METODE Waktu dan Tempat Alat dan Bahan

Transkripsi

1 METODE Penelitian ini dilakukan dalam dua tahap yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian lanjutan. Penelitian pendahuluan mencakup pengembangan minuman emulsi minyak bekatul tanpa cokelat dan analisis asam lemak minuman yang diintervensi. Penelitian lanjutan dilakukan untuk melihat pengaruh intervensi minuman ready to drink emulsi minyak bekatul-cokelat terhadap kadar profil lipid plasma orang dewasa obes. Penelitian telah mendapatkan Ethical Approval No.KE.01.12/EC/597/2011 dari Komisi Etik Penelitian Kesehatan Badan Litbang Kesehatan Kementerian Kesehatan Republik Indonesia pada tanggal 23 Desember 2012 (surat pada Lampiran 1). Waktu dan Tempat Proses pengembangan minuman emulsi minyak bekatul tanpa cokelat pada penelitian pendahuluan dilakukan di Laboratorium Percobaan Makanan Departemen Gizi Masyarakat, serta analisis asam lemak minuman yang diintervensikan dilakukan di Laboratorium Terpadu. Analisis kadar profil lipid darah subyek pada penelitian lanjutan dilakukan di Laboratorium Biokima Departemen Gizi Masyarakat, serta pengumpulan data primer dilakukan di lingkungan Departemen Gizi Masyarakat Fakultas Ekologi Manusia Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilakukan dari bulan Juli 2011 sampai Januari Alat dan Bahan Bahan yang digunakan untuk melakukan pengembangan minuman emulsi minyak bekatul tanpa cokelat antara lain minyak bekatul komersial merek Oryza Grace, sukralosa, garam, emulsifier sugar ester dan Tween 80, Carboxymethil Celulose (CMC) dan air. Produksi minuman ready to drink emulsi minyak bekatul-cokelat menggunakan minyak bekatul komersial merek Oryza Grace, cokelat bubuk asli dari Balai Penelitian Kopi dan Kakao Jember Jawa Timur, sukralosa, garam, emulsifier sugar ester, CMC dan air. Peralatan yang digunakan kedua produk minuman sama yaitu timbangan mikro, homogenizer, kompor, sealer, gelas plastik tahan panas, termometer dan kulkas. Bahan dan alat yang digunakan untuk analisis asam lemak minuman yang diintervensikan antara lain minyak dari minuman, larutan standar, larutan NaOH 0.5 N dan BF 3 12% dalam methanol, larutan NaCl jenuh, isooktana, Na 2 SO 4 anhidrat, perangkat gas kromatografi (gambar pada Lampiran 2), syringe 10 µl, penangas air, tabung bertutup Teflon, neraca analitik dan pipet mikro.

2 26 Pengukuran status gizi dilakukan menggunakan timbangan berat badan dan microtoise. Peralatan yang dibutuhkan untuk pengambilan sampel darah adalah jarum suntik, tabung EDTA, alkohol dan plester. Proses pengambilan darah dilakukan oleh tenaga ahli dari Pusat Penelitian dan Pengembangan Gizi Bogor. Alat dan bahan yang diperlukan untuk analisis kadar profil lipid plasma adalah sampel plasma, reagen merek Human berupa complete test kit kolesterol total ETI , HDL ETI dan trigliserida ETI beserta standar, freezer, eppendorf, air bebas ion, sentrifuge, penangas air, pipet mikro dan spektrofotometer. Jumlah dan Cara Pemilihan Subyek Populasi target adalah mahasiswa dan mahasiswi Institut Pertanian Bogor. Subyek diambil dengan cara screening untuk memenuhi persyaratan inklusi. Teknik pemilihan subyek diambil dengan metode purposive sampling. Syarat inklusi yang perlu dipenuhi oleh subjek adalah: 1. Berjenis kelamin laki-laki /perempuan. 2. Berkategori obes tingkat 1 dan 2 (memiliki IMT 25) (WHO 2000). 3. Rentang umur tahun. 4. Tidak sedang menjalani pengobatan dari dokter. 5. Tidak sedang mendapatkan intervensi (minuman antioksidan) serupa. 6. Tidak merokok. 7. Tidak hamil atau menyusui. 8. Tidak alergi cokelat. 9. Tidak pindah atau berada di luar lokasi dalam jangka waktu lama, sehingga tidak dapat mengikuti perlakuan. 10. Bersedia mengisi informed concent. Penentuan jumlah subjek dilakukan dengan menggunakan minimum sample size for estimating difference mean between groups (Lameshow et al. 1997), yaitu dengan rumus sebagai berikut: Keterangan: n = jumlah subjek minimal Zα = 1.96 (α= 5%) Zβ = 1.28 (β= 10%), power of test = 90% S 2 = standar deviasi (0.14) X 1 = mean kadar kolesterol LDL setelah intervensi (berdasarkan penelitian Most et al. 2005, yaitu 3.30). X 2 = mean kadar kolesterol LDL sebelum intervensi (berdasarkan penelitian Most et al. 2005, yaitu 3.65).

