakan meliputi instrumen NIRFlex Tipe N-500 Merk BUCHI yang digunakan untuk menganalisis pendugaan komposisi kimia dari biji nyamplung menggunakan NIR, komputer untuk mengolah data-data dan mengukur pendugaan komposisi kimia biji nyamplung dengan NIRFlex Solids Petri N-500 sehingga diperoleh data reflektan dan absorban baik dalam bentuk tabel maupun grafik. Software bawaan dari NIRFlex N-500 merk BUCHI yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah NIRWare Operator, NIRWare Management Console, dan NIRCal 5. Kemudian penggunaan alat oven, tanur listrik, dan desikator, dimana digunakan dalam pengukuran kadar air biji nyamplung dengan cara pengeringan (metode thermogravitimetri) dan pengukuran bilangan asam, asam lemak bebas, dan kadar lemak berdasarkan AOAC Kemudian peralatan-peralatan lain yang akan digunakan selama penelitian, antara lain timbangan digital merk ae ADAM, cawan, cawan porselin, desikator, soklet apparatus (soklet, labu lemak 250 ml, hot plate, selang, dan kertas saring), FFA apparatus (buret, pipet, pengaduk, pinset, gelas ukur 100 ml, dan Erlenmeyer 350 ml), static stand, oven, thermometer, stopwatch, kantong plastik, dan mesin press kapasitas 10 ton. C. Metode Penelitian Diagram alir pelaksanaan penelitian dapat dilihat pada Gambar 5. Metode yang digunakan dalam penelitian adalah sebagai berikut : 1. Persiapan Sampel Penelitian Sampel yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah biji nyamplung per sampel dengan berat 250 gram varietas lokal yang telah dipersiapkan dengan baik. Didapatkan dari Koperasi Jarak Lestari, Cilacap berupa buah nyamplung matang pohon dengan karakteristik buah berwarna kuning kecoklatan yang sudah dikeringkan sampai kadar air kurang lebih 10% kemudian diambil bijinya saja. Biji nyamplung per sampel dengan berat 250 gram disajikan pada Gambar 2. 15

2 Gambar 2. Sampel biji nyamplung. 2. Persiapan Instrumen NIR Sebelum dilakukan pengukuran, instrumen NIRFlex Solids Petri N-500 dinyalakan dan dibiarkan terlebih dahulu beberapa saat. Kemudian sebelum dilakukan pengukuran ke sampel biji nyamplung, terlebih dahulu dilakukan proses kalibrasi dengan software bawaan dari instrumen tersebut selama kurang lebih 2-3 menit. Software bawaan yang akan digunakan untuk proses kalibrasi adalah NIRWare Operator (Anonimous b, 2008). Mekanisme instrument NIR seperti gambar berikut: Detektor 7. Koding magnetik 12. Motor penggerak 2. Sensor magnet 8. Sampel 13. Optik 1 3. Status LED 9. Cawan petri 14. Penghalang sinar 4. Tombol mulai 10. Dudukan cawan 15. Cermin 1 5. Tombol mati 11. Piring pemutar 16. Cermin 2 6. Referensi internal 17. Optik 2 Gambar 3. Bagian-bagian NIRFlex petri solid 16

3 3. Pengukuran Reflektan Spektrum NIR Pendugaan sampel biji nyamplung dengan cara pengukuran dengan instrumen NIRFlex Solids Petri N-500 dan software bawaan yaitu NIRWare Operator, lama pengukuran setiap sampel adalah 8-9 detik. Jumlah sampel yang akan diukur sebanyak 70 sampel, dimana setiap sampel dilakukan 3 kali pengulangan dengan tiga tempat titik pengukuran yang berbeda. Pengukuran dilakukan selama 3 tahap, dengan tujuan untuk mendapatkan perbedaan karakteristik sampel, sedangkan perlakuan terhadap sampel adalah dengan menganginanginkan pada suhu ruang (25-28 o C). Selanjutnya biji nyamplung akan disinari infra merah dekat (NIR) dengan panjang gelombang nm bertujuan untuk mendapatkan informasi yang lebih banyak dari karakteristik biji nyamplung dan mengakomodir aktivitas molekul penyusun parameter mutu biji nyamplung tersebut sehingga diharapkan nilai error pendugaannya dapat lebih kecil. Prinsip pengukuran spektra adalah dengan memancarkan sinar dari lampu halogen ke sampel. Sinar tersebut diterima sebagai energy yang memicu terjadinya