STUDI TENTANG PROTEIN ORGAN HATI YANG BERINTERAKSI DENGAN AFLATOKSIN B 1

Transkripsi

1 STUDI TENTANG PROTEIN ORGAN HATI YANG BERINTERAKSI DENGAN AFLATOKSIN B 1 EKO SUGENG PRIBADI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2006

2 PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa Disertasi dengan judul Studi tentang Protein Organ Hati yang Berinteraksi dengan Aflatoksin B 1 adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber-sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun yang tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini. Bogor, Maret 2006 Eko Sugeng Pribadi SVT/995133

3 ii ABSTRAK EKO SUGENG PRIBADI. Studi tentang Protein Organ Hati yang Berinteraksi dengan Aflatoksin B 1. Komisi Pembimbing: I WAYAN T. WIBAWAN, FACHRIYAN H. PASARIBU, RIZAL SYARIEF Biotransformasi dan bioaktivasi aflatoksin merupakan suatu proses metabolisme di dalam tubuh yang berperan penting bagi aktivitas aflatoksin. Kedua proses ini terjadi di dalam organ hati. Satu tipe protein yang berikatan dengan aflatoksin B 1 (PAB 1 ) dari organ hati telah diisolasi menggunakan teknik kromatografi affinitas. AFB 1 diikatkan pada matriks nitroselulosa yang diaktifkan dengan Br-CN untuk menangkap protein kemudian diinkubasi dengan ekstrak hati bebek dan ayam yang mengandung protein. Kandungan protein di dalam ekstrak kasar adalah 0,4310 mg/ml untuk hati bebek dan 0,3946 mg/ml untuk hati ayam yang diukur menggunakan metode Bradford. Ada dua pita PAB 1 (66 dan 25 kda) yang diisolasi dari protein ayam dan hanya satu pita PAB 1 (66 kda) yang diisolasi dari protein bebek ketika diisolasi menggunakan teknik SDS-PAGE. Antibodi terhadap PAB 1 dihasilkan dengan menggunakan hewan coba kelinci yang disuntik dengan PAB 1 yang telah diisolasi. Keberadaan dan titer antibodi terhadap PAB 1 (APAB 1 ) diperiksa menggunakan teknik AGPT. APAB 1 yang diperoleh digunakan untuk memeriksa penyebaran PAB 1 di dalam jaringan hati menggunakan teknik imunohistokimiawi. Penyebaran PAB 1 di dalam jaringan hati didapatkan di dalam preparat jaringan hati bebek dan ayam. Keberadaan PAB 1 di dalam organ hati bebek lebih banyak dan menyebar dibandingkan di dalam organ hati ayam. Kata-kata kunci: aflatoksin B 1, PAB 1, penyebaran PAB 1.

4 iii ABSTRACT EKO SUGENG PRIBADI. Study on Liver Organ Proteins which Interacted to Aflatoxin B 1. Supervised by I WAYAN T. WIBAWAN, FACHRIYAN H. PASARIBU, RIZAL SYARIEF Biotransformation and bioactivation of aflatoxin play an important role in activity of aflatoxin. These processes will be took place in liver cell. The soluble intracellular aflatoxin B 1 -binding protein (PAB 1 ) was isolated with an affinity chromatography technique. For this, AFB 1 was immobilized on Br-CN activated nitrocellulose, then incubated with duck and chicken liver crude extract containing protein. Protein concentration of crude extract are mg/ml for duck liver and mg/ml for chicken liver measured by Bradford method. Two major protein bands was expressed by isolated PAB 1 of chicken liver organs (66 and 25 kda) and one protein band (66 kda) for duck determined with SDS-PAGE. Antibodies against PAB 1 were produced using rabbits injected with isolated PAB 1 and the occurrence and the titre of specific antibodies were confirmed with AGPT. The antibody PAB 1 was used to explore the distribution of PAB 1 in liver tissues with immunohistochemistry technique. PAB 1 distribution could be detected in duck as well as chicken liver preparation. The occurrence of PAB 1 in duck liver is clearly disseminate compared to chicken. Keywords: aflatoxin B 1, PAB 1, PAB 1 distribution

