INTRODUKSI GEN PENYANDI 6-DESATURASE-LIKE PADA IKAN LELE (Clarias gariepinus) ANNY HARY AYU SUARDI

Transkripsi

1 INTRODUKSI GEN PENYANDI 6-DESATURASE-LIKE PADA IKAN LELE (Clarias gariepinus) ANNY HARY AYU SUARDI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2017

2

3 PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Introduksi Gen Penyandi 6-Desaturase-Like Pada Ikan Lele (Clarias gariepinus) adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Mei 2017 Anny Hary Ayu Suardi NIM C

4 RINGKASAN ANNY HARY AYU SUARDI. Introduksi Gen Penyandi 6-Desaturase-Like Pada Ikan Lele (Clarias gariepinus). Dibimbing oleh ALIMUDDIN dan DEDI JUSADI. Asam lemak ekosapentanoat (EPA) dan dokosaheksanoat (DHA) paling banyak terdapat pada ikan laut. Namun demikian, harga ikan laut yang relatif mahal dan kemampuan untuk memperolehnya yang tidak mudah, menjadi permasalahan dalam pemenuhan EPA dan DHA. Teknologi transgenesis merupakan rekayasa genetik yang memungkinkan diperolehnya ikan dengan kualitas lebih baik melalui introduksi gen. Salah satu metode transgenesis yang dapat digunakan adalah elektroporasi. Elektroporasi merupakan metode transgenesis yang mudah dilakukan, dan dapat diterapkan pada gamet khususnya sperma. Keberhasilan teknologi transgenesis telah dilaporkan menggunakan gen penyandi enzim metabolik Δ6-desaturase-like ikan salmon masu (Oncorhynchus masou) (OmΔ6FAD) pada ikan zebra (Danio rerio). Over-ekspresi gen tersebut menyebabkan kenaikan kandungan EPA pada ikan zebra generasi kedua (F2) sekitar 44% dibandingkan kontrol, sementara kandungan DHA sekitar 111% dibandingkan dengan kontrol. Persentase keberhasilan transfer gen yang tinggi juga diharapkan dapat dicapai pada ikan lele. Sebagai tahap awal, penelitian ini dilakukan untuk menentukan konsentrasi DNA yang menghasilkan viabilitas tinggi dan sperma yang membawa vektor ekspresi Om FAD. Hasil penelitian tahap pertama digunakan untuk membuat ikan lele transgenik keturunan awal (F0). Induksi ovulasi dilakukan menggunakan ovaprim dengan dosis 0,1 ml kg -1 bobot tubuh pada induk jantan dan 0,3 ml kg -1 bobot tubuh pada induk betina. Pemijahan dilakukan dengan metode semibuatan. Elektroporasi dilakukan menggunakan Gene pulser II (Biorad, USA) dengan tipe kejutan square wave. Terdapat tiga konsentrasi DNA yang diuji yaitu : 25, 50, dan 100 mg ml -1. Program elektroporasi berdasarkan metode Gusrina (2011) dilakukan pada ikan lele dengan kuat tegangan 125 Volt cm -1, lama kejutan 30 milidetik, jumlah kejutan 5 kali, jeda waktu antar kejutan 0,1 detik dengan ukuran kuvet 0.2 cm. DNA yang ditransfer adalah dalam bentuk plasmid pmba-om 6FAD. Ekspresi gen Om FAD pada konstruksi ini dikendalikan oleh promoter β-aktin ikan medaka (mba). Indeks motilitas sperma diamati sebelum dan setelah perlakuan elektroporasi, penilaian motilitas didasarkan pada kriteria banyaknya sperma yang bergerak maju (progresif) dengan skoring berdasarkan Guest et al. (1976). Viabilitas sperma diamati sebelum dan setelah perlakuan elektroporasi diamati melalui pewarnaan Giemsa (de la Cueva, 1997). Motilitas terbaik diperoleh pada konsentrasi DNA 100 mg ml -1, sedangkan viabilitasnya sama dengan perlakuan kontrol tanpa elektroporasi. Derajat pembuahan, derajat penetasan telur dan kelangsungan hidup larva umur 14 hari juga relatif sama dengan perlakuan kontrol. Dengan demikian, konsentrasi DNA berbeda berpengaruh terhadap motilitas sperma pascaelektroporasi, tetapi tidak mempengaruhi viabilitas, derajat pembuahan, derajat penetasan, dan kelangsungan hidup larva umur 14 hari. Untuk memastikan sperma yang

5 dielektroporasi adalah mengandung gen 6-desaturase-like, maka dilakukan analisis PCR. Hasil menunjukkan terdapat produk PCR (529 bp) hasil elektroporasi pada perlakuan konsentrasi 100 mg ml -1, sedangkan pada konsentrasi 25 dan 50 mg ml -1 serta kontrol tidak terdapat produk PCR. Hal ini menunjukkan bahwa konsentrasi DNA terbaik untuk program elektroporasi untuk ikan lele adalah 100 mg ml -1. Sperma hasil elektroporasi digunakan untuk membuahi telur ikan lele. Setelah ikan berumur 4 minggu, dilakukan identifikasi ikan transgenik yang membawa gen Om FAD pada sirip ikan lele. Persentase ikan lele yang membawa gen Om FAD adalah 53,84%. Profil asam lemak dianalisis menggunakan gas kromotografi. Hasil analisis menunjukkan bahwa tidak terdapat perbedaan signifikan kandungan asam lemak antara ikan transgenik F0 dan ikan non-transgenik. Dengan demikian, belum terdeteksi adanya aktivitas enzim Om FAD pada ikan lele F0. Kata Kunci : Clarias gariepinus, 6-desaturase-like, transgenik, asam lemak.

6 SUMMARY ANNY HARY AYU SUARDI. Introduction of 6-Desaturase-Like Gene in Catfish. Supervised by ALIMUDDIN and DEDI JUSADI. Eicosapentaenoic (EPA) and docosahexaenoic (DHA) are most numerous in marine fish. However, the price of marine fish are relatively expensive and it is not easy to get, become the problems in compliance of EPA and DHA. Transgenesis is genetic engineering technology that allows obtaining fish with better quality through the introduction of genes. One of transgenesis methods that can be used is electroporation. Electroporation is a method of transgenesis that is easy to do, and can be applied to a particular sperm. Technological successes of transgenesis have been reported using genes encoding metabolic enzymes Δ6-desaturase-like salmon masu (Oncorhynchus masou) (OmΔ6FAD) on zebrafish (Danio rerio). Over-expression of Om 6FAD increased in EPA content in zebrafish second generation (F2) of about 44%, while the DHA content of about 111% compared with controls. Successful gene transfer of Om 6FAD was also expected to be reached in catfish. As the first step, this study was conducted to determine the DNA concentration for electroporation that produced high viability and the sperm carried of pmba-omδ6fad expression vector. The result of the first step was then be used to produce the founder (F0) of transgenic catfish. Ovulation induction was performed using ovaprim at a dose of 0.1 ml kg -1 body weight of the male and 0.3 ml kg -1 body weight of the female broodstock. Spawning was done with semi-artificial methods. Electroporation was performed using Gene pulser II (Biorad, USA) with a square wave shock type. There were three concentrations of DNA were tested, namely 25, 50, and 100 mg ml -1. Program electroporation was based on Gusrina (2011) method that was voltage 125 V cm -1, pulse frequency 5 times, pulse length 30 millisecond, pulse interval 0.1 second. DNA was transferred on a pmba-omδ6fad plasmid form. Om 6FAD gene used in the construction was controlled by Japanese medaka β- actin promoter (mba). Sperm motility were observed before and after electroporation treatment, motility assessment criteria were based on the number of sperm move advanced (progressive) with scoring by Guest et al. (1976). Sperm viability was observed before and after treatment were observed by Giemsa staining electroporation (de la Cueva, 1997). High motility was obtained at DNA concentrations of 100 mg ml -1 while the viability was similar among treatment. Fertility rate, hatching rate and survival rate of 14 days old larvae were also similiar. Thus, different DNA concentration affected on sperm motility after electroporation but did not affect to the viability, fertility rate, hatching rate and survival rate of 14 days old larvae. To ensure the electroporated sperm was carrying the Om 6FAD gene, then we did the PCR analysis. The result showed that there was PCR product (529 bp)of electroporation in treatment of 100 mg ml -1, while no PCR product in treatment 25 mg ml -1, 50 mg ml -1, and the control were found. It showed that the best DNA concentration for electroporation program of catfish was 100 mg ml -1.