getaran dan regangan pada kelompok ikatan atom O-H, N-H, C-H, dan C-N dimana ikatan atom-atom tersebut merupakan komponen utama pembentuk kandungan organik. Sebagian energi yang diberikan akan diserap untuk melakukan getaran dan regangan alami dan sisanya akan dipantulkan. Pantulan itu akan ditangkap oleh lensa optik yang kemudian direkam oleh detektor sebagai data frekuensi getaran dalam bentuk analog. Informasi tersebut merupakan hasil interaksi gelombang elektronika dengan komponen penyusun bahan komposisi kimia tersebut. Gambar 4. NIR Spectroscopy Solids Petri dan Sampel Biji Nyamplung Spektrum yang terukur dari detektor akan diteruskan ke komputer untuk disimpan secara langsung. Data yang disimpan sudah dalam bentuk digital sehingga lebih mudah untuk diolah lebih lanjut dengan software bawaan NIR. Setelah dilakukan pengambilan pantulan spektrum NIR biji nyamplung, maka dilakukan analisis kimiawi biji nyamplung dengan metode konvensional. Spektrum dihitung dengan menggunakan persamaan sebagai berikut : Dimana : Spektrum = V V Contoh Standar V Contoh = Tegangan pantulan contoh / sampel (Volt) V Standar = Tegangan pantulan standar putih (Volt) (1) 17

4 Mulai Biji Nyamplung sebanyak 70 sampel Pengukuran spektrum biji nyamplung dengan NIRFlex Solids Petri Spectrometer N-500 dengan NIRWare Data Pantulan (Reflektan, R) Data Absorban (Log (1/R)) Analisis kimiawi kadar air, bilangan asam dan asam lemak bebas, dan kadar lemak biji nyamplung di laboratorium dengan metode konvensional Metode kalibrasi dan seleksi spektrum kalibrasi / validasi 1. Kalibrasi (2/3 total sampel) 2. Validasi (1/3 total sampel) Data perlakuan (treatment) untuk spektrum reflektan dan absorban NIR Perancangan model kalibrasi dengan metode multivariatif, yaitu : 1. Principal Component Regression (PCR) 2. Partial Least Squares (PLS) Data analisis kimiawi biji nyamplung dalam software yaitu NIRWare Management Console Proses kalibrasi dan seleksi kalibrasi/validasi menggunakan software yaitu NIRCal 5 Pemberian perlakuan menggunakan software yaitu NIRCal 5 Toolbox Penentuan regresi kalibrasi R 2, Koefisien keragaman (CV), dan Standar error kalibrasi (SEC) Penentuan validasi Koefisien keragaman (CV) dan Standar error validasi (SEP) Selesai Gambar 5. Diagram alir pelaksanaan penelitian pendugaan komposisi kimia biji nyamplung dengan metode NIR. 18

5 4. Pengukuran Absorban Spektrum NIR Data absorban diperoleh dengan cara mentransformasikan nilai reflektan kedalam bentuk log (1/R). Nilai absorban dari NIRFlex Solids Petri N-500 diperoleh dari hasil penyerapan (absorban) oleh objek dengan persamaan : S A λ = -log 10 ( R D ) (2) D Dimana : A λ = Nilai absorban S = Intensitas panjang gelombang pada sampel D = Intensitas panjang gelombang pada dark R = Intensitas panjang gelombang pada reference 5. Penentuan Komposisi Kimia Biji Nyamplung secara Destruktif a. Penentuan kadar air (SNI ) Penentuan kadar air dalam bahan pangan dan pertanian dapat dilakukan dengan berbagai metode, antara lain metode pengeringan (thermogravitimetri), metode destilasi (thermovolumetri), metode Khemis, dan lain-lain. Pada metode penelitian ini, kadar air biji nyamplung akan ditentukan dengan metode thermogravitimetri berdasarkan SNI Cawan aluminium kosong dan tutupnya dikeringkan dalam oven pada suhu 130 o C selama 15 menit dan didinginkan dalam desikator selama 30 menit. Cawan ditimbang menggunakan neraca analitik (A). Sampel sebanyak 2 gram (W) yang sudah dihomogenkan dimasukkan dengan neraca analitik, tutup cawan diangkat, dan cawan beserta isi dan tutupnya ditempatkan di dalam oven pada suhu 130 o C selama 1 jam. Kemudian cawan berisi sampel didinginkan dalam desikator, kemudian ditimbang (Y). Setelah itu, cawan berisi sampel