ISOLASI SENYAWA GOLONGAN FLAVONOID SEBAGAI ANTIOKSIDAN DARI DAUN DANDANG GENDIS (Clinacanthus nutans) SRI AGUSTINA

Transkripsi

1 ISOLASI SENYAWA GOLONGAN FLAVONOID SEBAGAI ANTIOKSIDAN DARI DAUN DANDANG GENDIS (Clinacanthus nutans) SRI AGUSTINA DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011

2 ABSTRAK SRI AGUSTINA. Isolasi Senyawa Golongan Flavonoid sebagai Antioksidan dari Daun Dandang Gendis (Clinacanthus nutans). Dibimbing oleh DUDI TOHIR dan GUSTINI SYAHBIRIN. Daun dandang gendis (Clinacanthus nutans) memiliki kemampuan antioksidan. Tujuan penelitian ini ialah memperoleh ekstrak flavonoid daun dandang gendis yang memberikan aktivitas antioksidan yang tinggi. Aktivitas antioksidan ditentukan menggunakan metode 1,1-difenil-2-pikril-hidrazil. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etilasetat memiliki aktivitas antioksidan dengan nilai IC 50 sebesar mg L -1. Ekstrak etilasetat kemudian difraksionasi menggunakan kromatografi lapis tipis preparatif dengan eluen n-butanol:asam asetat:air (4:1:5) dan menghasilkan 3 fraksi. Fraksi teraktif ialah fraksi 2 dengan nilai IC 50 sebesar mg L -1, tetapi lebih rendah dari butil hidroksi toluena (IC mg L -1 ). Uji golongan flavonoid menunjukkan bahwa senyawa pada fraksi 2 adalah flavonol dan flavon. Spektrum ultraviolet-tampak fraksi 2 dalam pelarut metanol menunjukkan serapan maksimum pita 1 pada 332 nm dan pita 2 pada 274 nm. Pergeseran batokromik pada pelarut MeOH+NaOMe dan MeOH+AlCl 3 -HCl mengindikasikan adanya substituen 4'-OH dan 5-OH. Adanya puncak baru dalam pita 2 pada nm menunjukkan adanya substituen 7-OH. ABSTRACT SRI AGUSTINA. Isolation of Flavonoids as Antioxidant from Dandang Gendis (Clinacanthus nutans) Leaves. Supervised by DUDI TOHIR and GUSTINI SYAHBIRIN. The leaves of dandang gendis (Clinacanthus nutans) exhibit antioxidant activity. The objective of this study is to investigate the highest antioxidant activity from flavonoid extract of the leaves. Antioxidant activities were determined by radical scavenging assay using 1,1-diphenyl-1-pycryl-hydrazyl radical. The result showed that ethyl acetate extract had antioxidant activity with IC 50 value of mg L -1. The ethyl acetate extract was fractionated further using preparative thin layer chromatography with eluent of n-buthanol:acetic acid: water (4:1:5) and produced 3 fractions. The most active fraction was fraction 2 with IC 50 value of mg L -1, which was lower than that of butylated hydroxy toluene (IC mg L -1 ). Flavonoid assay of fraction 2 showed that it contained flavonol and flavon. The ultraviolet-visible spectrum of fraction 2 in methanol solvent showed a maximum absorption at 332 in band 1 and 274 nm in band 2. In MeOH+MeONa and MeOH+AlCl 3 -HCl solvents there was a bathochromic shift, indicated the presence of 4'-OH and 5-OH. The new peak at nm showed the presence of 7-OH substituent.

3 ISOLASI SENYAWA GOLONGAN FLAVONOID SEBAGAI ANTIOKSIDAN DARI DAUN DANDANG GENDIS (Clinacanthus nutans) SRI AGUSTINA Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011

4 Judul : Isolasi Senyawa Golongan Flavonoid sebagai Antioksidan dari Daun Dandang Gendis (Clinacanthus nutans) Nama : Sri Agustina NIM : G Menyetujui Pembimbing I, Pembimbing II, Drs. Dudi Tohir, MS Dr. Gustini Syahbirin, MS NIP NIP Mengetahui Ketua Departemen, Prof. Dr. Ir. Tun Tedja Irawadi, MS NIP Tanggal lulus:

5 PRAKATA Puji dan syukur ke hadirat Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul Isolasi Senyawa Golongan Flavonoid Sebagai Antioksidan dari Daun Dadang Gendis (Clinacanthus nutans) yang dilaksanakan sejak bulan Juni 2010 di Laboratorium Kimia Organik Departemen Kimia FMIPA IPB. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Drs. Dudi Tohir, MS dan Dr. Gustini Syahbirin, MS selaku pembimbing yang telah memberikan pengarahan dan bimbingannya kepada penulis. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada orang tua, Bapak Ace Supriatin dan Ibu Suratmi atas didikan, doa, dan kasih sayangnya yang tiada terkira, serta untuk seluruh keluarga besar di rumah, terima kasih atas dukungan dan dorongannya. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Bapak Sabur, Mba Nia, Ibu Yeni Karmila, dan Ibu Siti Robiah, atas bantuan yang diberikan. Tak lupa, ungkapan terima kasih penulis kepada seluruh rekan peneliti di Laboratorium Kimia Organik (Wulan, Ela, Arif, Saki, Farid, Tifah, Dinda, Risal, Muti, Lia, Teh Dian, Kak Akbar), serta teman-teman Kimia 43 atas bantuan, motivasi, diskusi, dan kebersamaan selama penulis menempuh studi dan menjalankan penelitian. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat. Bogor, Februari 2011 Sri Agustina