7 The sperm from electroporation result was used to fertilize the eggs. After a 4-week-old, we were identified the transgenic fish carrying Om 6FAD gene from fins of catfish. The percentage of fish that carry Om 6FAD gene was 53.84%. Fatty acid profile was analyzed by gas chromatography method. The result showed that there was no significant of fatty acid between the trasngenic and nontransgenic fish. Thus, it has not detected any enzyme activity of Δ6-desaturaselike in catfish F0. Key words: Clarias gariepinus, Δ6-desaturase-like, transgenic, fatty acid.

8 Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2017 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

9 INTRODUKSI GEN PENYANDI 6-DESATURASE-LIKE PADA IKAN LELE (Clarias gariepinus) ANNY HARY AYU SUARDI Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Ilmu Akuakultur SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2017

10 ii Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Dinar Tri Soelistyowati, DEA

11

12 iv

13 v PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah subhanahu wa ta ala atas segala karunia dan berkah-nya sehingga serangkaian karya ilmiah yang berjudul Introduksi Gen Penyandi 6-Desaturase-Like Pada Ikan Lele (Clarias gariepinus) ini dapat diselesaikan dengan baik. Terima kasih penulis ucapkan dengan hormat kepada Dr. Alimuddin dan Dr. Dedi Jusadi selaku pembimbing selayaknya orang tua yang telah banyak memberikan arahan dan masukan baik teknis maupun non-teknis kepada penulis sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Dinar Tri Soelistyowati, DEA selaku dosen penguji luar komisi pada ujian tesis atas segala saran yang diberikan sehingga tesis ini menjadi lebih baik. Penulis juga mengucapkan terima kasih dan rasa hormat kepada ayahanda Suardi AR serta ibunda Hajrah, SP dan juga adik Wahyu Imam Heryadi atas segala dukungan, kesabaran, pengertian, doa dan kasih sayangnya selama penulis menjalani masa studi. Ucapan terima kasih tak lupa penulis sampaikan kepada rekan rekan yang selama masa studi dapat menjadi motivasi dan memberikan pengaruh yang positif bagi penulis; Hasan Nasrullah, SPi; Deni Yunus Wijaya, SPi; Dr. Marlina Ahmad, SPi, MSi; Rangga Garnama, SPi; M. Fuadi, SPi; Yanti Nababan, SPi; Jannesa Nasmi, SPi, MSi; Agustina Buulolo SPi, MSi; keluarga besar Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik, Keluarga Besar Program Studi Ilmu Akuakultur 2014 yang tidak bisa disebutkan satu persatu serta seluruh pihak yang telah membantu dalam penelitian ini. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Hadiasman, SS atas segala motivasi yang diberikan selama penulis menjalani masa studi. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Mei 2017 Anny Hary Ayu Suardi

14 vi

15 vii DAFTAR ISI DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN 1 PENDAHULUAN 1 Latar Belakang 1 Rumusan Masalah 2 Tujuan 2 2 TINJAUAN PUSTAKA 3 Ikan Lele (Clarias gariepinus) 3 Transgenesis Melalui Metode Elektroporasi 3 Asam Lemak 5 3 METODE 7 Waktu dan Tempat Penelitian 7 Perbanyakan Plasmid pmba-omδ6fad 7 Koleksi Gamet 7 Elektroporasi Sperma 7 Motilitas dan Kelangsungan Hidup Spermatozoa 8 Pembuahan dan Penetasan Telur 9 Parameter Uji dan Analisis Data 9 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 11 Indeks Motilitas dan Viabilitas Sperma 11 Parameter Reproduksi dan Kelangsungan Hidup 13 Identifikasi Individu Ikan Membawa Transgen 14 Analisis Profil Asam Lemak 15 5 SIMPULAN DAN SARAN 16 Simpulan 16 Saran 16 DAFTAR PUSTAKA 17 LAMPIRAN 21 RIWAYAT HIDUP 23 DAFTAR TABEL 1 Indeks motilitas spermatozoa (Guest et al., 1976) 8 2 Indeks motilitas spermatozoa yang dielektroporasi dengan konsentrasi DNA berbeda (n=3) 12 3 Profil asam lemak (%) ikan lele transgenik F0 dan non-transgenik serta cacing sutra. 15 vii viii viii

16 viii DAFTAR GAMBAR 1 Jalur biosintesis asam lemak pada ikan lele (Oboh et al., 2016) 6 2 Viabilitas sperma hasil elektroporasi dengan konsentrasi DNA berbeda A25 = perlakuan dengan konsentrasi DNA 25 µg ml -1 ; A50 = perlakuan dengan konsentrasi DNA 50 µg ml -1 ; A100 = perlakuan dengan konsentrasi DNA 100 µg ml -1 ; STP= perlakuan kontrol tanpa elektroporasi; STD = perlakuan kontrol tanpa DNA tetapi dielektroporasi. Huruf di atas bar yang sama menunjukkan hasil yang tidak berbeda nyata berdasarkan uji lanjut Tukey (p<0,05) Elektroforegram produk PCR menggunakan primer spesifik Om 6FAD.A25 = perlakuan dengan konsentrasi DNA 25 µg ml -1 ; A50 = perlakuan dengan konsentrasi DNA 50 µg ml -1 ; A100 = perlakuan dengan konsentrasi DNA 100 µg ml -1. Keterangan: M =DNA marker Kapa DNA ladder (USA); K - = produk PCR tanpa template DNA; K + = produk PCR dengan template plasmid mba-om 6FAD 13 4 Derajat pembuahan telur (DPT), penetasan telur (PT) dan kelangsungan hidup larva (KL).A100= perlakuan dengan konsentrasi DNA 100 µg ml -1 ; STP = perlakuan kontrol tanpa elektroporasi; STD = perlakuan kontrol tanpa DNA tetapi dielektroporasi. Huruf di atas bar yang sama menunjukkan hasil yang tidak berbeda nyata berdasarkan uji lanjut Tukey (p<0,05) Elektroforegram produk PCR menggunakan primer spesifik Om 6FAD, dan β-aktin.keterangan: M = DNA marker Kapa DNA ladder (USA); nomor 1 s.d 13 adalah produk PCR dengan DNA dari sampel ikan uji. NT = produk PCR dengan template ikan non-transgenik; K - = produk PCR tanpa template DNA; K + = produk PCR dengan template plasmid mbp-om 6FAD. 14 DAFTAR LAMPIRAN 1 Hasil analisis ragam indeks motilitas spermatozoa yang dielektroporasi 21 2 Hasil analisis ragam spermatozoa yang dielektroporasi dengan konsentrasi DNA berbeda (n=3) 21 3 Hasil analisis ragam derajat pembuahan telur antar perlakuan 21 4 Hasil analisis ragam derajat penetasan telur antar perlakuan 22 5 Hasil analisis ragam kelangsungan hidup larva umur 14 hari antar perlakuan 22