dikeringkan kembali dalam oven selama menit, lalu ditimbang kembali. Pengeringan diulangi hingga diperoleh bobot konstan (selisih bobot gram). Penentuan kadar air dilakukan sebanyak 2 kali, hasil penentuan tersebut kemudian dirata-ratakan. Kadar air diukur dengan cara sebagai berikut : Dimana : W ( X A) W Kadar Air (%) = x100 % W = Bobot sampel awal (g) X = Bobot sampel dan cawan setelah dikeringkan (g) A = Bobot cawan kosong (g) (3) b. Penentuan bilangan asam dan asam lemak bebas (AOAC 1995) Bilangan asam adalah jumlah NaOH (mg) yang dibutuhkan untuk menetralkan asam lemak dalam satu gram contoh. Prosedur pengukuran adalah minyak yang akan diuji ditimbang 2-5 gram dalam Erlenmeyer 350 ml, ditambahkan 50 ml alkohol netral 95%, kemudian dipanaskan selama 10 menit dalam pemanas air sambil diaduk. Setelah ditambahkan indikator phenoolphthalein 1%, larutan dititrasi dengan larutan NaOH 0.1 N sampai tepat berwarna merah jambu yang tidak hilang dalam beberapa detik. Selanjutnya jumlah NaOH (mg) yang digunakan untuk menetralisir asam lemak bebas dalam 1 gram minyak atau lemak ditentukan dengan cara sebagai berikut : 19

6 Bilangan Asam ( mgnaoh ) = g AxNx56. 1 G (4) Kadar asam lemak bebas (%) = AxMx G (5) Dimana : A = Jumlah NaOH untuk titrasi (ml) N = Normalitas larutan NaOH M = Bobot molekul asam lemak (asam oleat = 282 g/mol) G = Bobot sampel (g) 56.1 = Bobot molekul NaOH c. Penentuan kadar lemak (AOAC 1995) Analisa kadar lemak dilakukan dengan metode ekstraksi Soxhlet. Labu lemak yang ukurannya sesuai dengan alat ekstraksi Soxhlet dikeringkan dalam oven, didinginkan dalam desikator dan kemudian ditimbang. Sebanyak 5 gram sampel yang telah dihilangkan kadar airnya ditimbang dan dibungkus dalam saringan timbal. Timbal berisi sampel dimasukan ke dalam alat ekstraksi Soxhlet, kemudian alat kondensor dipasang diatasnya dan labu lemak dipasang dibawahnya. Pelarut lemak (heksan) dituang ke dalam labu lemak secukupnya. Proses dilakukan selama minimal 5 jam sampai pelarut yang turun kembali ke dalam labu lemak berwarna jernih. Pelarut yang tertampung dalam lemak kemudian di destilasi dan ditampung. Labu lemak yang berisi lemak hasil ekstraksi dipanaskan dalam oven 105 o C. Timbal berisi sampel dikeringkan dalam oven, didinginkan dalam desikator, dan ditimbang hingga mencapai berat konstan. Perhitungan yang dilakukan untuk mendapatkan kadar lemak bahan adalah sebagai berikut : beratlemak ( g) beratsampe l( g) Kadar lemak (%) = x100 % (6) 6. Analisis Data Penelitian Data-data yang diperoleh akan dianalisis dengan menggunakan bantuan perangkat lunak (software) komputer, seperti Microsoft Excel 2007 dan software bawaan dari alat NIRFlex N-500 merk BUCHI yaitu NIRWare Management Console dan NIRCal 5. Diagram alir tahap kalibrasi dari NIRFlex Solids Petri N-500 dengan software NIRCal 5. Microsoft Excel 2007 digunakan untuk pembuatan kurva reflektan (R) dan absorban (log (1/R)) NIR. Penggunaan NIRWare Management Console untuk memasukan data hasil analisis kimiawi laboratorium (data referensi). Sedangkan NIRCal 5 digunakan untuk membuat bentuk dan model kalibrasi antara data reflektan dan absorban NIR terhadap hasil analisis kimiawi laboratorium dengan metode kalibrasi multivariatif yaitu principal componen regression (PCR) dan partial least squares (PLS). Keluaran hasil analisis data penelitian dari metode kalibrasi multivariatif tersebut dengan menggunakan software NIRCal 5 adalah data dugaan, grafik, dan regresi kalibrasi antara data reflektan atau absorban NIR dengan nilai hasil analisis kimiawi laboratorium yang 20