6 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 17 Agustus 1988 dari Bapak Ace Supriatin dan Ibu Suratmi. Penulis merupakan anak kedua dari dua bersaudara. Penulis menyelesaikan studi di SMAN 3 Bogor pada tahun Pada tahun yang sama penulis diterima di Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Tahun 2007 penulis diterima pada Program Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Penulis pernah menjadi pengajar Kimia di bimbingan belajar Avogadro pada tahun 2008/2009 dan bimbingan belajar ERC pada tahun 2010, dan pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah Kimia Dasar pada tahun 2008/2009, Kimia Pangan D3 Analisis Kimia tahun 2010, Kimia Organik Layanan tahun 2008, Kimia Organik D3 Analisis Kimia tahun 2010, Praktikum Kimia Organik Berbasis Kompetensi tahun 2010, dan Kimia TPB Alih Tahun tahun Penulis juga berkesempatan melaksanakan kegiatan praktik lapangan di PT Novell Pharmaceutical Lab, Bogor pada tahun 2009.

7 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL... vi DAFTAR GAMBAR... vi DAFTAR LAMPIRAN... vii PENDAHULUAN... 1 TINJAUAN PUSTAKA Dandang Gendis... 1 Antioksidan... 2 Metode DPPH... 2 Flavonoid... 2 BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat... 3 Kadar Air... 3 Isolasi Flavonoid... 3 Uji Aktivitas Antioksidan... 3 Analisis Flavonoid... 3 Uji Fitokimia... 4 Uji Golongan Flavonoid... 4 HASIL DAN PEMBAHASAN Kadar air... 4 Isolasi Senyawa Golongan Flavonoid... 5 Uji Aktivitas Antioksidan... 5 Golongan Flavonoid Fraksi Aktif... 5 Uji Fitokimia dan Golongan Flavonoid... 7 SIMPULAN DAN SARAN... 8 Simpulan... 8 Saran... 8 DAFTAR PUSTAKA... 8 LAMPIRAN... 10

8 DAFTAR TABEL Halaman 1 Uji kualitatif golongan flavonoid Rentang serapan spektrum UV-tampak senyawa flavonoid Aktivitas antioksidan Uji fitokimia ekstrak etanol Uji golongan flavonoid ekstrak etanol, ekstrak etil asetat, dan F DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Daun dandang gendis Struktur DPPH: radikal bebas (a) bentuk tereduksi (b) Struktur flavonoid Noda pemisahan di bawah lampu UV 254 nm: KLT (a), KLT preparatif dengan eluen BAA (b) Spektrum F2 dalam pelarut metanol Spektrum F2 dengan penambahan pereaksi geser NaOCH 3 dan NaOCH 3 setelah 5 menit Spektrum F2 setelah penambahan pereaksi AlCl 3 dan AlCl 3 /HCl Spektrum F2 setelah penambahan pereaksi NaOMe, NaOMe 5 menit, dan H 3 BO Kromatogram 2 arah F2 dengan eluen BAA dan BEA Struktur senyawa flavonoid hipotesis F2... 8

9 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Diagram alir penelitian Kadar air serbuk daun dandang gendis Rendemen hasil ekstraksi Hasil uji aktivitas antioksidan Pergeseran panjang gelombang pada fraksi 2 setelah penambahan pereaksi geser... 17

10 PENDAHULUAN Negara Indonesia memiliki keanekaragaman hayati yang kaya. Sekitar spesies tumbuhan ditemukan di Indonesia dan 180 di antaranya berpotensi sebagai tanaman obat (Bermawi & Kristina 2003). Salah satu tanaman yang lazim digunakan sebagai obat tradisional adalah dandang gendis (Clinacanthus nutans). Dandang gendis merupakan tanaman semak belukar yang sering dijadikan tanaman pagar dan dikenal oleh masyarakat sebagai obat kencing manis, susah buang air kecil, dan disenteri. Beberapa penelitian yang telah dilakukan menunjukkan bahwa ekstrak dandang gendis berpotensi sebagai antikanker (Sofyan 2008), larvasida Aedes aegypti (Andriani 2008), antivirus Herpes simplex (Yoosook et al. 1999; Thongchai et al. 2008), dan antioksidan (Pannangpetch et al. 2007; Akbar 2010). Ekstraksi pendahuluan daun dandang gendis dengan berbagai pelarut menunjukkan kandungan alkaloid, flavonoid, dan terpenoid (Suharty 2004). Flavonoid yang terkandung dalam ekstrak daun dandang gendis dapat menghambat aktivitas radikal bebas. Radikal bebas diketahui memiliki reaktivitas yang tinggi sehingga dapat memicu reaksi berantai dalam sel. Hal ini dapat merusak sel dan akan menyebabkan munculnya berbagai penyakit seperti inflamasi, penyakit kardiovaskular, kanker, dan penuaan dini. Aktivitas radikal tersebut dapat dihambat oleh kerja antioksidan. Potensi ekstrak daun dandang gendis sebagai antioksidan telah diteliti oleh Akbar (2010) yang menunjukkan aktivitas antioksidan dengan nilai konsentrasi hambat 50% (IC 50 ) sebesar mg L -1. Ekstrak daun dandang gendis dapat berpotensi sebagai antioksidan karena mengandung senyawa flavonoid. Penelitian ini bertujuan mengisolasi senyawa flavonoid, uji aktivitas antioksidan, dan analisis senyawa golongan flavonoid yang terkandung dalam daun dandang gendis menggunakan spektrofotometer UV-tampak. TINJAUAN PUSTAKA Dandang Gendis Dandang gendis (Gambar 1) adalah tumbuhan semak belukar berbentuk perdu yang memiliki ciri fisik antara lain batang yang beruas, berwarna hijau, dan tegak dengan tinggi kurang lebih 2.5 m. Daunnya mempunyai bentuk tunggal dan berhadapan satu sama lain dengan panjang daun berkisar 8 12 cm, sedangkan lebar 4 6 cm. Daun tersebut berbentuk tulang menyirip dan berwarna hijau. Tanaman ini memiliki bunga yang tumbuh di ketiak daun dan di ujung batang. Mahkota daun berbentuk tabung dengan panjang 2 3 cm. Warnanya merah muda. Buah yang dihasilkan tanaman yang termasuk famili Acanthaceae ini berwarna cokelat dengan bentuk bulat memanjang (Kristio 2007). Gambar 1 Daun dandang gendis. Secara taksonomi dandang gendis diklasifikasikan dalam kerajaan Plantae, divisi Spermatophyta, sub divisi Angiospermae, famili Acanthaceae, genus Clinacanthus, dan spesies Clinacanthus nutans. Masyarakat Indonesia mengenal dandang gendis sebagai obat kencing manis (diabetes melitus), susah buang air kecil, dan disenteri. Selain itu, beberapa penelitian menunjukkan bahwa ekstrak daun dandang gendis berpotensi sebagai antioksidan (Pannangpetch et al. 2007; Akbar 2010), larvasida terhadap Aedes aegypti (Andriani 2008), antikanker (Sofyan 2008), dan antiradang (Wanikiat et al. 2008). Daun dandang gendis memiliki aktivitas antivirus yang tidak terlalu kuat terhadap HSV1 (Thongchai et al. 2008) dan HSV2 (Yoosook et al. 1999). Senyawa yang terkandung dalam daun dandang gendis di antaranya C-glikosilflavon, viteksin, isoviteksin, shaftosida, isomolupentin, 7-O-ß-glukopiranosida, orientin, 5 senyawa yang mengandung sulfur (Teshima et al. 1997), hidroksi-(13 2 -R)- faeofitin b, hidroksi-(13 2 -S)-faeofitin a, hidroksi-(13 2 -R)-faeofitin a (Sakdarat et al. 2009), serta campuran 9 serebrosida dan monoasilmonogalaktosilgliserol(tuntiwachutt tikul et al. 2004).