17 1 PENDAHULUAN Latar Belakang Ikan lele (Clarias gariepinus) merupakan salah satu komoditas utama budidaya ikan air tawar di Indonesia. Pertumbuhan ikan lele relatif cepat dan teknologi budidaya sudah dikuasai membuat banyak pembudidaya memilih ikan lele untuk dibudidayakan. Hal ini dapat dilihat dari jumlah produksi ikan lele nasional pada tahun 2012 sebesar ton dengan kenaikan rata-rata pada tahun sebesar 47,21% (KKP, 2013). Asam lemak tak jenuh rantai panjang khususnya asam ekosapentanoat (EPA; C20:5n-3) dan asam dokosheksanoat (DHA; C22:6n-3) sangat penting untuk kesehatan manusia (Simopoulos, 1991; Lauritzen et al., 2001). Sumber EPA dan DHA dapat diperoleh dari ikan tawar dan ikan laut. Ikan tawar mampu menyintesis EPA dan DHA karena memiliki semua gen penyandi enzim yang terlibat dalam biosintesis kedua asam lemak tersebut, sedangkan ikan laut tidak memiliki salah satu atau lebih enzim. Namun demikian, kadar EPA dan DHA pada ikan laut lebih tinggi daripada ikan air tawar. Ikan laut mengakumulasi secara selektif dari pakan alami yang banyak mengandung EPA dan DHA. Sebagai contoh, ikan salmon Atlantik memiliki DHA sebanyak 13,1-15,2%, dan EPA 6,6-7,9% (Blanchet et al., 2005), sedangkan ikan lele memiliki kandungan DHA 0.68% dan EPA 0.43% (Gunawan et al., 2014). Δ6-desaturase adalah enzim metabolik asam lemak yang terlibat dalam biosintesis EPA dan DHA. Enzim ini menggunakan asam linolenat (LNA, C18:3n-3) sebagai substrat dan memungkinkan penyisipan ikatan ganda untuk memproduksi asam oktadekatetranoat (OTA, C18:4n-3). OTA kemudian dikonversi oleh enzim elongase untuk memproduksi asam eikosatetraenoat (ETA, C20:4n-3), yaitu substrat dari Δ5-desaturase pada sintesis EPA. Lebih lanjut, perpanjangan rantai EPA oleh elongase untuk memproduksi DPA, kemudian oleh enzim Δ6-desaturase dan β-oksidase berperan untuk menyintesis DHA (Sprecher, 2000). Perkembangan bioteknologi yang pesat pada saat ini memungkinkan untuk mendapatkan produk hasil perikanan yang memiliki karakteristik seperti yang diinginkan. Teknologi transgenesis merupakan rekayasa genetik yang memungkinkan diperolehnya ikan dengan kualitas lebih baik melalui introduksi gen. Elektroporasi merupakan metode transgenesis yang mudah dilakukan, dan dapat diterapkan pada gamet khususnya sperma (Sarmasik et al., 2001). Selanjutnya, gen yang diintroduksi atau disebut transgen merupakan penyandi protein tertentu yang mengontrol karakter yang diinginkan dan bermanfaat dalam menghasilkan ikan budidaya yang memiliki karakter unggul sesuai gen yang disisipkan. Keberhasilan teknologi transgenesis telah dilaporkan menggunakan gen penyandi enzim metabolik Δ6-desaturase-like ikan salmon masu Oncorhynchus masou (OmΔ6FAD) pada ikan zebra Danio rerio (Alimuddin et al., 2005). Over-ekspresi gen tersebut menyebabkan kenaikan kandungan EPA pada ikan zebra generasi kedua (F2) sekitar 44% dibandingkan kontrol, sementara kandungan DHA sekitar 111% dibandingkan dengan kontrol.

18 2 Melalui penelitian ini, perlakuan transfer gen OmΔ6FAD pada ikan lele diharapkan dapat meningkatkan kemampuan ikan dalam menyintesis EPA dan DHA sehingga dapat menjadi alternatif sumber EPA dan DHA yang lebih mudah diperoleh. Produksi ikan transgenik yang mengekspresikan gen OmΔ6FAD memerlukan berbagai tahap kegiatan. Kinerja gen yang diintroduksi terkait perbaikan fenotipe umumnya dianalisis pada ikan trangenik keturunan kedua (F2) (Alimuddin et al., 2005, 2008; Kobayashi et al., 2007). Tujuan penelitian ini adalah mendapatkan konsentrasi vektor ekspresi OmΔ6FAD yang menghasilkan viabilitas sperma tinggi, dan menghasilkan ikan lele transgenik generasi pertama (F0) melalui metode elektroporasi. Rumusan Masalah Kandungan EPA dan DHA pada ikan air tawar lebih rendah dibandingkan dengan ikan laut. Ikan air tawar memiliki kemampuan untuk menyintesis EPA dan DHA yang ditentukan oleh aktivitas kompleks dari enzim desaturase dan elongase (Tocher et al., 1998). Teknologi transgenesis merupakan rekayasa genetik yang memungkinkan diperolehnya ikan dengan kualitas lebih baik melalui introduksi gen. Elektroporasi merupakan metode transgenesis yang mudah dilakukan, dan dapat diterapkan pada gamet khususnya sperma (Sarmasik et al., 2001). Metode transgenesis dapat dilakukan dengan metode transfeksi, mikroinjeksi, dan elektroporasi, namun metode elektroporasi tidak memerlukan keterampilan tinggi dan dapat menghasilkan ikan transgenik dalam waktu yang singkat dibandingkan dengan kedua metode yang lain (Sarmasik et al., 2001). Elektroporasi merupakan metode transfer gen yang menggunakan kejut listrik untuk membantu memasukkan DNA ke dalam sel. Elektroporasi pada penelitian ini menggunakan tipe kejutan square wave yang diketahui lebih baik dan lebih efesien dibandingkan dengan tipe exponential (Takahashi et al., 1991). Melalui penelitian ini, perlakuan transfer gen OmΔ6FAD dengan metode elektroporasi pada ikan lele founder (F0) diharapkan dapat menghasilkan ikan lele yang mampu menyintesis EPA dan DHA dalam jumlah yang lebih banyak. Tujuan Tujuan dari penelitian ini adalah menentukan konsentrasi vektor ekspresi OmΔ6FAD yang menghasilkan viabilitas sperma tinggi, dan menghasilkan ikan lele transgenik generasi pertama (F0) melalui metode elektroporasi dan menganalisis kandungan asam lemak ikan transgenik F0.