7 memiliki koefisien korelasi (R) dan koefisien determinasi (R 2 ) yang tinggi serta standar deviasi dan bias yang rendah (Anonimous b, 2008). Analisis data penelitian meliputi data reflektan (R) maupun absorban (log (1/R)). Dari sejumlah sampel (70 sampel biji nyamplung) yang diukur akan dibagi 2 tahap, yaitu tahap kalibrasi dan validasi. Jumlah sampel untuk tahap kalibrasi harus lebih banyak dari tahap validasi, dimana jumlah sampel pada tahap kalibrasi sebanyak ± 45 sampel (2/3 total sampel) sedangkan jumlah sampel untuk validasi sebanyak ± 25 sampel (1/3 total sampel). Selain itu, range data yang digunakan untuk tahap kalibrasi harus lebih besar daripada tahap validasi. a. Kalibrasi 1). Metode partial least squares (PLS) Tahap kalibrasi ini dilakukan untuk menentukan hubungan antara komposisi kimia biji nyamplung dengan data reflektan maupun absorban NIR. Untuk pendugaan komposisi kimia biji nyamplung dapat dilakukan dengan metode kalibrasi multivariatif yaitu metode partial least squares (PLS). Metode kalibrasi ini memiliki struktur sistematik linear dan non-linear (Herve, 2003 dalam Saragih, 2007). Metode PLS digunakan untuk memperoleh pendugaan bagi Y sebagai fungsi peubah-peubah X n yang terpilih. Regresi kalibrasi antara peubah Y dengan a dan b sebagai konstanta kuadrat terkecil parsial X terpilih (Naes, 1985 dalam Rumahorbo, 2004), dinyatakan sebagai berikut : Y = a + b 1 X 1 + b 2 X b n X n (7) Dimana : Y = Kadar air/bilangan asam dan asam lemak bebas/kadar lemak biji nyamplung a dan b = Konstanta kuadrat terkecil parsial X = Fungsi peubah kuadrat terkecil parsial pada kisaran panjang gelombang antara nm 2). Metode principal component regression (PCR) Principal component regression (PCR) merupakan metode kalibrasi multivariatif untuk menganalisis statistika peubah ganda yang dapat digunakan untuk keperluan mereduksi sejumlah peubah asal menjadi beberapa peubah baru yang bersifat orthogonal dan tidak mengurangi serta tetap mempertahankan total keragaman yang jumlahnya besar dari peubah asalnya (Mattjik et al., 2006). Hasil analisis berupa akar ciri, vektor ciri, proporsi, dan proporsi kumulatif total keragaman yang diterangkan oleh masing-masing komponen serta skor komponen. Regresi kalibrasi dapat dibangun dengan menggunakan metode principal component regression (Mattjik et al., 2006), dinyatakan sebagai berikut : Y = a + b 1 P 1 + b 2 P b n P n (8) Dimana : Y = Kadar air/ bilangan asam dan asam lemak bebas/kadar lemak biji nyamplung a dan b = Konstanta komponen utama P = Komponen utama pada kisaran panjang gelombang antara nm (5, 10, 15 komponen utama) 21

8 b. Validasi Setelah didapatkan model regresi kalibrasi, dilakukan tahap validasi dengan menggunakan sisa data yang lain. Data sampel yang berbeda tersebut dimasukkan ke dalam regresi kalibrasi, sehingga diperoleh data komposisi kimia (kadar air, bilangan asam dan asam lemak bebas, dan kadar lemak) biji nyamplung dugaan NIR. Validasi bertujuan menguji ketepatan pendugaan komposisi kimia dengan regresi kalibrasi yang telah dibangun. Parameter untuk menentukan kecocokan model kalibrasi adalah koefisien determinasi (R 2 ), standard error (SE), coefficient of variation (CV). Koefisien determinasi atau R 2 menunjukkan kemampuan model menerangkan keragaman nilai peubah tak bebas. Semakin besar nilai R 2 berarti model semakin mampu menerangkan perilaku peubah tak bebas. Kisaran nilai R 2 mulai dari 0% sampai 100% (Mattjik et al., 2006). R = ( Y )( Y ( Y ) 2 NIR ( Y NIR NIR ) NIR ) (9) R 2 = (R) 2 (10) Data komposisi kimia dugaan NIR akan di validasi dengan data hasil pengujian secara kimiawi di laboratorium kimia dan dibuat hubungan antara keduanya, setelah itu akan dihitung standard error. Standar error merupakan selisih antara nilai hasil dugaan dan nilai sebenarnya. SE yang semakin kecil menunjukkan model yang semakin baik. Nilai kecil yang baik adalah nilai yang semakin mendekati