11 Antioksidan Antioksidan alami mampu melindungi tubuh terhadap kerusakan yang disebabkan oleh spesies oksigen reaktif, mampu menghambat terjadinya penyakit degeneratif, serta mampu menghambat peroksidase lipid pada makanan (Sunarni 2005). Senyawa flavonoid diketahui mampu berperan menangkap radikal bebas atau sebagai antioksidan alami (Amic et al. 2003). Aktivitas antioksidan dari suatu bahan alam dapat diuji dengan berbagai metode di antaranya kemampuan mereduksi ion feri (FRAP), 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), dan kapasitas mereduksi kupri (CUPRAC). Aktivitas antioksidan ekstrak daun dandang gendis dengan metode DPPH cukup kuat, yang ditunjukkan dengan nilai IC 50 sebesar µg ml -1 (Pannangpetch et al. 2007). Berdasarkan Akbar (2010), ekstrak teraktif daun dandang gendis berpotensi sebagai antioksidan dengan nilai IC 50 sebesar mg L -1. Nilai IC 50 yang kurang dari 200 ppm menunjukkan aktivitas antioksidan yang kuat (Hanani et al. 2005). akan ditangkap oleh senyawa flavonoid, dan flavonoid akan teroksidasi menghasilkan bentuk radikal yang lebih stabil, yaitu radikal dengan kereaktifan rendah. Flavonoid mendonorkan radikal hidrogen dari cincin aromatiknya untuk mengurangi radikal bebas yang bersifat toksik menghasilkan radikal flavonoid yang terstabilkan resonans dan membuatnya tidak toksik (Amic et al. 2003). Flavonoid Flavonoid merupakan salah satu metabolit sekunder. Keberadaannya dalam daun kemungkinan dipengaruhi oleh adanya proses fotosintesis sehingga daun muda belum terlalu banyak mengandung flavonoid (Markham 1988). Senyawa flavonoid mempunyai struktur C6-C3-C6. Tiap bagian C6 merupakan cincin benzena yang dihubungkan oleh atom C3 yang merupakan rantai alifatik, seperti ditunjukkan pada Gambar 3. Penggolongan jenis flavonoid didasarkan pada sifat kelarutan dan reaksi warna (Tabel 1). Metode DPPH Salah satu metode yang dapat menunjukkan aktivitas antioksidan dari senyawa alam adalah metode DPPH. 1,1- difenil-2-pikrilhidrazil (Gambar 2a) tergolong radikal bebas stabil. Delokalisasi elektron pada molekul DPPH akan memberikan warna ungu yang dicirikan dengan pita serapan pada 520 nm. Ketika DPPH ditambahkan ke dalam senyawa yang dapat memberikan atom hidrogen, DPPH akan berubah warna menjadi kuning muda, yakni warna bentuk tereduksinya, difenilpikrilhidrazin (Gambar 2b) (Molyneux 2004). (a) (b) Gambar 2 Struktur DPPH: radikal bebas (a) bentuk tereduksi (b). Salah satu senyawa yang dapat memberikan atom hidrogen kepada molekul DPPH adalah flavonoid. Radikal bebas DPPH Gambar 3 Struktur flavonoid. Tabel 1 Uji kualitatif golongan flavonoid (Harborne 1987) Pereaksi Golongan flavonoid Warna hasil reaksi CH 3 COONa Antosianidin Merah FeCl 3 Antosianidin Biru Na 2 CO 3 Antosianidin Ungu, biru, hijau CH 3 COOPb Kalkon Auron Flavon Jingga Merah Jingga NaOH 0,1 N H 2 SO 4 pekat Kalkon, auron Flavonol, flavon Flavon Flavonol Kalkon krem Merah ungu Kuning Kuning Kuning, Jingga krem Merah 2