3 27 Berdasarkan dari hasil perhitungan diatas, maka diperoleh jumlah n yaitu 3.35 yang dibulatkan menjadi subjek minimal yaitu 4 orang. Antisipasi drop-out dilakukan dengan menambahkan 8 orang subjek dari jumlah minimal sehingga total subjek yang digunakan yaitu 12 orang, dengan enam orang laki-laki dan enam orang perempuan. Hal ini dilakukan karena minuman yang diintervensikan belum dikenal dan belum diterima dengan baik. Alur Penelitian Alur penelitian menceritakan urutan penelitian ini dilakukan. Penelitian dilakukan melalui dua tahap. Tahap pendahuluan yaitu pengembangan minuman emulsi minyak bekatul tanpa cokelat dan analisis asam lemak minuman yang diintervensikan, yaitu minuman ready to drink emulsi minyak bekatulcokelat. Tahap lanjutan terdiri dari mengurus perijinan Ethical Clearance dari Kementrian Kesehatan RI, penentuan subyek secara purposive, pengambilan data primer subyek, melaksanakan masa pre-intervensi dan masa intervensi, pengambilan dan analisis profil lipid plasma subyek. Alur penelitian disajikan pada Gambar 5. Pengembangan minuman emulsi minyak bekatul tanpa cokelat Komposisi dan perbandingan pengembangan minuman emulsi minyak bekatul tanpa cokelat didasarkan pada penelitian Rachman (2012), yaitu minuman emulsi minyak bekatul-cokelat. Pengembangan dilakukan dengan menguji perbandingan (minyak:air) 1:9 dan 3:7 menggunakan emulsifier sugar ester, serta menguji perbandingan 3:7 dan 4:6 menggunakan emulsifier Tween 80. Perbandingan yang terpilih untuk diuji berdasarkan trial and error yang telah dilakukan oleh Rachman (2012) sebelumnya. Perbandingan yang diuji hanya sampai perbandingan 4:6 karena daya terima dirasa sangat rendah pada perbandingan minyak:air yang lebih tinggi. Total minuman yang dibuat per sajiannya sekitar 100 ml. Adanya penambahan perisa karamel untuk meningkatkan daya terima, namun jumlah perisa belum ditentukan. Pada setiap 100 ml ditambahkan sekitar 3 tetes perisa karamel. Pada Tabel 10 digambarkan jenis bahan dan komposisi yang digunakan pada pengembangan minuman emulsi minyak bekatul tanpa cokelat. Cara pembuatan minuman emulsi yaitu pertama menimbang secara teliti minyak bekatul Oryza Grace (Lampiran 3), sukralosa, emulsifier (sugar ester atau Tween 80), garam, dan CMC. Mempersiapkan minyak bekatul dan air sesuai dengan takaran. Proporsi minyak dalam satu gelas minuman sangat kecil

4 28 Pengembangan minuman emulsi minyak bekatul tanpa cokelat Analisis asam lemak minuman ready to drink emulsi minyak bekatul-cokelat Permohonan Ethical Clearance hingga mendapat Ethical Approval No.KE.01.12/EC/597/2011 dari Kemenkes Pemilihan subyek secara purposive Subyek menandatangani informed consent Pertemuan I: Subyek diminta menjalani diet rendah antioksidan dan pengumpulan data karakteristik subyek, food recall 2x24 jam dan food frequency Masa rendah antioksidan: 2 minggu Pertemuan II: Penyuluhan subyek untuk motivasi menjalani intervensi Setelah subyek dipuasakan 12 jam, dilakukan pengambilan darah pre-intervensi Produksi minuman ready to drink emulsi minyak bekatulcokelat tiga hari sekali Pemberian intervensi minuman ready to drink emulsi minyak bekatul-cokelat sebanyak 2x sehari selama 15 hari dan pengisian food record selama 7 hari Masa intervensi: 15 hari Setelah subyek dipuasakan 12 jam, dilakukan pengambilan darah post-intervensi Dilakukan analisis kadar profil lipid plasma subyek sebelum dan setelah intervensi Gambar 5 Skema alur penelitian (6.29%), sedangkan proporsi air dalam minuman sebesar 92.27% sehingga massa jenis minuman dianggap 1 mg/dl karena sebagian besar minuman terdiri dari air. Seluruh bahan yang telah ditimbang kemudian dicampurkan di dalam satu gelas dan ditambahkan perisa karamel 3 tetes. Emulsifier sugar ester dipilih menjadi pengemulsi yang cocok untuk minuman ini. Jumlah emulsifier kemudian diuji dengan ditingkatkan menjadi 2 g dan 2.5 g untuk meningkatkan kualitas emulsi. Justifikasi rasa minuman emulsi