5 iv STUDI TENTANG PROTEIN ORGAN HATI YANG BERINTERAKSI DENGAN AFLATOKSIN B 1 EKO SUGENG PRIBADI Disertasi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar DOKTOR pada Program Studi Sains Veteriner SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2006

6 v Judul disertasi : Studi tentang Protein Organ Hati yang Berinteraksi dengan Aflatoksin B 1. Nama : Eko Sugeng Pribadi NRP : Program Studi : Sains Veteriner Disetujui Komisi Pembimbing Dr. drh. I Wayan T. Wibawan, MS. Ketua Prof. Dr. drh. Fachriyan H. Pasaribu Anggota Prof. Dr. Ir. H. Rizal Syarief SN, DESS Anggota Diketahui Ketua Program Studi Sains Veteriner Dekan Sekolah Pascasarjana drh. Bambang P. Priosoeryanto, MS., Ph.D. Prof. Dr. Ir. Sjafrida Manuwoto, MSc. Tanggal ujian : Tanggal lulus :

7 vi PRAKATA Assalaamu alaikum wr. wb. Syukur alhamdulillah Penulis panjatkan kepada Allah swt karena kuasanya dan rahmatnya pada akhirnya Penulis dapat menyelesaikan penulisan disertasi Studi tentang protein organ hati yang berinteraksi dengan aflatoksin B 1 menjadi syarat untuk menyelesaikan pendidikan program doktor di Program Studi Sains Veteriner Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Penulis sangat bersyukur karena memiliki guru-guru besar, hebat dan mengagumkan yang diantaranya adalah Dr. drh. I Wayan T. Wibawan, MS., Prof. Dr. drh. Fachriyan H. Pasaribu dan Prof. Dr. Ir. Rizal Syarief SN, DESS, yang telah bersedia dengan sabar selalu mengajak diskusi, membimbing dan mengarahkan Penulis selama menempuh pendidikan dan selalu memberi dorongan untuk menyelesaikan pendidikan ini. Rasa bangga juga Penulis rasakan karena memiliki kolega-kolega, seperti Dr. Setyo Widodo, Dr. Soeripto, Prof. Djokowoerjo Sastradipradja, Dr. Dewi Apri, drh. Gani, drh. Oetoro, drh. Sukobagyo, dr. Soedjasmiran dan masih banyak yang tidak mungkin disebutkan semuanya, yang selalu memberikan semangat untuk TETAP menyelesaikan pendidikan ini. Ucapan terima kasih kepada drh. Dewa Made Ngurah Dharma. Ucapan terima kasih khusus untuk drh. Ida Lestari, drh. Ketut Karuni, MSi, drh. Pudji, Ph.D. dan seluruh rekan di BPMSOH. Terima kasih kepada drh. Lia, drh. Yuni, drh. Wandi, Bapak Medi dan Ibu Yeni atas bantuan selama Penulis memanfaatkan fasilitas penelitian di PT. Bio Farma (Persero). Ucapan terima kasih kami haturkan kepada drh. Tutik Wresdiyati, Ph.D. yang walaupun dengan kondisi kesehatan yang kurang namun masih bersemangat berbagi pengetahuan tentang uji imunohistokimiawi. Juga, kepada drh. Adi Winarto, Ph.D. dan drh. Ketut Mudite Adnyane, Msi. yang selalu membantu dan menemani ketika kami hampir merasakan kejenuhan sewaktu melakukan uji imunohistokimiawi. Terima kasih untuk tim khusus gerak cepat, yaitu Pak Aria, Pak Agus Somantri, Sastra Abeng Gumilar, Dodi dan Ika, atas bantuan selama penelitian