12 Flavonoid mengandung sistem aromatik terkonjugasi dan karena itu, menunjukkan pita serapan kuat pada daerah spektrum UVtampak (Harborne 1987). Spektrum khas flavonoid terdiri atas dua panjang gelombang maksimum: nm (pita 2) dan nm (pita 1). Rentang serapan spektrum UVtampak senyawa flavonoid ditunjukkan pada Tabel 2 (Markham 1988). Tabel 2 Rentang serapan spektrum UVtampak senyawa flavonoid (Markham 1988) Pita 2 (nm) Pita 1 (nm) Jenis flavonoid Flavon Flavonol (3-OH tersubstitusi) Isoflavon (bahu) 320 Isoflavon (5-deoksi-6,7- dioksigenasi) (puncak) Flavanon dan dihidroflavonol Kalkon Auron Antosianidin dan antosianin BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan adalah serbuk daun dandang gendis dari daerah Batuhulung Bogor, etanol 70%, NH 4 OH, H 2 SO 4 2 M, FeCl 3 1%, metanol, etanol 98%, anhidrida asetat, amil alkohol, serbuk Mg, HCl pekat, HCl 2 N, CH 3 COONa, Na 2 CO 3, CH 3 COOPb, H 2 SO 4 pekat, Butil Hidroksi Toluena (BHT), n-heksana, etil asetat, DPPH, n-butanol, asam asetat, NaOCH 3, AlCl 3, H 3 BO 3, pereaksi Mayer, Wagner, DragendoRf, dan Lieberman-Buchard,. Alat-alat yang digunakan adalah peralatan kaca yang biasa digunakan di laboratorium, kromatografi lapis tipis preparatif (KLT preparatif), pelat KLT, penguap putar, dan spektrofotometer UV-1700 PharmaSpec. Kadar Air Diagram alir penelitian ditunjukkan pada Lampiran 1. Cawan porselen dikeringkan pada suhu 105 C selama 3 jam, kemudian didinginkan dalam eksikator dan ditimbang bobot keringnya. Serbuk dandang gendis ditimbang teliti sebanyak 3 g dalam cawan tersebut kemudian dipanaskan dalam oven pada suhu 105 C selama 3 jam. Setelah itu, didinginkan dan ditimbang. Pemanasan dan penimbangan dilakukan sampai bobotnya konstan. Isolasi Flavonoid (Markham 1988) Serbuk daun dandang gendis direndam dengan etanol 70% selama 24 jam pada suhu kamar. Ekstrak yang diperoleh disaring dan ampasnya direndam kembali dengan etanol 70%. Filtratnya dipekatkan dengan penguap putar. Ekstrak etanol daun dandang gendis dipartisi dengan n-heksana, kemudian dihidrolisis dengan HCl 2 N pada suhu 100 C selama 60 menit. Ekstrak daun dandang gendis terhidrolisis dipartisi dengan etil asetat. Fraksi etil asetat dikumpulkan dan dipekatkan dengan penguap putar, lalu difraksionasi dengan KLT preparatif. Eluen yang digunakan adalah campuran n-butanol: air:asam asetat (BAA) (4:5:1). Noda pemisahan dideteksi di bawah lampu UV 254 nm. Setiap fraksi dikerok, dilarutkan dengan etanol 70%, kemudian dipekatkan dan diuji aktivitas antioksidan. Fraksi teraktif dianalisis dengan spektrofotometer UV-tampak dan diuji kemurniannya menggunakan KLT dua dimensi dengan eluen BAA dan n-butanol: etanol:air (BEA) (4:1:2). Uji Aktivitas Antioksidan (Blois 1958) Larutan ekstrak dibuat dengan konsentrasi 10, 30, 50, dan 70 mg L -1. Sebanyak 4.5 ml larutan ekstrak dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 1.5 ml larutan DPPH 0.1 mm dalam etanol. Campuran diinkubasi pada suhu 37 C selama 30 menit, lalu diukur serapannya pada panjang gelombang 515 nm. BHT dengan konsentrasi 2, 4, 6, dan 8 mg L -1 digunakan sebagai kontrol positif. Kemudian nilai IC 50 dihitung menggunakan rumus persamaan regresi. Analisis Flavonoid (Markham 1988) Sebanyak 0.1 mg fraksi teraktif ekstrak daun dandang gendis dilarutkan dengan 10 ml metanol. Identifikasi flavonoid dengan spektrum UV-tampak dilakukan dengan menambahkan pereaksi geser AlCl 3, campuran AlCl 3 dengan HCl, CH 3 COONa, 3