5 29 Tabel 10 Bahan dan komposisi pengembangan minuman emulsi minyak bekatul tanpa cokelat Bahan (g) Perbandingan (Minyak : Air) dalam gram 1 9 % 2 8 % 3 7 % 4 6 % Air Coklat Minyak Bekatul Sukralosa Tween 80 *) Sugar ester *) Garam CMC Keterangan : *) pemakaian emulsifier Tween 80 dan sugar ester tidak bersama-sama. Apabila sudah dipakai Tween 80 maka tidak ditambahkan sugar ester dalam minuman yang sama, dan sebaliknya. minyak bekatul tanpa cokelat ternyata kurang dapat diterima serta kestabilan emulsi minuman yang dihasilkan kurang baik. Maka kemudian minuman yang diintervensikan adalah minuman emulsi minyak bekatul-cokelat berdasarkan penelitian Rachman (2012) yang telah teruji secara organoleptik. Pembuatan minuman emulsi minyak bekatul-cokelat yang diintervensikan kepada subyek dilakukan berdasarkan penelitian Rachman (2012), yang dijelaskan pada Tabel 11. Minuman kemudian dikemas sebagai minuman siap saji (ready to drink) yang memiliki daya simpan cukup baik selama minimal delapan hari di dalam kulkas. Tabel 11 Komposisi biang dan pengenceran minuman minyak bekatul-cokelat Bahan Komposisi (g) Biang Pengenceran 1:3 Air Coklat Minyak Bekatul Emulsifier Sukralosa Garam CMC Sumber: Rachman (2012) Seluruh bahan ditimbang sesuai takaran biang dan dicampurkan untuk dihomogenisasi dengan homogenizer rpm selama 10 menit. Emulsi diencerkan dengan perbandingan biang:air sebesar 1:3. Minuman yang telah diencerkan kemudian dihomogenisasi kembali dan bersama-sama dipasteurisasi

6 30 selama 10 menit pada suhu 80 0 C. Pasteurisasi dilakukan dengan cara mengukus minuman emulsi yang berada dalam wadah panci. Setelahnya minuman segera dimasukkan ke dalam gelas plastik tahan panas, yang sebelumnya telah direndam selama 1-2 menit dalam suhu 90 0 C, dan segera disegel dengan tutup plastik. Perlakuan ini disebut hot filling yang bertujuan menciptakan ruang vakum. Kemasan yang telah berisi minuman kemudian pasteurisasi kembali pada suhu 90 0 C selama 1-2 menit. Penyimpanan dilakukan dalam kulkas (suhu C) sehingga minuman dapat terjaga isinya selama masa penyimpanan. Produksi minuman emulsi minyak bekatul-cokelat dilaksanakan seminggu tiga kali. Produksi ditujukan agar dapat menghasilkan gelas minuman pada hari biasa dan gelas minuman pada akhir minggu, dengan jumlah 12 subyek yang diberikan 2 gelas per hari, yaitu pagi dan siang. Analisis asam lemak minuman ready to drink emulsi minyak bekatulcokelat Analisis asam lemak yang terkandung di dalam minuman ready to drink emulsi minyak bekatul-cokelat dilakukan dengan metode gas chromatograph (GC). Analisis ini didasarkan pada partisi komponen-komponen dari suatu cairan diantara fase gerak berupa gas dan fase diam berupa zat padat atau cairan yang tidak mudah menguap yang melekat pada bahan pendukung inert. Analisis asam lemak diperlukan dua tahap, yaitu preparasi sampel dan kedua analisis komponen asam lemak sebagai FAME (fatty acid methyl ester). Prosedur analisis asam lemak minuman dijelaskan pada Subbab Jenis dan Cara Pengumpulan Data. Intervensi minuman ready to drink emulsi minyak bekatul-cokelat Setelah calon subyek terpilih memenuhi syarat inklusi dan bersedia menandatangani informed consent, maka calon subyek ditetapkan sebagai subyek penelitian. Subyek dikumpulkan pertama kali untuk diberi penjelasan dan penyuluhan mengenai manfaat minyak bekatul terhadap kesehatan sehingga diharapkan subyek menjadi termotivasi untuk mengonsumsi minuman ready to drink emulsi minyak bekatul-cokelat selama masa intervensi (gambar pada Lampiran 4). Pada pertemuan pertama ini subyek dimohon untuk mengisi kuesioner identitas subyek, food frequency, pengukuran berat badan dan tinggi badan subyek. Selain itu subyek juga diminta untuk melakukan diet rendah antioksidan dengan mengurangi konsumsi antioksidan dan tidak diperbolehkan