8 vii dan kesediaan menemani selama penelitian. Juga Pak Rudi, Pak Said, Pak Rafi, Pak Kosasih untuk informasi kolokium, Pak Kosasih dan Pak Budi atas seluruh dukungannya. Sujud saya kepada Bapak dan Ibu yang selalu penuh doa dan harapan agar Penulis dapat segera menyelesaikan semua ini, almarhum Papa yang selalu mengingatkan Penulis dengan perbincangan terakhirnya dan Mama. Pelukan dan ciuman hangat untuk istriku Rina, atas kesabaran dan pengertiannya menemani hingga disertasi ini selesai dikerjakan, dan tak lupa untuk Vira. Penulis tidak dapat menyebutkan semua pihak yang selama ini telah membantu dan mendorong Penulis untuk menyelesaikan pendidikan ini. Penulis hanya berharap agar semua kebaikan yang sudah diberikan selama ini akan dibalas dengan rahmat yang berlipat dari Allah swt. Akhir tulisan, Penulis sembahkan tulisan ini untuk pengembangan ILMU PENGETAHUAN. Wassalaamu alaikum wr. wb. Bogor, Desember 2006 Eko S. Pribadi

9 viii RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Pendopo-Palembang pada tanggal 5 Juni 1964 dari pasangan Ponimin dan Markomah. Penulis merupakan anak pertama dari lima bersaudara. Pendidikan dasar dan menengah pertama dilalui Penulis di Jambi. Setelah menyelesaikan pendidikan di SMA Negeri 1 Bogor, Penulis meneruskan pendidikan ke Institut Pertanian Bogor melalui jalur Proyek Perintis II (jalur tanpa ujian). Penulis menyelesaikan pendidikan sarjana kedokteran hewan pada tahun 1987 dan dokter hewan pada tahun 1988 pada Fakultas Kedokteran Hewan IPB. Pendidikan pascasarjana program magister di Program Studi Sains Veteriner Sekolah Pascasarjana IPB ditempuh selama penulis masih bekerja di sektor swasta sebagai konsultan dan program tersebut dapat diselesaikan pada tahun Program Doktor mulai dijalani sejak tahun 1999 di Program Studi Sains Veteriner Sekolah Pascasarjana IPB. Begitu lulus dokter hewan, Penulis langsung menjalani karir di sektor swasta sebagai technical advisor di PT. Pyridam. Setahun kemudian, Penulis berkarir sebagai konsultan bidang AMDAL dan lingkungan hidup paruh waktu di beberapa kantor konsultan. Tahun 1992 menjadi pegawai negeri sipil di IPB. Saat ini Penulis terdaftar sebagai staf pengajar di Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan IPB. Penulis menikahi Ir. Iriana Ekasari pada tahun 1993 yang berkarir di sektor swasta dan dikaruniai seorang putri bernama Savira Anjani yang saat ini sudah duduk di kelas VI SD.

10 ix DAFTAR ISI DAFTAR GAMBAR xi DAFTAR TABEL xii DAFTAR LAMPIRAN. xiii PENDAHULUAN 1 Latar belakang 1 Tujuan penelitian. 4 Hipotesis.. 4 Manfaat hasil penelitian. 5 TINJAUAN PUSTAKA.. 6 Cendawan Aflatoksigenik. 6 Sifat Fisik dan Kimiawi Aflatoksin sebagai Racun... 7 Biosintesis Aflatoksin 9 Organ Hati dan Proses Biotransformasi Aflatoksin. 13 Pencemaran Aflatoksin dalam Pakan dan Bahan Makanan. 18 Gangguan Kesehatan Ternak dan Manusia oleh Aflatoksin. 22 Teknik-Teknik untuk Mendeteksi Aflatoksin dan Mendiagnosa Aflatoksikosis.. 25 Pengendalian Mikotoksin.. 26 Pengobatan terhadap Aflatoksikosis 30 BAHAN DAN METODE PENELITIAN.. 32 Tempat dan Waktu Penelitian 32 Bahan Penelitian Hewan Percobaan Organ Hati Bahan Kimia 34 Metode Penelitian Ekstraksi Sel Hati Penentuan Kadar Protein Pembuatan Matriks AFB Pemurnian PAB Karakterisasi PAB Produksi Anti-Protein (APAB 1 ) Uji Keberadaan Anti-Protein (APAB 1 ) Pemeriksaan Histologik Ikatan PAB 1 dan APAB 1 di Organ Hati Pewarnaan Hematoksilin-Eosin Pewarnaan Imunohistokimiawi Evaluasi dan Analisis Statistika. 42