13 campuran CH 3 COONa dengan H 3 BO 3, dan NaOCH 3. Data pergeseran pita serapan sebelum dan sesudah ditambahkan pereaksi geser menentukan jenis senyawa golongan flavonoid. Uji Fitokimia (Harborne 1987) Alkaloid Sebanyak 0.1 g ekstrak dilarutkan dalam 10 ml CHCl 3 dan 4 tetes NH 4 OH. Larutan disaring dan filtratnya dimasukkan ke dalam tabung reaksi tertutup. Ekstrak CHCl 3 dalam tabung reaksi dikocok dengan 10 tetes H 2 SO 4 2 M dan lapisan asamnya dipisahkan ke dalam tabung reaksi yang lain. Lapisan asam ini diteteskan pada lempeng tetes dan ditambahkan pereaksi Mayer, Wagner, dan DragendoRf yang akan menimbulkan endapan berturut-turut berwarna putih, cokelat, dan merah jingga jika terdapat alkaloid. Saponin Sebanyak 0.1 g ekstrak ditambahkan 10 ml air panas dan dididihkan selama 5 menit. Setelah itu, disaring dan filtratnya digunakan untuk pengujian. Filtrat dimasukkan ke dalam tabung reaksi tertutup kemudian dikocok selama 10 detik dan didiamkan selama 10 menit. Adanya saponin ditunjukkan dengan terbentuknya buih yang stabil. Triterpenoid dan Steroid Sebanyak 0,1 g ekstrak dilarutkan dengan 25 ml etanol panas (50 C). Larutan disaring dalam pinggan porselen dan diuapkan sampai kering. Residu ditambahkan eter dan ekstrak eter dipindahkan ke dalam lempeng tetes. Kemudian ditambahkan 3 tetes anhidrida asetat dan 1 tetes H 2 SO 4 pekat (uji Lieberman-Buchard). Warna merah atau ungu menunjukkan kandungan triterpenoid, sedangkan warna hijau atau biru menunjukkan kandungan steroid. Tanin Sebanyak 0.1 g ekstrak ditambahkan 10 ml air panas, dididihkan selama 5 menit, dan disaring. Sebagian filtrat yang diperoleh ditambahkan larutan FeCl 3 1%. Hasil positif ditunjukkan oleh warna hijau kehitaman. Flavonoid Sebanyak 0.1 g ekstrak ditambahkan 10 ml air panas dan dididihkan selama 5 menit. Setelah itu, disaring dan filtratnya digunakan untuk pengujian. Filtrat dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan 0.5 g serbuk Mg, 1 ml HCl pekat, dan 1 ml amil alkohol, dan dikocok kuat. Uji positif flavonoid menghasilkan warna kuning atau jingga pada lapisan amilalkohol. Uji Golongan Flavonoid (Harborne 1987) Sebanyak 0.5 g ekstrak dilarutkan dengan 10 ml metanol-hcl 1 N (1:1) dan dipanaskan pada suhu 95 C selama 1 jam. Setelah itu, didinginkan dan disaring, lalu filtratnya diekstraksi dengan etil asetat. Antosianidin Sebanyak 1 ml ekstrak etil asetat ditambahkan 3 tetes CH 3 COONa lalu diamati, kemudian ditambahkan 3 tetes FeCl 3 dan diamati lagi. Antosianidin dengan CH 3 COONa memberikan warna merah atau ungu dan bila ditambahkan FeCl 3 menjadi biru. Sebanyak 1 ml ekstrak etil asetat ditambahkan Na 2 CO 3 lalu diamati. Antosianidin memberikan warna ungu, biru, atau hijau. Flavon, Kalkon, Auron, dan Flavonol Sebanyak 1 ml ekstrak etil asetat ditambahkan 3 tetes CH 3 COOPb lalu diamati warnanya. Flavon memberikan warna jingga hingga krem, kalkon memberikan warna jingga tua, dan auron memberikan warna merah. Sebanyak 1 ml ekstrak etil asetat ditambah 3 tetes NaOH 0,1 N lalu diamati warnanya. Flavon memberikan warna kuning, flavonol memberikan warna kuning, jingga hingga krem, dan kalkon memberikan warna krem hingga merah tua. HASIL DAN PEMBAHASAN Kadar Air Penentuan kadar air dilakukan dengan metode gravimetri evolusi tidak langsung. Bobot air dihitung setelah proses pengeringan dengan suhu 105 C pada periode waktu tertentu sampai diperoleh bobot yang konstan. Menurut Harjadi (1993), air yang terikat secara fisik dapat dihilangkan dengan pemanasan pada suhu C. Salah satu kegunaan penentuan kadar air adalah untuk mengetahui ketahanan suatu bahan dalam penyimpanan. 4