19 3 2 TINJAUAN PUSTAKA Ikan Lele (Clarias gariepinus) Lele dumbo atau African catfish (Clarias gariepinus) merupakan hasil persilangan antara lele asli dari Taiwan dan lele yang berasal dari Afrika. Lele hasil persilangan ini diintroduksi ke Indonesia pertama kali pada tahun 1986 dari Taiwan. Seiring dengan perkembangan budidayanya, introduksi kemudian dilakukan kembali, baik untuk digunakan pada kegiatan produksi budidaya secara langsung maupun untuk tujuan perbaikan mutu genetik, yaitu berturut-turut pada tahun 2002 dan tahun 2008 dari Thailand, tahun 2005 dari Mesir dan tahun 2011 dari Kenya dan Belanda. Lele dumbo memiliki berbagai kelebihan, antara lain mudah dibudidayakan, dapat di pelihara dengan padat tebar yang tinggi, dalam lahan terbatas dan hemat air, pertumbuhan cepat, memiliki kemampuan beradaptasi terhadap lingkungan yang tinggi, rasanya enak, dan kandungan gizinya cukup tinggi (Khairuman dan Amir, 2002). Lele dumbo merupakan jenis ikan konsumsi yang memiliki nilai ekonomis yang tinggi di Indonesia. Produksi ikan lele meningkat dari ton pada tahun 2004 menjadi ton pada tahun 2014 dengan peningkatan rata-rata 29% per tahun dibanding dengan produksi ikan total sebesar 15% per tahun. Kontribusi produksi ikan lele terhadap produksi ikan nasional meningkat dari 5.3% pada tahun 2004 menjadi 15.8% pada tahun 2014 (FAO 2016). Transgenesis Melalui Metode Elektroporasi Teknologi transgenesis merupakan suatu teknik rekayasa genetik dengan cara mengintroduksi gen yang khas pada ikan untuk mendapatkan keunikan yang memiliki nilai tambah. Teknologi transfer gen telah dikembangkan untuk memperbaiki karakter kuantitatif dan kualitatif. Gen dari individu suatu spesies diisolasi, dihubungkan ke promoter (sebagai sekuens pengatur ekspresi gen), diklon dan diperbanyak dalam plasmid (Dunham, 2004). Penelitian awal pada transgenesis ikan pada saat ini berkembang pada banyak jenis ikan. Keunggulan teknologi transgenesis dibandingkan teknologi lainnya antara lain yaitu karakter yang diinginkan dapat ditransfer dalam satu generasi dan keunggulan yang didapatkan diturunkan pada generasi selanjutnya (Yaskowiak et al., 2006). Dalam usaha budidaya perikanan teknologi transgenik ini berguna untuk meningkatkan laju pertumbuhan ikan dan krustasea (Devlin et al., 1995), meningkatkan daya tahan terhadap penyakit (Dunham, 2004), mengurangi laju konsumsi oksigen pada ikan (Cook et al., 2000), serta untuk memproduksi protein farmaseutika/nutraseutika yang berguna bagi akuakultur dan kesehatan manusia (Kinoshita & Ozato, 1995; Fletcher & Davies, 1991; Collas et al., 2000). Sebagai contoh aplikasi teknologi transgenesis yang telah berhasil diantaranya adalah peningkatan daya tahan terhadap bakteri patogen dengan mengintroduksikan peptida cecropin-b pada channel catfish transgenik (Dunham, 2004), peningkatan laju pertumbuhan pada ikan salmon Pasifik (Devlin et al., 1995), ikan mud loach (Nam et al., 2001), dan ikan nila (Kobayashi et al., 2007)

20 4 Secara umum, proses produksi organisme transgenik terdiri dari beberapa tahapan, sebagai berikut: (1) identifikasi gen yang diinginkan (gen target), (2) isolasi gen target, (3) amplifikasi gen target untuk memproduksi beberapa copy, (4) penggabungan gen target dengan promoter yang tepat dan sekuens poliadenilasi serta insersi ke dalam plasmid, (5) multiplikasi plasmid dalam bakteri dan purifikasi konstruksi gen untuk injeksi, (6) transfer konstruksi gen ke dalam jaringan resipien, (7) screening keberhasilan integrasi gen eksogen ke dalam genom resipien, (8) analisis tingkat ekspresi transgen, dan (9) analisis pewarisan transgen pada generasi selanjutnya (Beardmore & Porter, 2003). Teknik transfer gen yang dapat diaplikasikan pada ikan ada beberapa metode antara lain mikroinjeksi, elektroporasi yang terdiri dari 2 cara yaitu elektroporasi pada embrio yang telah dibuahi dan elektroporasi pada sperma, penggunaan vektor retroviral atau infeksi retroviral, ballistic bombardment dan tranfeksi, inkubasi sperma dengan DNA (Hostetler et al., 2003; Dunham, 2004). Di antara metode-metode transfer gen tersebut, mikroinjeksi merupakan teknik yang paling banyak dipakai untuk memproduksi ikan transgenik. Metode ini telah sukses dilakukan untuk memproduksi ikan transgenik. Tetapi metode mikroinjeksi relatif sulit jika diterapkan untuk memproduksi ikan transgenik secara massal. Metode ini tidak hanya membutuhkan waktu pengerjaan yang relatif lama dan biaya laboratorium yang tinggi tetapi juga sangat dibatasi oleh jumlah telur dan fisiologi telur ikan. Nukleus dari telur ikan sangat kecil dan sukar untuk dilihat tanpa bantuana alat, membran telur atau khorion akan mengeras segera setelah pembuahan, mudah pecah, buram dan sebagainya (Lanes et al., 2009). Bagaimanapun juga, memproduksi hewan transgenik melalui mikroinjeksi tergolong relatif mahal dengan tingkat keberhasilan 1-4% (Anzar & Buhr, 2006). Transfeksi adalah metode transfer gen dengan reagen tertentu yang membungkus DNA sehingga dengan reagen tersebut memungkinkan DNA dapat masuk ke sel inang melalui dinding sel. Reagen yang digunakan dalam proses tranfeksi adalah dari bahan lipid. Keberhasilan metode tranfeksi telah dilaporkan oleh Parenrengi (2011) yaitu transfer gen ProAV-PmAV pada embrio udang windu (Penaeus monodon). Namun metode ini memiliki kelemahan yaitu berkaitan dengan tipe sel kultur yang digunakan, umumnya hanya satu jenis sel. Hal ini akan membatasi pengujian aktivitas hanya untuk regulator yang sesuai dengan sel tersebut, atau hanya untuk promoter yang bersifat ubiquitous (aktif di semua tipe jaringan) (Alimuddin, 2008). Metode transfer gen lainnya dapat dilakukan dengan menggunakan teknik elektroporasi (Dunham, 2004). Elektroporasi merupakan salah satu teknik aplikasi kejutan listrik pada suspensi sel yang mengakibatkan terjadinya polarisasi membran sel dan mengembangkan tegangan pada seluruh membran sel. Pada saat perbedaan potensial antara bagian dalam dan luar membran sel melewati titik kritis, komponen membran sel akan melakukan reorganisasi ke dalam pori dalam area terlokalisasi, sehingga membran sel menjadi permeabel terhadap masuknya makromolekul di sekitarnya (Knight, 1981). Perubahan permeabilitas tersebut bersifat sementara dan dengan syarat kejutan listrik tidak melebihi batas kritis bagi sel (Tsong, 1983). Dewi (2010) menyebutkan bahwa efisiensi transfer gen menggunakan elektroporasi dipengaruhi oleh kombinasi tingkat kuat medan listrik, jumlah kejutan listrik serta konsentrasi DNA yang akan diinsersikan. Metode elektroporasi dapat diaplikasikan pada transfer gen ikan dengan dua cara