7 31 mengonsumsi suplemen atau multivitamin selama dua minggu ke depan. Hal ini bertujuan untuk mencegah adanya pengaruh asupan antioksidan terhadap profil lipid plasma subyek. Masa ini disebut masa rendah antioksidan. Pada masa sebelum intervensi, subyek dikumpulkan data food recallnya selama 2x24 jam oleh peneliti. Setelah masa rendah antioksidan selama dua minggu, subyek kembali dikumpulkan pada Pertemuan Kedua untuk dicek kesehatannya oleh dokter di Departemen Gizi Masyarakat. Subyek juga diberi penjelasan tentang masa intervensi yang dijalankan kemudian. Selanjutnya, subyek diminta untuk melakukan puasa selama 12 jam sebelum pengambilan darah pre-intervensi. Pengambilan darah dilakukan di Laboratorium Biokimia Departemen Gizi Masyarakat IPB pada pukul hingga oleh tenaga ahli. Selama 15 hari berikutnya, subyek diberikan minuman ready to drink emulsi minyak bekatulcokelat sebanyak 2 gelas per hari, pada pagi dan sore hari. Selain itu juga subyek diminta kesediaannya untuk mengisi kuesioner food record selama 7 hari pada masa intervensi. Setelah masa intervensi berakhir, subyek kembali dipuasakan selama 12 jam untuk setelahnya diambil darah untuk post-intervensi. Pengambilan darah dan analisis profil lipid Pengambilan darah dilakukan sebelum dan setelah masa intervensi. Pengambilan darah pre-intervensi dilaksanakan pada tanggal 24 November 2011 pukul Pengambilan darah dilakukan oleh tenaga ahli dari Badan Penelitian dan Pengembangan Gizi Dinas Kesehatan Bogor (gambar pada Lampiran 5). Sebelum pengambilan darah, subyek diminta untuk puasa 12 jam atau semalam sebelum diambil darahnya pada keesokan harinya. Selama masa puasa tersebut, subyek tidak boleh mengonsumsi apapun kecuali air putih. Pertama lipatan siku lengan kanan atau kiri subyek yang akan disuntikkan jarum dibersihkan menggunakan kapas dan alkohol. Tenaga ahli kemudian mencari titik vena cubiti subyek dan mengambil darah dengan jarum suntik sebanyak 5 ml setelahnya. Bekas suntikan lalu ditutup dengan plester atau kapas. Pengambilan darah setelah masa intervensi dilaksanakan pada 20 Desember 2011 pukul oleh tenaga ahli. Seperti sebelumnya, subyek dipuasakan dulu 12 sebelum pengambilan darah dilakukan. Setelah diambil darah, subyek kemudian diberikan sarapan pagi berupa roti dan susu. Darah yang telah diambil dipindahkan ke tabung EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid) dan dikocok agar homogen dengan larutan EDTA. Sekali

8 32 pengambilan darah menghasilkan sekitar dua tabung EDTA. Segera setelahnya tabung EDTA disentrifuge pada rpm selama 10 menit untuk menghasilkan plasma darah. Plasma yang dihasilkan dimasukkan ke dalam eppendorf yang dilapisi alumunium dan disimpan dalam freezer (suhu 0 0 C) untuk mencegah terjadi kontaminasi yang dapat mengubah konten plasma hingga dianalisis profil lipid. Analisis profil lipid yang dilakukan meliputi analisis kolesterol total, kolesterol LDL dan HDL serta trigliserida. Sampel yang digunakan adalah plasma yang telah disentrifugasi. Prosedur analisis profil lipid plasma dijelaskan pada Subbab Jenis dan Cara Pengumpulan Data. Desain Penelitian Penelitian ini merupakan jenis penelitian pra-eksperimen kepada subyek penelitian yang telah ditentukan secara purposive sebelumnya. Desain penelitian yang digunakan adalah desain one group pretest dan posttest melalui pengukuran kadar profil lipid plasma subyek pada sebelum dan setelah intervensi. Alur penelitian lanjutan dijelaskan pada Gambar 6. Angka 0 menunjukkan awal dari masa intervensi, sehingga mulai dari angka 0 sampai angka 2 menunjukkan masa intervensi. Angka -2 menunjukkan awal masa rendah antioksidan, yang berlanjut selama 2 minggu hingga angka 0. Masa rendah antioksidan Masa intervensi Gambar 6 Alur penelitian lanjutan Masa rendah antioksidan dilakukan selama dua minggu, kemudian masa intervensi dilakukan selama dua minggu lebih sehari (15 hari). Pada masa rendah antioksidan, dilakukan pengambilan data identitas dan karakteristik subyek, pengukuran antropometri subyek, recall 2x24 jam dan kuesioner food frequency. Masa intervensi merupakan masa pemberian minuman ready to drink minyak bekatul-cokelat pada subyek, dengan banyak pemberian dua gelas sehari yang setara 57.6 mg -oryzanol. Hal ini sesuai dengan penelitian Damayanthi (2002), bahwa jumlah -oryzanol sebanyak mg sehari cukup untuk menurunkan LDL-teroksidasi. Pada masa intervensi, data yang dikumpulkan adalah pengambilan darah pre dan post-intervensi, analisis kadar profil lipid plasma dan kuesioner food record selama 7 hari.