14 Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah serbuk daun dandang gendis. Kadar airnya diperoleh sebesar 9.74% (Lampiran 2). Menurut Winarno (1997), sampel dapat disimpan dalam jangka waktu lama jika memiliki kadar air di bawah 10%. Nilai kadar air yang diperoleh kurang dari 10%. Hal ini menunjukkan bahwa sampel memiliki masa simpan yang relatif lama. F3 R f 0.85 F2 R f 0.52 F1 R f 0.25 Isolasi Senyawa Golongan Flavonoid (a) (b) Tahap pertama dalam isolasi senyawa golongan flavonoid adalah maserasi sampel dengan pelarut etanol 70%. Etanol 70% digunakan karena flavonoid bersifat polar, dengan sejumlah gugus hidroksil, baik yang terikat ataupun yang tidak terikat gula (Markham 1988). Selain itu, berdasarkan Macari et al. (2006), aktivitas antioksidan tanaman obat dalam etanol 70% lebih tinggi dibandingkan dengan beberapa pelarut lainnya. Maserasi dilakukan berulang kali sampai filtrat tidak berwarna hijau lagi, sehingga dapat dianggap semua senyawa yang berbobot molekul rendah telah terekstraksi (Harborne 1987). Filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan penguap putar sehingga diperoleh ekstrak kasar etanol. Rendemen yang dihasilkan dari g serbuk daun dandang gendis yang dimaserasi adalah % (Lampiran 3). Ekstrak daun dandang gendis kemudian dipartisi cair-cair menggunakan pelarut n- heksana untuk menghilangkan kandungan lemak. Tahapan selanjutnya adalah hidrolisisasam terhadap ekstrak bebas-lemak. Hidrolisis bertujuan memutus gula dari aglikon flavonoid. Hasil hidrolisis kemudian dipartisi dengan etil asetat untuk memisahkan aglikon flavonoid dengan gulanya. Aglikon flavonoid akan berada dalam fraksi etil asetat dan gula dalam fraksi air (Markham 1988). Pemisahan aglikon flavonoid dilakukan dengan KLT preparatif menggunakan eluen BAA dengan nisbah 4:1:5 (Markham 1988). Noda pemisahan diamati di bawah lampu UV 254 nm, dan diperoleh 3 noda (Gambar 4). Nilai Rf untuk fraksi 1, 2, dan 3 berturutturut adalah 0.25, 0.52, dan Setiap fraksi dikerok, kemudian dilarutkan dengan etanol hingga jumlah setiap fraksi mencukupi untuk analisis kualitatif, uji aktivitas antioksidan, dan analisis senyawa golongan flavonoid. Gambar 4 Noda pemisahan di bawah lampu UV 254 nm: KLT (a), KLT preparatif dengan eluen BAA (b). Uji Aktivitas Antioksidan Uji aktivitas antioksidan ekstrak etil asetat dan ketiga fraksi hasil KLT preparatif dilakukan dengan metode DPPH (Lampiran 4). Metode ini dipilih karena mudah digunakan, cepat, dan cukup teliti (Prakash 2001). Aktivitas antioksidan metode DPPH dinyatakan dengan nilai IC 50, yakni konsentrasi sampel yang mampu menghambat aktivitas DPPH sebesar 50%. Ekstrak etil asetat memiliki aktivitas antioksidan dengan nilai IC 50 sebesar mg L -1. Fraksi 2 (F2) hasil KLT preparatif menunjukkan nilai IC 50 yang paling kecil, yakni mg L -1. Semakin kecil nilai IC 50, semakin tinggi pula aktivitas antioksidan (Molyneux 2004). Fraksi 1 (F1) dan fraksi 3 (F3) memiliki aktivitas antioksidan yang kecil. Nilai IC 50 cukup besar yakni mg L -1 dan mg L -1. Menurut Hanani et al. (2005), suatu senyawa dikatakan memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi jika memiliki nilai IC 50 kurang dari 200 mg L - 1. Namun, jika dibandingkan dengan BHT sebagai kontrol positif, aktivitas antioksidan F2 masih lebih rendah. Nilai IC 50 untuk BHT sebesar mg L -1 (Tabel 3). Tabel 3 Aktivitas antioksidan Larutan uji IC 50 (mg L -1 ) BHT Ekstrak etil asetat F F F Golongan Flavonoid Fraksi Aktif Analisis F2 sebagai fraksi teraktif dari ekstrak daun dandang gendis dilakukan 5

15 dengan merekam spektrum UV-tampak. Identifikasi senyawa golongan flavonoid didasarkan pada perubahan panjang gelombang setelah ditambahkan pereaksi geser (Lampiran 5). Spektrum UV-tampak F2 dalam pelarut metanol (Gambar 5) menunjukkan serapan maksimum pita 1 pada panjang gelombang 332 nm dan pita 2 pada panjang gelombang 274 nm. A b s o r b a n s A b s o r b a n s Panjang gelombang (nm) Gambar 5 Spektrum F2 dalam pelarut metanol. Berdasarkan puncak serapan pada pita 1 dan 2, F2 diduga merupakan senyawa flavonoid golongan flavon atau flavonol. Menurut Markham (1988), flavon dan flavonol memiliki serapan maksimum pita 2 di nm. Sementara untuk pita 1, flavon memiliki serapan maksimum pada nm dan flavonol pada nm. Pita 1 berasal dari cincin B dan C, dan pita 2 berasal dari konjugasi pada cincin A. Penambahan pereaksi geser NaOCH 3 pada F2 menyebabkan pergeseran batokromik sebesar 64 nm pada pita 1 (Gambar 6). Markham (1988) melaporkan bahwa pergeseran serapan maksimum sebesar nm dengan kekuatan serapan yang tidak menurun menunjukkan adanya gugus hidroksil di C-4'. Karena itu, dapat disimpulkan bahwa senyawa flavonoid pada F2 memiliki gugus hidroksil pada C-4'. Selain itu, terbentuk pita baru pada nm yang menunjukkan adanya gugus hidroksil di posisi C-7. Menurut Markham (1988), pita serapan baru pada nm muncul jika terdapat gugus hidroksil pada C-7. NaOCH 3 NaOCH 3 setelah 5 menit Gambar 6 Spektrum F2 dengan penambahan pereaksi geser NaOCH 3 dan NaOCH 3 setelah 5 menit. Tidak terdapatnya gugus hidroksil di C-3 ditunjukkan dengan tidak adanya pergeseran batokromik pada pita 1 sejauh nm (Markham 1988) pada spektrum AlCl 3 /HCl (Gambar 7). Tidak adanya gugus hidroksil pada C-3 manunjukkan bahwa F2 merupakan senyawa flavonoid golongan flavon. Pergeseran batokromik sejauh 17 nm pada pita 1 menunjukkan adanya gugus hidroksil di posisi C-5. Penambahan AlCl 3 akan membentuk kompleks dengan gugus hidroksil di C-5 dan gugus karbonil sehingga terjadi geseran batokromik. Tidak terbentuknya kompleks antara AlCl 3 dengan gugus o- dihidroksi pada cincin B menyebabkan tidak teramati geseran hipsokromik yang diakibatkan penguraian kompleks tersebut ketika ditambahkan HCl (Markham 1988). A b s o r b a n s Panjang gelombang (nm) Panjang gelombang (nm) AlCl 3 AlCl 3/HCl Gambar 7 Spektrum F2 setelah penambahan pereaksi AlCl 3 dan AlCl 3 /HCl. 6