11 x HASIL DAN PEMBAHASAN 43 Ekstraksi Hati 43 Matriks AFB Protein yang Berikatan dengan AFB 1 murni (PAB 1 ). 45 Antibodi Poliklonal PAB 1 48 Gambaran Histologik PAB 1 di Preparat Jaringan Hati Sehat 50 SIMPULAN DAN SARAN. 57 Simpulan. 57 Saran 57 DAFTAR PUSTAKA.. 58

12 xi DAFTAR GAMBAR No. Judul Hal 1. Gambaran Jalur Poliketida yang merupakan jalur awal 10 metabolisme untuk sintesis aflatoksin 2. Peranan beberapa prekursor dalam tahapan sintesis aflatoksin Bagan proses biotransformasi dan bioaktivasi AFB 1 yang terjadi di sitokrom P450 organ hati primata non-manusia 4. Peranan mikrosoma CYP1A2 dan CYP3A4 dalam bioaktivasi AFB 1 menjadi AFB 1-8,9-epoksida 5. Hewan percobaan kelinci yang digunakan untuk memproduksi APAB dipelihara dalam kan-dang bertingkat (Lokasi: Ruang Pemeliharaan Hewan, Laboratorium Monitoring Hewan PT. Bio Farma (Persero) 6. Penyuntikan PAB 1 kepada hewan coba kelinci melalui. 38 v. auricularis (a). Serum diambil setiap lima hari setelah penyuntikan untuk dilakukan pemantauan keberadaan dan titer APAB 1 (b) 7. Kurva baku yang diperoleh untuk menghitung kadar protein 44 di dalam contoh ekstrak 8. Bagan pengaktifan nitroselulosa dengan menggunakan bromsian. 45 (CNBr) menjadi matriks penangkapan AFB 1 dan PAB 1 9. Pita protein hasil uji elektroforesis terhadap PAB 1 dari hati ayam (A), bebek (B) dan penanda (marker, P) 10. Hasil reaksi positif uji presipitasi yang diwujudkan dalam bentuk. 48 garis presipitasi (tanda panah) antara antibodi poliklonal APAB 1 (lubang pinggir) antigen PAB 1 (lubang tengah) dari protein hati bebek (A) dan ayam (B) 11. Titer antibodi APAB 1 yang diha-silkan oleh kelinci yang 49 disuntik dengan PAB 1 melalui v. auricularis 12. Garis presipitasi (tanda panah) dari hasil uji silang antara PAB dari organ hati bebek dengan APAB 1 yang digertak oleh PAB 1 dari organ hati ayam (a) dan PAB 1 dari organ hati ayam dengan

13 xii APAB 1 yang digertak oleh PAB 1 dari organ hati bebek (b) 13. Gambaran histologik jaringan hati ayam yang sehat. 51 (Pewarnaan: HE. Pembesaran: 10x) 14. Gambaran histologik jaringan hati bebek yang sehat 51 (Pewarnaan: HE. Pembesaran: 10x) 15. Hasil pewarnaan imunohistokimiawi terhadap hati ayam (a) dan 52 bebek (b). Endapan berwarna coklat-kehitaman (tanda panah) menandakan dilokasi tersebut terdapat PAB 1. Pembesaran: 10x. 16. Keberadaan PAB 1 di dalam endothelial pembuluh darah vena. 52 sentralis (tanda panah) dari hati bebek yang diwarnai dengan teknik imunohistokimiawi. Pembesaran: 20x 17. Posisi protein yang berikatan dengan AFB 1 pada sel hati ayam (a).. 54 dan bebek (b). Lokasi protein (tanda panah) berada di daerah sinusoid. Sedangkan hepatosit tidak terwarnai (h) (Pembesaran 100x) DAFTAR TABEL No. Judul Hal 1. Sifat fisik dan kimiawi aflatoksin 8 2. Gen yang terlibat dalam proses biosintesis AFB Kandungan aflatoksin pada sampel kacang tanah dan produk olahannya di Indonesia 4. Nilai absorbansi larutan baku BSA yang digunakan untuk 43 membuat kurva baku

14 xiii DAFTAR LAMPIRAN No. Judul Hal 1. Perhitungan statistika untuk menentukan nilai keragaman.. 77 populasi PAB 1 pada jaringan hati bebek dan ayam