9 33 Jenis dan Cara Pengumpulan Data Data dalam penelitian ini adalah data primer yang diperoleh melalui penelitian langsung dan wawancara melalui kuesioner. Tabel 12 memuat jenis, frekuensi, waktu dan metode pengumpulan data yang dilakukan. Jenis Data Tabel 12 Jenis, frekuensi, metode pengumpulan dan pengukuran data Jenis dan kadar asam lemak minuman Identitas dan karakteristik subyek Frekuensi Pengumpulan Waktu Pengumpulan Metode Pengumpulan 1 kali Sebelum intervensi Gas kromatografi 1 kali Sebelum intervensi Kuesioner Antropometri subyek 1 kali Sebelum intervensi Timbangan berat badan dan microtoise Kebiasaan makan subyek 10 kali Sebelum intervensi dan pada masa intervensi Kuesioner food frequency,food recall dan food record Kadar kolesterol total, HDL dan trigliserida plasma 2 kali Sebelum intervensi dan setelah intervensi Metode CHOD-PAP, Direct dan GPO-PAP 1. Jenis dan kadar asam lemak minuman Analisis jenis dan kadar asam lemak pada minuman yang diintervensikan dilakukan dengan metode gas kromatografi (GC), melalui dua tahap, yaitu preparasi sampel dan kedua analisis komponen asam lemak sebagai FAME (fatty acid methyl ester). Preparasi sampel dilakukan dengan hidrolisis dan esterifikasi. Sebanyak mg sampel minyak dan 1 ml NaOH dalam metanol dipanaskan (dihidrolisis) dalam penangas selama 20 menit. Setelah ditambahkan 2 ml BF3 20% dipanaskan lagi 2 menit, ditambahkan heptana 2-5 ml dan dididihkan 1 menit. Ditambahkan 15 ml NaCl dan dikocok 15 detik. Larutan NaCl jenuh ditambahkan untuk menguapkan larutan isooktan, yang kemudian dipindah 1 ml ke dalam tabung dengan ditambahkan NaSO4 anhidrat. Setelah didiamkan 15 menit, larutan diencerkan hingga 5-10% GC. Gambar 5 adalah contoh FAME yang siap diinjeksikan. Gambar 7 FAME yang siap diinjeksikan

10 34 Pengaturan kolom, laju alir gas, suhu, volume dan kecepatan linier alat GC perlu dikondisikan sebelum analisis dilakukan. Setelah itu pelarut diijenksikan sebanyak 1 µl ke dalam kolom. Waktu retensi dan puncak masingmasing komponen diukur untuk dibandingkan dengan standar demi mengetahui jenis dan komponen asam lemak sampel. Hasil analisis asam lemak yang dilakukan memiliki Sertifikat No. LT Jumlah kandungan komponen dihitung dengan rumus berikut: Keterangan: Vsampel Cstandar Ax As = Volume sampel = Konsentrasi standar = Luas puncak komponen x = Luas puncak standar 2. Data identitas dan karakteristik subyek Data identitas dan karakteristik subyek yang dikumpulkan secara primer yaitu melalui kuesioner. Hal yang diminta meliputi nama, tempat/ tanggal lahir, tempat tinggal dan riwayat kesehatan keluarga. 3. Data antropometri subyek Pengukuran antropometri subyek dilakukan sekali pada masa sebelum intervensi. Pengukuran yang dilakukan berupa pengukuran berat badan menggunakan timbangan dan tinggi badan menggunakan microtoise. Seluruh subyek diukur menggunakan alat timbangan dan microtoise yang sama. Hal ini dilakukan untuk mengurangi bias yang dapat terjadi akibat perbedaan alat. 4. Kebiasaan makan sumber lemak subyek Kebiasaan makan subyek diukur dengan mengumpulkan data frekuensi makan, kebiasaan makan 2 hari sebelum masa intervensi dan kebiasaan makan selama 7 hari pada masa intervensi. Maka frekuensi pengumpulan data kebiasaan makan secara keseluruhan sebanyak 10 kali. Pengukuran frekuensi subyek mengonsumsi makanan sumber lemak dilakukan menggunakan food frequency questionnaire. Pengumpulan data frekuensi makan ini bertujuan untuk melihat rata-rata banyaknya konsumsi makanan sumber lemak subyek dalam satu bulan. Kebiasaan makan sebelum intervensi dilakukan menggunakan food recall questionaire 2x24 jam, yang bertujuan untuk melihat kebiasaan makan subyek