16 Penambahan pereaksi CH 3 COONa menyebabkan pergeseran batokromik sejauh 8.5 nm (Gambar 8) pada pita 2 yang menunjukkan adanya gugus hidroksil di C-7. Berdasarkan Markham (1988), intensitas yang tidak menurun menunjukkan tidak adanya gugus yang peka terhadap basa, seperti 6,7- dioh; 7,8-diOH dan 3',4'-diOH. Pada spektrum dengan penambahan H 3 BO 3 (Gambar 8), tidak terjadi pergeseran batokromik yang menunjukkan tidak adanya gugus o-dioh pada cincin A dan B. Pergeseran batokromik sejauh 12 sampai 36 nm pada pita 1 akan terjadi jika ada gugus tersebut (Markham 1988). A b s o r b a n s CH 3COONa CH 3COONa 5 menit H 3BO 3 Panjang gelombang (nm) Gambar 8 Spektrum F2 setelah penambahan pereaksi NaOMe, NaOMe 5 menit, dan H 3 BO 3. KLT 2 arah dilakukan untuk menguji tingkat kemurnian F2. Dibandingkan dengan KLT 2 arah yang dilakukan Akbar (2010) yang menunjukkan dua berkas noda, hasil KLT 2 arah dengan eluen BAA dan BEA (Gambar 9) lebih baik karena hanya menunjukkan satu noda tunggal. Karena itu, dapat ditarik simpulan bahwa F2 merupakan senyawa flavonoid golongan flavon. Eluen 1 BAA Eluen 2 BEA Gambar 9 Kromatogram 2 arah F2 dengan eluen BAA dan BEA. Uji Fitokimia dan Golongan Flavonoid Uji fitokimia dilakukan terhadap ekstrak etanol (Tabel 4), sedangkan uji golongan flavonoid dilakukan terhadap ekstrak etanol, ekstrak etil asetat, dan F2 (Tabel 5). Tabel 4 Uji fitokimia ekstrak etanol Golongan senyawa Hasil uji Alkaloid +++ Saponin + Flavonoid +++ Steroid + Triterpenoid - Tanin - Keterangan: (+) menunjukkan intensitas warna, (-) menunjukkan tidak terdapat senyawa tersebut dalam ekstrak etanol. Tabel 5 Uji golongan flavonoid ekstrak etanol, etil asetat dan F2 Pereaksi Etanol Ekstrak Etil asetat Keterangan : (-) Tidak terdeteksi adanya senyawa golongan flavonoid. Hasil uji fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat, dan F2 menunjukkan ekstrak etanol daun dandang gendis senyawa flavon atau flavonol. Berdasarkan mengandung senyawa tanin, steroid, hasil identifikasi dengan sinar UV-tampak, flavonoid, dan saponin (Tabel 4). Uji dapat disimpulkan bahwa senyawa aktif golongan flavonoid terhadap ekstrak etanol, antioksidan yang terkandung dalam daun F2 Golongan flavonoid CH 3 COOPb Krem Krem Krem Flavon NaOH 0,1 N Kuning Kuning Kuning Flavon, flavonol H 2 SO 4 Cokelat Kuning Jingga - kecokelatan CH 3 COONa Jingga Kuning Kuning - CH 3 COONa+FeCl 3 Cokelat Cokelat Cokelat - Na 2 CO 3 Jingga Kuning Kuning - 7

17 dandang gendis adalah flavon dengan gugus hidroksil yang terletak pada C-4', C-5, dan C- 7 (Gambar 10). HO Gambar 10 OH O O OH Struktur senyawa flavonoid hipotesis F2. SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Ekstrak etil asetat daun dandang gendis memiliki aktivitas antioksidan. Fraksi 2 menunjukkan aktivitas antioksidan tertinggi dibandingkan dengan 2 fraksi lainnya dengan nilai IC 50 sebesar mg L -1. Hasil uji golongan flavonoid, dan spektrum UVtampak memperlihatkan bahwa fraksi 2 dihipotesiskan adalah senyawa flavonoid golongan flavon dengan gugus hidroksil yang terletak pada C-4', C-5, dan C-7. Saran Perlu diadakan analisis lebih lanjut dengan spektrometer inframerah, resonans magnetik inti 1 H, 13 C, dan spektrometer massa untuk mengidentifikasi senyawa pasti dalam fraksi 2. DAFTAR PUSTAKA Akbar HR Isolasi dan identifikasi golongan flavonoid daun dandang gendis (Clinachantus nutans) berpotensi sebagai antioksidan [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Amic D, Beslo D, Trinajstic N, Davidovic Structure-radical scavenging activity relationship of flavonoids. Croatia Chem Acta 76: Andriani A Uji potensi larvasida fraksi ekstrak daun dandang gendis terhadap larva instar III nyamuk Aedes aegypti [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Bermawi N, Kristina NN Penyimpanan in vitro tanaman obat potensial. Perkembangan Teknol TRO 15: Blois MS Antioxidant determinations by the use of stable free radical. Nature 181: Harborne JB Metode Fitokimia. Padmawinata K, Soediro I, penerjemah; Niksolihin S, editor. Bandung: ITB. Terjemahan dari: Phytochemical Methods. Hanani E, Abdul M, Ryany S Identifikasi senyawa antioksidan dalam Callyspongia sp dari Kepulauan Seribu. Maj Ilmu Kefarmasian 2: Harjadi W Ilmu Kimia Analitik Dasar. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama. Kristio Tanaman obat Indonesia. toiusd. Multiply. com/ journal? &page_start=160. [23 Mar 2010] Macari PdAT, Portela CN, Polhit AM Antioxidant, cytotoxic, and UVBabsorbing activity of Maynetus guyanensis Klotzch (Celastraceae) bark extract. Acta Amazonica 36: Markham KR Cara Mengidentifikasi Flavonoid. Padmawinata K, penerjemah. Bandung: ITB. Terjemahan dari: Techniques of Flavonoid of Identification. Molyneux P The use of stable free radical diphenylpicryl-hydrazyl (DPPH) for estimazing antioxidant activity. Songklanakarin J Sci Technol 26: Pannangpetch et al Antioxidant activity and protective effect against oxidative hemolysis of Clinachantus nutans (Burm.f) Lindau. Songklanakarin J Sci Technol 29:1-9. Prakash A Antioxidant activity. Medallion Laboratories Analytical Progress 19(2). 8