21 yaitu elektroporasi pada embrio yang telah dibuahi (Inoue et al., 1990; Sheela et al., 1999) dan elektroporasi pada sperma (Symonds et al., 1994; Tsai, 2000). Menurut Tsai (2000) aplikasi elektroporasi dengan perantara sperma memiliki berbagai keuntungan antara lain : (1) Teknik ini merupakan teknik transfer gen secara massal; (2) Teknik ini mampu mengatasi beberapa kekurangan sistem transfer gen konvensional yang disebabkan karakter telur seperti warna yang kabur/buram, menempel, melayang, pronukleus yang tidak tampak, dan korion yang keras; (3) DNA asing harus ditransfer ke dalam nukleus, jika telur hasil fertilisasi dielektroporasi dengan DNA asing, fragmen DNA memiliki kesempatan yang lebih besar untuk ditransfer ke dalam beberapa tempat selain blastodisk karena volumenya sangat kecil dalam telur hasil fertilisasi; (4) sperma ikan mudah ditangani karena penambahan air secara sederhana mampu untuk mengaktifkan sperma; (5) Sperma dari hewan akuatik dapat dikriopreservasu sehingga sperma dapat selalu tersedia untuk digunakan. Menurut Symonds et al. (1994) bahwa jumlah DNA yang akan ditransfer ke dalam sperma tergantung pada tegangan listrik (kv/cm atau V/cm), jumlah kejutan yang dikenakan dan konsentrasi DNA. Selanjutnya, efisiensi transfer DNA ke embrio atau sperma yang dielektroporasi sangat dipengaruhi oleh tegangan dan lama kejutan. Asam Lemak Lipid adalah komponen integral dari jaringan organisme (hewan dan tumbuhan). Lipid merupakan konstituen terbanyak kedua setelah protein pada hampir semua organisme laut (Alasavar et al., 2011). Selain sebagai komponen struktur dari sel dan jaringan, lipid juga berfungsi sebagai sumber energi dan memberikan kemampuan mengapung bagi mamalia laut. Ikan anchovy, capelin, herring, mackerel, dan salmon menyimpan lemaknya pada otot dan kulit, sedangkan ikan yang rendah lemak (lean) seperti cod, halibut, dan hiu menyimpan sebagian besar lipid pada organ hatinya (Alberts et al., 2008). Beberapa mamalia laut memiliki lemak pada jaringan subkutan (Ehnholm 2009). Ikan diketahui kaya akan asam lemak tak jenuh rantai panjang, terutama EPA dan DHA (Loef & Walach, 2013). Beberapa studi menunjukkan bahwa komposisi asam lemak akan bervariasi berdasarkan pengaruh iklim, pakan, umur, kematangan gonad, dan spesies. Ikan yang berasal dari iklim tropis cenderung memiliki total lipid yang lebih rendah dibandingkan ikan dari wilayah subtropis. Lipid yang berasal dari ikan laut ditandai dengan kandungan asam linoleat (LA; C18:2n6) dan asam linolenat (LNA; C18:3n3) yang rendah, serta kandungan asam lemak tak jenuh jamak (PUFA) rantai panjang deret omega-3 yang tinggi (Scoditti et al., 2014). ekosapentanoat (EPA; C20:5n-3) dan asam dokosheksanoat (DHA; C22:6n-3) adalah asam lemak omega 3 dominan pada ikan laut. Apabila dibandingkan dengan ikan laut, ikan air tawar mengandung PUFA C:18 yang tinggi, sedangkan kandungan EPA dan DHA rendah (Kris-Etheron et al., 2000). Rasio dari total asam lemak omega 3 terhadap asam lemak omega 6 pada ikan laut lebih tinggi dibandingkan ikan air tawar. Variasi rasio asam lemak omega 3 terhadap asam lemak omega 6 pada ikan laut sekitar 5 hingga 10 (Machado et al., 2012). Komposisi asam lemak pada ikan laut dipengaruhi oleh makanan alaminya. 5

22 6 Plankton yang berasal dari laut mengandung asam lemak tak jenuh omega 6 yang rendah, namun memiliki kandungan EPA dan DHA yang dominan, sehingga hal tersebut berimplikasi pada tingginya kandungan asam lemak omega 3 pada ikan laut. Asam lemak omega 3 pada ikan laut dapat terkonsentrasi dengan adanya jaringan makanan. Asam lemak linoleat merupakan salah satu jenis asam lemak esensial. Asam lemak esensial diperlukan juga untuk membentuk asam lemak lain. Asam arakhidonat merupakan salah satu contoh proses elongasi dan desaturasi dari asam lemak linoleat, sedangkan EPA dan asam DHA dari asam lemak linolenat atau omega 3. Asam lemak ini bermanfaat jika tersedia dalam jumlah cukup. Kelebihan dosis akan membawa efek buruk diantaranya meningkatkan risiko kesehatan termasuk penyakit degeneratif, penyakit kardiovaskuler, kanker dan diabetes (Domenichiello et al., 2015). Gejala defisiensi asam lemak esensial adalah penyakit kulit, lemas, menurunnya imunitas, lemah, gangguan saluran cerna, sirkulasi jantung, gangguan pertumbuhan dan gangguan reproduksi (Ehnholm, 2009). Akibat yang lain adalah pemicu kanker payudara, kanker prostat, arthritis rheumatoid, arthritis, asma, preeklampsia, depresi, schizophrenia dan menurunnya konsentrasi dan hiperaktif (Yehuda et al., 2002). Sumber utama asam lemak linoleat selain dari minyak ikan air tawar seperti minyak ikan lele, juga berasal dari minyak nabati (minyak kacang kedelai, minyak jagung, minyak biji bunga matahari, dan lain-lain) (Aguilera et al., 2003). Ikan air tawar pada umumnya memiliki enzim desaturase dan elongase untuk biosintesis HUFA. Ketika diberi asam lemak linoleat (LA) dan asam lemak linolenat (LNA), ikan air tawar mampu memperbanyak ikatan ganda dan memperpanjang rantai C, masing-masing menjadi asam lemak arakidonat (ARA), atau asam EPA dan asam DHA (Sargent et al., 1999; Corraze, 2001; Sargent et al., 2002; Tocher 2003). Sintesis asam lemak tidak jenuh mengikuti deret asam lemak omega-3, omega-6, dan omega-9. Pada proses sintesis tersebut, enzim yang dilibatkan adalah enzim elongase dan desaturase. Asam lemak omega-3 dan omega-6 berkompetisi untuk enzim 6-desaturase (Schwingshackl & Huffmann, 2014). Jalur biosintesis asam lemak pada ikan lele (Oboh et al., 2016) dapat dilihat pada Gambar 1. Gambar Jalur biosintesis asam lemak pada ikan lele (Oboh et al., 2016)

23 Enzim delta6-desaturase endogenus bekerja bersama 5-desaturase dalam berbagai tahapan biosintesis asam lemak termasuk dalam menghasilkan EPA dan DHA. 3 METODE 7 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan November 2015 Oktober Penelitian dilakukan di Laboratorium Reproduksi dan Genetika Organisme Akuatik, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Perbanyakan Plasmid pmba-omδ6fad Konstruksi gen yang digunakan adalah berupa plasmid pmba-omδ6fad berisi gen OmΔ6FAD ikan salmon masu Oncorhynchus masou dengan promoter β-aktin (mba) dari ikan medaka (Oryzias latipes). Perbanyakan konstruksi gen dilakukan dengan menggunakan prosedur standar (Sambrook et al. 1989). Bakteri Escherichia coli yang mengandung plasmid mbp-omδ6fad diperbanyak dengan metode kultur cair. Bakteri dipanen dan dikultur dalam media cair yang mengandung triptone 1.6%, yeast extract 1%, NaCl 0,5% dan antibiotik ampisillin, diinkubasi menggunakan shaker dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 37 C, selama jam. Kemudian, bakteri dari hasil kultur dimasukkan ke dalam microtube 1.5 ml, disentrifugasi pada kecepatan rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang, pelet plasmid DNA yang terbentuk diisolasi menggunakan high-speed plasmid mini kit. Konsentrasi larutan DNA awal dihitung dengan menggunakan Genequant, kemudian dibuat konsentrasi larutan DNA untuk transfer gen sebesar 25, 50 dan 100 µg ml -1. Koleksi Gamet Induk jantan dan betina yang digunakan adalah induk ikan lele masingmasing berukuran 650 gram dan 800 gram. Induk dipilih berdasarkan tingkat kematangan gonadnya. Induk ikan lele jantan yang matang gonad kemudian disuntik menggunakan ovaprim untuk induksi ovulasi. Dosis yang digunakan adalah 0,1 ml kg -1 bobot ikan untuk induk ikan jantan, dan 0,3 ml kg -1 bobot ikan untuk induk ikan betina (Gusrina, 2011). Setelah 8 jam pascasuntik induk jantan dibedah untuk diambil testisnya dan dipotong-potong menggunakan gunting agar sperma keluar dari kantong testis, sedangkan pada induk betina dilakukan stripping untuk mendapatkan telur. Sperma diencerkan dengan larutan fisiologis (NaCl 0.9%) dengan perbandingan 1 : 1. Elektroporasi Sperma Elektroporasi sperma dilakukan dengan menggunakan mesin Gene Pulser Xcell (Biorad, USA). Sperma diencerkan dengan menggunakan larutan fisiologis