11 35 sebelum masa intervensi. Pada akhirnya, peneliti ingin melihat apakah ada perbedaan asupan pada masa sebelum dan dalam masa intervensi. Kuesioner ini dilakukan dengan metode wawancara langsung, dan subyek tidak diberitahu sebelumnya bahwa akan diambil data food recall. Kebiasaan makan pada masa intervensi dilakukan selama 7 hari dari 15 hari masa intervensi. Hal ini dirasa sudah representatif untuk melihat konsumsi makan subyek pada masa intervensi dan dilakukan dengan menggunakan food record questionnaire. Pengambilan data ini dilakukan oleh subyek sendiri, dengan mengisi sendiri buku food record yang telah diberikan kepada subyek. Cara pengisian telah diterangkan sebelumnya kepada subyek. 5. Kadar kolesterol total, kolesterol HDL dan trigliserida plasma subyek Kadar kolesterol total, kolesterol HDL dan trigliserida diukur menggunakan metode CHOD-PAP, Direct dan GPO-PAP dengan 2 kali frekuensi pengumpulan. Sampel yang digunakan adalah plasma subyek sedangkan reagen yang digunakan merupakan reagen merek Human berupa cholesterol complete test kit. Berikut merupakan prosedur analisis kolesterol total, kolesterol HDL dan trigliserida. Prosedur analisis kolesterol total ETI (metode CHOD-PAP) Analisis untuk mengukur kadar kolesterol plasma dilakukan menggunakan Cholesterol Analysis Kit merek Human no x100 ml. Sampel adalah plasma yang berasal dari darah vena subyek yang telah dipisahkan plasmanya melalui sentrifugasi di dalam tabung berisi EDTA. Kadar kolesterol ditentukan setelah reaksi hidrolisis enzimatik dan oksidasi. Indikator yang digunakan adalah quinoneimin yang terbentuk dari hidrogen peroksida dan 4-aminofenazon akibat adanya fenol dan peroksidase. Prinsip reaksi seperti tertera di bawah ini: Kolesterolester Kolesterol +O2 CHE CHO 2 H 2 O aminofenazon + fenol kolesterol + asam lemak kolesterolen-3-satu + H 2 O 2 POD quinoneimin + 4 H 2 O Sampel plasma dan standar diambil sebanyak 10 µl dan 1000 µl kit pereaksi dipipet ke dalam tabung reaksi, dikocok hingga homogen. Campuran diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37 o C, kemudian dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 500 nm.

12 36 Prosedur analisis HDL ETI (Metode Direct) Pengukuran kadar kolesterol HDL dilakukan dengan Cholesterol HDL Analysis Kit merek Human No x80 ml. Sampel adalah plasma yang berasal dari darah vena subyek yang telah dpisahkan melalui sentrifugasi. Pertama-tama pengukuran dilakukan dengan presipitasi terhadap lipoprotein densitas rendah (LDL dan VLDL) dan kilomikron dengan penambahan asam fosfotungstat dan ion magnesium (MgCl 2 ). Setelah proses sentrifugasi, fraksi HDL dalam supernatan diukur menggunakan pereaksi kit untuk pengukuran kolesterol (CHOD-PAP). a. Prosedur presipitasi Sebanyak 200 µl plasma darah dan 500 µl pereaksi presipitasi yang telah diencerkan dengan akuabides dengan rasio 4:1, kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar. Setelahnya campuran disentrifuge pada 4000 rpm selama 10 menit sehingga diperoleh supernatan yang siap dianalisis. b. Prosedur penentuan kolesterol HDL Sebanyak 100 µl supernatan dipipet ke dalam tabung reaksi dan 1000 µl pereaksi kolesterol, dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 5 menit. Campuran kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 500 nm. Prosedur Analisis Trigliserida ETI (Metode GPO-PAP) Analisis untuk mengukur kadar trigliserida plasma dilakukan menggunakan Trigliceride Analysis Kit merek Human. Sampel adalah plasma yang berasal dari darah vena subyek yang telah dipisahkan plasmanya melalui sentrifugasi di dalam tabung berisi EDTA. Kadar trigliserida ditentukan setelah reaksi hidrolisis enzimatik dengan lipase. Indikator yang digunakan adalah quinoneimin yang terbentuk dari hidrogen peroksida, 4-amino-antipirin dan 4-klorofenol dengan pengaruh katalitik dari peroksidase. Prinsip reaksi seperti tertera di bawah ini: Trigliserida Gliserol + ATP lipase GK Gliserol-3-fosfat + O2 gliserol + asam lemak gliserol-3-fosfat + ADP GPO H 2 O aminoantipirin + 4-klorofenol dihidroksiaseton fosfat + H 2 O 2 POD quinoneimin + HCl + H 2 O Sampel plasma dan standar diambil sebanyak 10 µl dan 1000 µl pereaksi kit dipipet ke dalam tabung reaksi, dikocok hingga homogen.