18 Sakdarat S, Shuyprom A, Pientong C, Ekalaksananan T, Thongcai S Bioactive constituent from the leaves of Clinachantus nutans Lindau. Bioanorg Med Chem 17: Sofyan D Inhibisi fraksi aktif daun dandang gendis (Clinachantus nutans) pada pertumbuhan Saccharomyes cerevisiae sebagai uji potensi antikanker [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Suharty NS Isolasi terpenoid dari daun Clinachantus nutans. http: //digilib. itb.ac.id/go.php?id= jbptitbpp-gdl-s nengsrisuh-1734 & width=300. [23 Mar 2010] Sunarni T Aktivitas antioksidan penangkap radikal bebas beberapa kecambah dari biji tanaman familia Papilionaceae. J Farm Indones 2: Teshima I et al Sulfur-containing glucosides from Clinacanthus nutans. Phytochemistry 48: Thongcai S et al Anti-herpes simplex virus type 1 activity of crude ethyl acetate extract derived from leaves of Clinacanthus nutans Lindau. J Sci Technol 27: Tuntiwachwuttikul P, Pootaeng-on Y, Phansa P, Taylor WS Cerebrosides and a monoacylmonogalactosylglycerol from Clinachanthus nutans. Chem Pharm Bull 52: Wanikiat et al The anti-inflammatory effects and the inhibition of neutrophil responsiveness by Barleria lupulina and Clinachantus nutans extract. J Ethnopharmacology 116: Winarno FG Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia. Yoosook C, Panpisutchai Y, Chaichana S, Santisuk T, Reutrakul V Evaluation of anti-hsv-2 activities of Barleria lupulina and Clinacanthus nutans. J Ethnopharmacol 67:

19 LAMPIRAN 11

20 Lampiran 1 Diagram alir penelitian Serbuk daun dandang gendis Penetapan kadar air Ekstraksi dengan etanol 70% Residu Ekstrak etanol Partisi dengan n-heksana Fraksi n-heksana Fraksi etanol Hidrolisis HCl Fraksi etanol terhidrolisis Partisi dengan etil asetat Uji golongan flavonoid dan antioksidan Fraksionasi (KLTp) Fraksi etil asetat Fraksi etanol Fraksi 1 Fraksi 2 Fraksi 3 Uji antioksidan Fraksi teraktif Analisis flavonoid dengan Spektrofotometer UV-tampak Senyawa golongan flavonoid 11

21 Lampiran 2 Kadar air serbuk daun dandang gendis Bobot (g) Ulangan Pinggan kosong Contoh Contoh kering + pinggan Contoh kering Kadar air (%) Kadar air rerata (%) 9.74 Contoh perhitungan: = 9.69 % Lampiran 3 Rendemen hasil ekstraksi Bobot serbuk daun dandang gendis (W contoh) = g Bobot ekstrak (W ekstrak) = g Kadar air = 9.74 % Contoh perhitungan : = 31.24% 13 12

22 Lampiran 4 Hasil uji aktivitas antioksidan a) Ekstrak etil asetat Konsentrasi (mg L -1 ) ln Konsentrasi Inhibisi (%) y = x = x x = IC 50 = antiln (5.1840) IC 50 = mg L -1 Kurva uji aktivitas antioksidan ekstrak etil asetat b) Fraksi 1 Konsentrasi (mg L -1 ) ln Konsentrasi Inhibisi (%) y = x = x = x x = IC 50 = antiln ( ) IC 50 = mg L -1 13

23 Lanjutan Lampiran 4 Hasil uji aktivitas antioksidan Kurva uji aktivitas antioksidan fraksi 1 c) Fraksi 2 Konsentrasi (mg L -1 ) ln Konsentrasi Inhibisi (%) y = x = x x = IC 50 = antiln (3.9690) IC 50 = mg L -1 Kurva uji antioksidan fraksi

24 Lanjutan Lampiran 4 Hasil uji aktivitas antioksidan d) Fraksi 3 Konsentrasi (mg L -1 ) ln Konsentrasi Inhibisi (%) y = x = x x = IC 50 = antiln (9.1298) IC 50 = ppm Kurva uji aktivitas antioksidan fraksi 3 e) BHT Konsentrasi (mg L -1 ) ln Konsentrasi Inhibisi (%) y = x = x x = IC 50 = antiln (2.8158) IC 50 = mg L

25 Lanjutan Lampiran 4 Hasil uji aktivitas antioksidan Kurva uji aktivitas antioksidan BHT 16 13

26 Lampiran 5 Pergeseran panjang gelombang pada fraksi 2 setelah penambahan pereaksi geser Pereaksi geser Panjang gelombang serapan (nm) Pergeseran serapan (nm) Pita 1 Pita 2 Pita 1 Pita 2 Dugaan substitusi gugus hidroksil Fraksi NaOCH C-4' NaOCH (5 menit) AlCl C-5 AlCl 3 +HCl CH 3 COONa C-7 CH 3 COONa (5 menit) CH 3 COONa +H 3 BO