24 8 (1 : 1) sebelum dicampur dengan plasmid. Untuk mendapatkan kondisi elektroporasi yang optimal, maka dilakukan penelitian pendahuluan untuk mendapatkan kisaran kuat medan listrik yang mendukung motilitas dan kelangsungan hidup spermatozoa yang tinggi sehingga tetap memiliki kemampuan untuk membuahi sel telur. Konsentrasi DNA yang diuji yaitu 25, 50, dan 100 µg ml -1. Sperma tanpa perlakuan (STP) sebagai kontrol alat dan sperma tanpa DNA tetapi dielektroporasi (STD) sebagai kontrol DNA. Elektroporasi dilakukan dengan tipe kejutan square wave dengan kuvet yang digunakan 0,2 cm, kuat medan listrik 125 V cm -1, jumlah kejutan 5, panjang kejutan (pulse length) 30 milidetik serta interval kejutan (pulse interval) 0,1 detik (Gusrina, 2011). Jumlah DNA yang dicampurkan ke dalam sperma dihitung berdasarkan konsentrasi awal DNA. Volume total dari larutan sperma tersebut dicampur dengan plasmid dan larutan fisiologis sebanyak 500 mikroliter. Larutan sperma yang telah dielektroporasi tersebut kemudian digunakan untuk membuahi telur. Motilitas dan Kelangsungan Hidup Spermatozoa Kualitas sperma hasil elektroporasi diukur dengan menentukan derajat motilitasnya. Satu tetes sperma diteteskan dengan menggunakan mikropipet di atas gelas objek kemudian ditutup dengan gelas penutup. Pada tepi gelas penutup diteteskan akuades lalu dilihat pergerakan spermatozoa setelah terkena air di bawah mikroskop dengan pembesaran Penilaian motilitas didasarkan pada kriteria banyaknya sperma yang bergerak maju (progresif) dengan skoring berdasarkan Guest et al. (1976) (Tabel 1.) Tabel 1. Indeks motilitas spermatozoa (Guest et al., 1976) Kriteria Skor >70% spermatozoa bergerak cepat dengan arah maju dengan pergerakan ekor bervariasi. 5, % spermatozoa bergerak maju dan beberapa menunjukkan gerakan cepat. 4, % spermatozoa bergerak maju dan beberapa menunjukkan gerakan cepat. 3, % spermatozoa menunjukkan gerakan arah maju. 2, % spermatozoa menunjukkan gerakan arah maju. 1,0 1-10% spermatozoa bergerak maju, kebanyakan spermatozoa tidak bergerak. 0,5 Semua spermatozoa tidak bergerak. 0,0 Kuantitas sperma yang hidup setelah elektroporasi diamati melalui pewarnaan Giemsa (de la Cueva et al., 1997). Sperma diteteskan di atas gelas objek dan ditambahkan larutan Giemsa kemudian dicampur secara merata dan dibuat preparat ulas yang tipis. Preparat ulas dibiarkan kering udara. Preparat diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran dengan 3 bidang pandang. Spermatozoa yang hidup ditandai dengan kepala sperma yang berwarna merah muda dan berbentuk bulat, sedangkan kepala sperma yang mati berwarna hitam dan berbentuk tidak beraturan.

25 9 Pembuahan dan Penetasan Telur Sperma ikan lele dicampurkan dengan sel telur ikan lele betina yang diperoleh dari perbandingan 1 betina dan 1 jantan di wadah plastik, kemudian diaduk menggunakan bulu ayam. Campuran tersebut kemudian diinkubasi dalam akuarium berukuran 60 cm 40 cm 40 cm yang telah berisi air dan diberi methylene blue sebanyak 2 3 tetes untuk mencegah terbentuknya jamur pada telur yang telah dipijahkan, dan telah dilengkapi aerasi. Telur yang tidak terbuahi dapat dengan mudah dikenali dengan melihat penampakannya; telur yang terbuahi berwarna bening kekuningan, sedangkan telur yang tidak terbuahi berwarna putih. Derajat pembuahan telur dihitung 8 jam pascafertilisasi, derajat penetasan telur dihitung 24 jam pascafertilisasi, dan kelangsungan hidup ikan dihitung 14 hari pascafertilisasi. Pemeliharaan larva dilakukan dengan pemberian pakan alami berupa Artemia secara ad libitum yang dimulai pada hari ke-2 hingga ke-4 pascatetas. Pada hari ke-3 sampai akhir pemeliharaan ikan diberi pakan alami cacing sutra. Parameter Uji dan Analisis Data Motilitas Sperma Pengamatan motilitas sperma dilakukan di bawah mikroskop dengan perbesaran 40x10 dan dihitung berdasarkan persentase gerakan sperma yang aktif dengan sperma total. Keterangan : MS = Persentase sperma motil SM = Jumlah sperma motil TS = Jumlah sperma total Viabilitas Sperma Pengamatan viabilitas sperma (VS) dilakukan di bawah mikroskop dengan perbesaran 40x10 dan dihitung berdasarkan persentase sperma yang hidup dengan sperma total. Keterangan : VS = Persentase sperma hidup SH = Jumlah sperma hidup TS = Jumlah sperma total Derajat Pembuahan dan Penetasan Telur Derajat pembuahan (DPT) dan penetasan telur (PT) dihitung dengan metode sampling. Derajat pembuahan telur diamati pada 8 jam pascapembuahan. Telur

26 10 yang tidak terbuahi tampak berwarna putih buram, sementara telur yang terbuahi tampak bening (Effendie, 1997). DP dihitung dengan menggunakan rumus : Keterangan : DPT = Derajat pembuahan telur TT = Telur terbuahi TB = Total jumlah telur Derajat penetasan telur diamati 24 jam pascapembuahan. Derajat penetasan telur merupakan presentase jumlah perbandingan telur yang menetas dengan jumlah telur yang terbuahi (Effendie, 1997). Penetasan telur dihitung dengan rumus : Keterangan : PT = Persentase telur berhasil menetas TM = Jumlah telur menetas TB = jumlah telur terbuah Kelangsungan Hidup Larva Derajat kelangsungan hidup ikan adalah persentase jumlah larva yang hidup setelah menjadi larva (Effendie, 1997). Perhitungan dilakukan setelah ikan yang telah dipelihara berumur 14 hari, dengan rumus perhitungan sebagai berikut : Keterangan : KH = Kelangsungan hidup ikan IH = Jumlah ikan hidup saat pengamatan IA = Jumlah ikan awal Identifikasi Individu Ikan Membawa Transgen Individu ikan transgenik awal (F0) yang membawa gen OmΔ6FAD diidentifikasi menggunakan metode PCR dengan cetakan DNA genomik yang telah diekstraksi dari sirip ekor ikan pada umur 4 minggu pascatetas. Isolasi DNA genomik dilakukan menggunakan DNA Purification Kit (Puregene, Minneapolis, USA) dengan prosedur sesuai manual. PCR dilakukan menggunakan 1 set primer spesifik OmΔ6FAD yaitu forward Masou-F1 (5 - CCTGCGACCGTGTAGAGAGGG-3 ) dan reverse Masou-R1 (5 - AGAAGGCGAAGGTAGAAAGTCATCGC-3 ). Primer ini didesain berdasarkan sekuens Clarias gariepinus (Fads2) mrna (GeneBank akses no. KU ) dan Oncorhynchus masou mrna putative (GeneBank akses no. AB ).