13 37 Campuran diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37 o C, kemudian dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 500 nm. Pengolahan dan Analisis Data Data yang diolah dalam penelitian ini adalah data karakteristik meliputi riwayat kesehatan keluarga dan antropometri (berat badan dan tinggi badan), kebiasaan makan, serta kadar kolesterol total, kolesterol HDL dan LDL dan trigliserida. Tabel 13 menggambarkan pengolahan dan analisis dari masingmasing data. Tabel 13 Jenis data, pengolahan dan analisis data Jenis Data Karakteristik subyek Status gizi subyek Kebiasaan makan subyek Pengaruh intervensi terhadap kadar kolesterol total, HDL, LDL dan trigliserida plasma subyek Pengolahan dan Analisis Data Analisis deskriptif IMT menurut WHO (2000) dan analisis deskriptif Diolah dengan NutriSurvey (2005), WNPG (2004), analisis deskriptif Indikator AHA (2005), Friedewald et al. (1972), analisis paired t-test 1. Karakteristik subyek. Karakteristik subyek yang dianalisis berupa usia dan riwayat kesehatan keluarga. Data usia dan riwayat kesehatan keluarga diperoleh melalui kuesioner identitas dan karakteristik subyek. Data usia subyek dirata-ratakan, sedangkan data riwayat kesehatan keluarga disajikan dalam bentuk persentase. Persentase setiap jenis riwayat penyakit keluarga subyek diperoleh dengan membandingkan jumlah subyek yang memiliki salah satu atau kedua orang tua dengan riwayat penyakit tersebut dengan jumlah total subyek dalam penelitian. 2. Status gizi. Pengelompokan status gizi dilakukan berdasarkan hitungan IMT dari berat badan dan tinggi badan dengan pengklasifikasian WHO for Asian (2000). IMT diperoleh menggunakan rumus berikut: IMT = berat badan (kg) / tinggi 2 (m 2 ) Subyek terpilih telah memenuhi kriteria inklusi yang utama, yaitu mengalami obesitas, maka pengelompokan IMT yang digunakan adalah Obes I dan Obes II. Berikut adalah cut off point status gizi menurut IMT untuk orang dewasa Asia menurut WHO (2000).

14 38 Tabel 14 Pengelompokan status gizi untuk dewasa menurut IMT Status Gizi IMT (kg/m 2 ) Underweight < 18.5 Normal Overweight Obes I Obes II 30 Sumber: WHO (2000) 3. Kebiasaan makan subyek. Data kebiasaan makan yang telah dikumpulkan dengan food frequency questionaire dianalisis secara deskriptif. Data food recall dan food record questionaire diolah menggunakan NutriSurvey Indonesia (2005) sehingga didapat rata-rata konsumsi subyek sebelum intervensi dan pada masa intervensi. Tingkat kecukupan subyek merupakan persentase yang dihitung dengan membagi tingkat konsumsi dengan kebutuhan subyek. Kebutuhan subyek didapat menggunakan Angka Kecukupan yang tercantum dalam Widyakarya Nasional Pangan dan Gizi (2004). Tabel 15 merangkum cara perhitungan yang digunakan untuk melihat kebutuhan subyek berdasarkan Angka Kecukupan. Tabel 15 Cara perhitungan kebutuhan subyek Angka Kecukupan Perhitungan Pria Energi (Oxford Equation) (16.8BBideal + 498) x TKFsdg Lemak (WNPG 2004) 25% dari AKE 25% dari AKE Lemak jenuh (WNPG 2004) 8% AKE 8% dari AKE Kolesterol (IOM 2002) 300 mg 300 mg Serat (IOM dalam WNPG 2004) Wanita (13.4BBideal + 517) x TKF sdg 10/1000 kkal 10/1000 kkal Penghitungan berat badan ideal dilakukan dengan rumus (TB 100) 10% (TB-100). Penghitungan Angka Kecukupan Energi menggunakan rumus Oxford Equation, dengan faktor Tingkat Kegiatan Fisik (TKF) untuk orang dewasa sedang menurut FNRI. Hal ini sesuai dengan apa yang disarankan dalam WNPG (2004). Angka faktor TKF sedang untuk pria dan wanita yang digunakan yaitu sebesar 1.67 dan Angka kecukupan kolesterol menggunakan saran Institute of Medicine (2002) yaitu 300 mg, yang mana merupakan batas mengurangi resiko terjadinya penyakit kardiovaskular (Mahan & Escott-Stump 2008). Angka kecukupan serat yang digunakan merupakan kecukupan terendah, yaitu 10/1000 kkal dari kecukupan energi subyek. Kecukupan serat makanan