nol sehingga dipastikan model dapat memprediksi dengan baik kadar dugaan. Standar error diperoleh dengan menggunakan persamaan sebagai berikut : SE = ( YNIR n Y) Dimana : SE = Standar error Y NIR = Komposisi kimia dugaan NIR Y = Komposisi kimia dengan uji kimia n = Jumlah sampel Setelah dihitung standar error (SE), dihitung pula koefisien keragaman (Coefficient of Variability/CV). Walpole (1995) menyatakan bahwa dengan simpangan baku (standar deviasi) saja tidak dapat mengatakan banyak mengenai keragaman satu kumpulan data. Ukuran lain yang mungkin lebih layak adalah koefisien keragaman (CV) Coefficient of Variability menunjukkan besarnya error sebanding dengan rata-rata hasil analisis kimiawi laboratorium (data referensi). Koefisien keragaman (CV) dapat digunakan untuk membandingkan dua keragaman kelompok data yang selang nilainya jauh berbeda satu sama lain bahkan dapat digunakan untuk membandingkan keragaman dua atau lebih kelompok data meskipun satuan pengukurannya tidak sama. Fontaine et al. (2002) mendefinisikan CV sebagai relatif standar deviasi (RSD) untuk membandingkan keragaman crude protein dengan asam amino hasil kalibrasi NIRS. SE dan CV terkecil menunjukkan hasil yang paling baik. Coefficient of variability dirumuskan dengan : 2 (11) SE Y CV = x100% (12) 22

9 Dimana : CV SE Y = Koefisien keragaman = Standar error = Rataan komposisi kimia aktual sampel Standar deviasi adalah hasil perkalian dari standar error validasi dengan relatif standar deviasi, rumus untuk mencari nilai standar deviasi (SD) adalah : SD = ( YNIR n Y) 2 (13) c. Data treatment Data mentah yang didapatkan dari hasil pengukuran reflektan dan absorban NIR perlu diolah lebih lanjut, karena kemungkinan besar saat proses pengambilan data banyak faktor eksternal yang mempengaruhi, seperti guncangan (noise), serta galat (kekeliruan) yang terjadi selama proses pengukuran infra merah dekat (NIR) dan analisis kimiawi laboratorium (metode konvensional) yang mempengaruhi data tersebut. Sehingga diperlukan pengolahan data mentah terlebih dahulu, sebelum ditentukannya regresi kalibrasi yang baik. Perlakuan data yang akan diberikan pada kurva spektrum reflektan dan absorban adalah penghalusan rataan setiap 3 titik (smooth average 3 points), derivatif kedua Savitzky- Golay setiap 9 titik (second derivative Savitzky-Golay 9 points), kombinasi kedua perlakuan data tersebut, dan normalisasi (0-1). Setiap perlakuan data mempunyai fungsi yang berbedabeda terhadap data spektrum. Smoothing berfungsi untuk memilih penghalusan fungsi dengan teliti tanpa menghilangkan informasi spektrum yang ada dan mengurangi guncangan (noise) dan memperkecil galat (kekeliruan) yang terjadi selama pengukuran NIR dan analisis kimiawi laboratorium. Derivatif kedua Savitzky-Golay berfungsi untuk mereduksi efek basis dari adanya pertambahan proses absorban (shoulder effect) serta menghilangkan masalah basis kemiringan persamaan regresi (Tiaprasit dan Sangpithukwong, 2010). Kombinasi antara smoothing dan derivatif kedua Savitzky-Golay dapat diterapkan dan akan mendapatkan bentuk dan model regresi kalibrasi yang optimum, layak, dan dapat dipercaya (Blanco dan Villarroya, 2002 dalam Yogaswara, 2005). Perlakuan-perlakuan data tersebut akan menggunakan bantuan software NIRCal 5 Toolbox. Normalisasi data spektra kedalam rentang 0-1 dimaksudkan untuk menghilangkan pengaruh perbedaan ukuran partikel sampel uji dan memperbesar rentang nilai reflektan. Perlakuan normalisasi diharapkan dapat mengurangi error yang terjadi selama pengambilan data spektra dan dapat memperjelas data spektra tersebut. Perlakuan normalisasi akan memperlebar nilai spektra serta memproporsionalkan nilai spektra dari dua nilai spektra dengan kandungan yang sama. 23