27 Sebagai kontrol internal sampel diidentifikasi melalui metode PCR menggunakan 1 set primer β-aktin universal, yaitu forward β-aktin univ (5 - GACCTCACAGACTACCTCATG-3 ) dan reverse β-aktin univ (5 - TCATTGCCCA-TGGTCATGACC-3. Program PCR yang digunakan adalah denaturasi 94 o C selama 30 detik; annealing 62 o C pada primer masou-f1, dan 60 C pada primer β-aktin univ selama 30 detik; dan ekstensi 72 o C selama 30 detik. Jumlah siklus amplifikasi PCR adalah 35 siklus. Produk PCR diseparasi menggunakan elektroforesis dengan konsentrasi gel agarosa 1% (Vivantis, USA). Ikan transgenik yang membawa gen OmΔ6FAD ditandai dengan adanya pita DNA yang sejajar dengan kontrol positif yang berukuran 529 bp. Persentase individu ikan transgenik F0 dihitung menggunakan rumus : 11 TGOmΔ6FAD = 100 Analisis Profil Asam Lemak Analisis asam lemak dilakukan dengan metode kromatografi gas (GC). Persiapan sampel dilakukan secara berikut, sampel minyak diambil mg ditempatkan dalam tabung bertutup kemudian ditambahkan 2 ml NaOH 0,5M dalam metanol dan dipanaskan dalam penangas air selama 20 menit. Sampel didinginkan, kemudian ditambahkan 2 ml BF 3 14% dalam metanol, dipanaskan lagi selama 20 menit. Setelah dingin ditambahkan 2 ml NaCl jenuh, dihomogenasi dengan vortek selama 2 menit dan ditambahkan 10 ml n-heksan, dihomogenasi kembali kemudian didiamkan pada suhu ruang. Lapisan heksanmetil ester diambil, dipindahkan ke dalam labu ukur 10 ml, diencerkan dan dihimpitkan dengan n-heksan. Selanjutnya larutan diinjeksikan ke dalam kromatografi gas. Jenis asam lemak sampel ditentukan berdasarkan larutan standar. Analisis Data Parameter yang diamati meliputi viabilitas sperma, motilitas sperma, derajat pembuahan telur, derajat penetasan telur kelangsungan hidup larva dianalisis dengan one-way ANOVA, dilanjutkan dengan uji Post-Hoc Tukey (p=0,05) menggunakan program SPSS Statictic 16.0 (IBM, USA). Parameter berupa identifikasi individu dan persentase ikan membawa transgen, dan kadar asam lemak dianalisis secara deskriptif. 4 HASIL DAN PEMBAHASAN Indeks Motilitas dan Viabilitas Sperma Tingkat motilitas sperma setelah dielektroporasi ditunjukkan pada Tabel 2. Hasil penelitian menunjukkan perbedaan nyata antar perlakuan (p<0,05). Semakin rendah konsentrasi DNA yang digunakan, maka semakin rendah indeks motilitas sperma (Tabel 2). Indeks motilitas sperma perlakuan A50 sama dengan perlakuan

28 12 kontrol kecuali perlakuan A25. Perbedaan tersebut diduga terkait dengan perbedaan volume pelarut DNA yang digunakan. Sementara itu, viabilitas sperma sama pada semua perlakuan (Gambar 2). Dengan demikian, perbedaan konsentrasi DNA berbeda tidak mempengaruhi viabilitas sperma. Tabel 2. Indeks motilitas spermatozoa yang dielektroporasi dengan konsentrasi DNA berbeda (n=3) Perlakuan Indeks Motilitas (skor) A ±0.35 a A ±0.71 ab A ±0.71 b STP 2.50±0.71 ab STD 1.50±0.71 ab Keterangan : A25 = perlakuan dengan konsentrasi DNA 25 µg ml -1 ; A50 = perlakuan dengan konsentrasi DNA 50 µg ml -1 ; A100 = perlakuan dengan konsentrasi DNA 100 µg ml -1 ; STP = perlakuan kontrol tanpa elektroporasi; STD = perlakuan kontrol tanpa DNA tetapi dielektroporasi. Huruf superskrif yang sama menunjukkan hasil yang berbeda nyata (p<0.05). Skoring dilakukan berdasarkan Guest et al. (1976). vviabilitas (persen) a a A25 A50 A100 STP STD Gambar 1. Viabilitas sperma hasil elektroporasi dengan konsentrasi DNA berbeda A25 = perlakuan dengan konsentrasi DNA 25 µg ml -1 ; A50 = perlakuan dengan konsentrasi DNA 50 µg ml -1 ; A100 = perlakuan dengan konsentrasi DNA 100 µg ml -1 ; STP= perlakuan kontrol tanpa elektroporasi; STD = perlakuan kontrol tanpa DNA tetapi dielektroporasi. Huruf di atas bar yang sama menunjukkan hasil yang tidak berbeda nyata berdasarkan uji lanjut Tukey (p<0,05). Viabilitas sperma tetap tinggi karena pola elektroporasi yang digunakan adalah square wave, sehingga kemungkinan kerusakan pada sel sperma ikan lele lebih kecil. Hal ini didukung oleh pernyataan Chen et al. (2009) bahwa metode square wave dapat menghantarkan tegangan tinggi dalam gelombang yang pendek sehingga efek yang ditimbulkan lebih rendah. Selanjutnya transfer DNA dapat terjadi tanpa membunuh sel. Sperma yang baik akan membuahi sel telur dengan baik. Terjadinya perubahan pergerakan (motilitas) dan viabilitas sperma akan memperngaruhi kerja sperma. Menurut Hafez (1987), semen yang memenuhi a a a

29 syarat untuk proses pembuahan mengandung sperma yang hidup dan bergerak aktif ke depan (progresif). Persentase sperma yang motil tidak harus lebih dari 70% di mana dalam penggunaan sehari-hari tidak kurang dari 50%, meskipun beberapa peneliti menganjurkan 60% atau lebih. Selanjutnya, hasil PCR dengan DNA dari sperma yang telah dielektroporasi menunjukkan bahwa gen OmΔ6FAD dapat dideteksi pada perlakuan A100, ukurannya sejajar dengan kontrol plasmid K + (529 bp), sedangkan perlakuan A25 dan A50 tidak terdapat pita DNA (Gambar 3). Kontrol K- tidak ada pita DNA produk PCR, sehingga dapat dikatakan bahwa tidak ada kontaminasi dalam proses amplifikasi PCR. Oleh karena itu, perlakuan A100 dipilih untuk penelitian selanjutnya bp Gambar 2. Elektroforegram produk PCR menggunakan primer spesifik Om 6FAD.A25 = perlakuan dengan konsentrasi DNA 25 µg ml -1 ; A50 = perlakuan dengan konsentrasi DNA 50 µg ml -1 ; A100 = perlakuan dengan konsentrasi DNA 100 µg ml -1. Keterangan: M =DNA marker Kapa DNA ladder (USA); K - = produk PCR tanpa template DNA; K + = produk PCR dengan template plasmid mba- Om 6FAD. Parameter Reproduksi dan Kelangsungan Hidup Parameter reproduksi dan kelangsungan hidup ikan ditampilkan dalam Gambar 4. Hasil menunjukkan derajat pembuahan telur, derajat penetasan dan kelangsungan hidup ikan antar perlakuan tidak berbeda nyata (p>0,05). (persen) a a a a a a A100 STP STD Gambar 3. Derajat pembuahan telur (DPT), penetasan telur (PT) dan kelangsungan hidup larva (KL).A100= perlakuan dengan konsentrasi DNA 100 µg ml -1 ; STP = perlakuan kontrol tanpa elektroporasi; STD = perlakuan kontrol tanpa DNA tetapi dielektroporasi. Huruf di atas bar yang sama menunjukkan hasil yang tidak berbeda nyata berdasarkan uji lanjut Tukey (p<0,05). a a a DPT PT KI