15 39 berkisar antara g/kap/hari bagi anak 1 tahun adalah g/ 1000 kkal (WNPG 2004). Tingkat kecukupan energi dan zat gizi subyek dari asupan pangan dan minuman yang diintervensikan pada masa intervensi dilakukan dengan menghitung persentase penambahan asupan energi dan zat gizi dari minuman dan dari pangan, dibagi kebutuhan. Energi dan lemak yang disumbangkan dari minuman didapatkan dari hasil penelitian Rachman (2012) kemudian dikali dua karena subyek diberikan intervensi minuman 2 sajian per hari. Total lemak jenuh minuman didapat dari hasil analisis jumlah asam lemak jenuh pada minuman, dikali 2 untuk menyesuaikan dengan jumlah minuman per sajian kemudian dikali 2 lagi karena subyek mengonsumsi minuman 2 sajian per hari. Nilai kolesterol didapat dari total kolesterol dalam minyak bekatul Oryza Grace dan cokelat. Nilai serat didapat dari serat cokelat bubuk (Mulato & Suharyanto 2011) karena serat dari minyak bekatul bernilai 0. Setelah data diolah menggunakan NutriSurvey 2005, data dientri ke dalam MExcel 2007 dan disajikan dalam pembahasan menggunakan analisis deskriptif. Pada akhirnya, tingkat kecukupan subyek pada masa sebelum dan dalam masa intervensi dibandingkan untuk melihat tidak adanya perubahan diet selama masa intervensi. 4. Pengaruh intervensi terhadap kadar kolesterol total, HDL, LDL dan trigliserida subyek. Kadar kolesterol total dan trigliserida didapat dari membagi nilai absorbansi hasil dengan absorbansi standar, dikalikan 200 mg/dl, sedangkan kadar kolesterol HDL didapat dari membagi nilai absorbansi hasil dengan absorbansi standar dikali 175 mg/dl. Cara perhitungan kadar kolesterol total, HDL dan trigliserida tertulis dengan rumus berikut. Kadar kolesterol dan trigliserida (mg/dl) = (absorbansi sampel) x 200 mg/dl (absorbansi standar) Kadar kolesterol HDL (mg/dl) = (absorbansi sampel) x 175 mg/dl (absorbansi standar) Kadar kolesterol LDL didapat dari perhitungan kadar kolesterol total, HDL dan trigliserida yang telah diketahui sebelumnya. Perhitungan kadar kolesterol LDL menggunakan rumus Friedewald et al. (1972) sebagai berikut. Kadar LDL = Kadar kolesterol total kadar HDL kadar trigliserida /5 (mg/dl)

16 40 Rata-rata hasil kolesterol total, HDL, LDL dan trigliserida pre dan postintervensi yang telah didapat kemudian diuji kenormalan datanya menggunakan Descriptive Statistic pada SPSS 16 for Windows. Kenormalan data (p > 0.05) didapat setelah seluruh data di transformasi. Setelah seluruh data normal, dilakukan uji paired t-test untuk melihat adanya perbedaan kadar profil lipid subyek sebelum intervensi dan setelah intervensi. Definisi Operasional Asam lemak komponen organik yang terbentuk dari rantai karbon dengan hidrogen terikat dan grup asam (COOH) di ujung satu dan grup metil (CH 3 ) pada ujung lainnya. Dewasa obes adalah manusia berusia di atas 19 tahun yang memiliki Indeks Massa Tubuh 25 kg/m 2. Subyek adalah keduabelas mahasiswa dan mahasiswi yang termasuk kategori obes (IMT 25 kg/m 2 ) serta memiliki kesesuaian dengan kriteria inklusi lainnya. Bersedia berpartisipasi dalam penelitian ini yang dinyatakan secara tertulis melalui informed consent dan diberikan intervensi. Minuman emulsi minyak bekatul adalah minuman emulsi minyak bekatul yang dikembangkan oleh peneliti. Minuman ready to drink emulsi minyak bekatul-cokelat adalah minuman dalam kemasan ready to drink yang dikembangkan oleh Rachman (2012) yang diintervensikan kepada subyek berupa emulsi minyak bekatul-cokelat. Minuman yang diintervensikan adalah minuman ready to drink emulsi minyak bekatul dan cokelat. Intervensi minuman ready to drink emulsi minyak bekatul-cokelat adalah pemberian minuman yang bersifat ready to drink atau dapat langsung diminum berupa emulsi minyak bekatul-cokelat sebanyak 200 ml kepada subyek selama 15 hari dengan dosis meminum 2x sehari. Kebiasaan makan adalah cara individu atau kelompok individu memilih pangan dan mengonsumsi sebagai reaksi terhadap pengaruh fisiologi, psikologi dan sosial budaya yang diukur menggunakan kuesioner food frequency, food recall 2x24 jam dan food record selama 7 hari.