30 14 Identifikasi Individu Ikan Membawa Transgen Hasil analisis PCR menggunakan primer spesifik Om 6FAD untuk mengindentifikasi ikan transgenik F0 disajikan pada Gambar 4. Seperti ditampilkan pada Gambar 4, tidak semua ikan perlakuan elektroporasi pada sampel ikan nomor 1 sampai 13 memiliki pita DNA yang berukuran sama dengan kontrol plasmid K + (529 bp). Dengan menggunakan primer β-aktin, semua sampel ikan uji mempunyai pita DNA produk PCR berukuran 300 bp, artinya tidak ada kesalahan dalam pengerjaan ekstraksi DNA dan PCR. Pada kontrol negatif (tanpa DNA template, K - ) tidak ada produk PCR, hal ini menunjukkan bahwa tidak ada kontaminasi dalam proses PCR. Selanjutnya, pada kontrol ikan non-transgenik (NT) tidak ada produk PCR, hal ini menunjukkan bahwa primer yang digunakan spesifik untuk gen Om 6FAD; tidak ada cross-annealing dengan DNA genom ikan lele. Dengan demikian sampel ikan perlakuan elektroporasi no. 2, 3, 5, 7, 9, 11 dan 13 adalah ikan transgenik F0 (Gambar 5). M NT K- K+ Om 6FAD 529 bp M NT K- β-aktin 300 bp Gambar 4. Elektroforegram produk PCR menggunakan primer spesifik Om 6FAD, dan β-aktin.keterangan: M = DNA marker Kapa DNA ladder (USA); nomor 1 s.d 13 adalah produk PCR dengan DNA dari sampel ikan uji. NT = produk PCR dengan template ikan nontransgenik; K - = produk PCR tanpa template DNA; K + = produk PCR dengan template plasmid mba-om 6FAD. Jumlah dan persentase ikan founder (F0) yang membawa gen OmΔ6FAD adalah 53,84%. Hal tersebut menunjukkan bahwa program elektroporasi dan konsentrasi vektor ekspresi hasil penelitian ini dapat digunakan untuk memproduksi ikan lele transgenik dengan gen yang lain. Selanjutnya, hasil persentase ikan founder (F0) lebih tinggi dibandingkan hasil penelitian sebelumnnya, di mana hasil transmisi ikan founder (F0) pada ikan zebra menggunakan gen penyandi delta-6 yaitu 44.1% (Alimuddin et al., 2005). Perbedaan tersebut diduga karena perbedaan metode dan spesies ikan uji. Alimuddin et al. (2005) menggunakan metode mikroinjeksi. Selain itu, Symonds et al. (1994) melaporkan bahwa efisiensi pengikatan DNA eksogen dengan menggunakan elektroporasi pada sperma ikan Chinook salmon ditentukan oleh kekuatan medan listrik, jumlah kejutan listrik dan konsentrasi DNA. Penelitian pada Chinook salmon menunjukkan bahwa sperma yang dikejutkan 1 kali dengan konsentrasi DNA 200 µg/ml mampu meningkatkan DNA eksogen yang ditransfer (20.8±12.8%), adapun bila dikejutkan 2 kali dengan konsentrasi DNA µg ml -1 tidak mempengaruhi efisiensi transfer gen (Sin et al., 2000).

31 15 Analisis Profil Asam Lemak Profil asam lemak pada ikan lele transgenik F0 dan non-transgenik serta pakan cacing sutra ditampilkan pada Tabel 3. Hasil menunjukkan bahwa kandungan EPA dan DHA ikan transgenik dan non-transgenik sama. Dengan demikian, belum terdeteksi adanya aktivitas enzim OmΔ6FAD pada ikan lele F0. Tabel 3. Profil asam lemak (%) ikan lele transgenik F0 dan non-transgenik serta cacing sutra. Profil asam lemak TG NTG Cacing sutra 18:2n-6 0,25 0,15 0,11 18:3n-3 0,02 0,01 0,01 20:2n-6 0,12 0,08 0,05 20:3n-6 0,04 0,03 0,02 20:4n-6 (ARA) 0,17 0,17 0,08 20:3n-3 0,01 0,01 0,002 20:5n-3 (EPA) 0,01 0,01 0,01 22:6n-3 (DHA) 0,03 0,05 Not detected Σ n-6 0,59 0,45 0,27 Σ n-3 0,08 0,08 0,03 Σ n-3 HUFA 0,06 0,07 0,02 Keterangan : TG = Ikan lele transgenik; NTG = Ikan lele non-trasngenik Kandungan asam lemak pada ikan lele F0 dan non-transgenik khususnya 18:2n-6, 20:4n-6 dan 20:3n-3 adalah lebih tinggi daripada yang terdapat pada cacing sutera (Tabel 2). Hal tersebut menunjukkan bahwa ikan lele mengakumulasi asam lemak tersebut dalam tubuhnya. Hal ini sesuai dengan Ackman (1982) yang menyatakan kandungan asam lemak pada ikan bukan merupakan hasil sintesis murni tubuh ikan, melainkan hasil akumulasi dari rantai makanan. Selanjutnya, ikan lele F0 dan non-transgenik DHA sedangkan cacing sutera tidak ada (Tabel 2). Hal tersebut menunjukkan bahwa ikan lele mampu menyintesis DHA. Menurut Tocher (2003) ikan air tawar pada umumnya mampu menyintesis HUFA seperti DHA, EPA dan asam arakidonat (ARA; 20:4n-6) dari asam lemak LNA dan asam lemak linoleat (LA; 18:2n-6) karena mempunyai semua enzim untuk biosintesis termasuk Δ6-desaturase dan/atau Δ5-desaturase, serta elongase. Tidak adanya perbedaan jumlah asam lemak ikan transgenik dan nontrasngenik dapat disebabkan oleh variasi ekspresi antarindividu dan ikan transgenik F0 yang masih bersifat mosaik yaitu tidak semua membawa transgen dalam jaringan tubuhnya (Chou et al., 2001). Secara umum analisis performa ikan transgenik dilakukan pada generasi F2. Oleh karena itu, riset selanjutnya perlu dilakukan untuk menentukan individu ikan transgenik F0 yang membawa transgen dalam gamet, yang akan digunakan untuk memproduksi generasi pertama (F1). Pada generasi F1, tingkat semua memiliki ekspresi dengan level yang sama, sehingga perlu dipilih individu yang memiliki ekspresi tinggi untuk digunakan memproduksi generasi kedua (F2). Dengan demikian, analisis