LAPORAN PRAKTIKUM KULTUR JARINGAN TANAMAN "PEMBUATAN LARUTAN STOK DAN MEDIA MS (Murashige & Skoog )"

Transkripsi

1 LAPORAN PRAKTIKUM KULTUR JARINGAN TANAMAN "PEMBUATAN LARUTAN STOK DAN MEDIA MS (Murashige & Skoog )" NOPITA SARI D1A AGRONOMI H FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS JAMBI 2014

2 BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Kultur jaringan tanaman adalah suatu teknik isolasi bagian-bagian tanaman, seperti jaringan, organ, ataupun embrio, lalu dikultur pada medium buatan yang steril sehingga bagian-bagian tanaman tersebut mampu beregenerasi dan berdiferensisi menjadi tanaman lengkap. Keberhasilan budidaya jaringan tanaman sangat dipengaruhi oleh media tanamnya. Selain sebagai tempat tumbuh, media tanam merupakan penyedia unsur hara dan zat-zat lain yang diperlukan eksplan untuk tumbuh. Seperti halnya dengan tanaman utuh, jaringan tanaman juga memerlukan unsur hara makro dan unsur hara mikro. Karena yang ditanam adalah sepotong kecil jaringan atau sekelompok sel, media tanam haruslah dapat menyediakan bahan-bahan lain yang dapat mendukung pertumbuhan dan perkembangan jaringan tanaman sehingga tanaman dapat melakukan regenerasi. Hasil yang lebih baik dapat dijangkau atau diperoleh, bila ke dalam media tersebut ditambahkan vitamin-vitamin, asam amino solid dan zat pengatur tubuh. Walaupun sudah diusahakan untuk menghindarkan penggunaan komponen-komponen yang tidak jelas (komponennya) seperti juice buah-buahan dan tauge, air kelapa, yeast exstracts dan casein hydrolysate, tetapi kadang-kadang kita bisa memperoleh hasil yang lebih tinggi dengan penambahan tersebut. Sebagai contoh, air kelapa masih sering digunakan di laboratorium-laboratorium penelitian, sedangkan pisang masih merupakan komponen tambahan yang sangat popular pada media anggrek. Media kultur jaringan merupakan salah satu faktor yang dapat menentukan tingkat keberhasilan perbanyakan tanaman secara invitro, dalam hal ini adalah kultur jaringan. Berbagai formulasi atau komposisi media tanam telah banyak ditemukan untuk mmengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman yang dikulturkan. Media biakan adalah bahan atau campuran bahan yang dapat digunakan untuk membiakkan mikroorganisme karena memiliki daya dukung yang tinggi terhadap pertumbuhan dan perkembangbiakannya. Dalam media semi sintetik selain bahan hasil pertanian, digunakan pula zat-zat kimia yang komposisinya diketahui dengan tepat.

3 Berdasarkan hal tersebut di atas, maka perlu diadakan praktikum mengenai cara pembuatan media kultur jaringan. Hal ini dimaksudkan agar segala hal yang diketahui tentang kultur jaringan bukan hanya sekedar mengetahui tentang adanya kultur jaringan, tetapi dapat membuat bibit tanaman melalui kultur jaringan. Agar semua yang diketahui tentang kultur jaringan bukan sekedar teori, tetapi dapat diaplikasikan dalam praktikum untuk dijadikan pengabdian kepada masyarakat. 1.2 Tujuan Praktikum Tujuan dari praktikum pembuatan media kultur jaringan ini yaitu untuk mengetahui sifat dan komposisi pembuatan media, untuk mengetahui teknik aseptic pembuatan media, untuk mengetahui dan memahami rumus perhitungan larutan stok dan mengetahui cara pembuatan larutan stok dan media tanam dari stok-stok bahan kimia terutama untuk media MS. Adapun kegunaannya yaitu sebagai bahan informasi bagi mahasiswa khususnya mengenai pembuatan media kultur jaringan.

4 BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Media Tanaman Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan. Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf (Suryowinoto, 1991). Sebelum membuat media, terlebih dahulu dilakukan pembuatan larutan stok. Larutan stok dibuat dengan tujuan untuk memudahkan pengambilan bahan-bahan kimia khususnya yang dibutuhkan dalam jumlah kecil, tak perlu sering menimbang karena hal ini kurang praktis. Larutan stok disimpan di dalam lemari pendingin agar tidak mudah rusak dan mencegah terdegradasinya bahan-bahan kimia oleh mikroba penyebab kontaminasi. Pembuatan larutan stok harus dilakukan dengan cermat, sebab larutan stok yang terlalu pekat akan mengalami pengendapan di lemari es, dan larutan stok yang terkontaminasi tidak boleh digunakan lagi (Anonim 2, 2012). Dalam kultur jaringan, unsur-unsur diberikan tidak dalam bentuk unsur murni, tetapi berupa senyawa berbentuk garam. Sebelum dicampurkan kedalam media tumbuh, garam-garam mineral itu haruslah lebih dahulu dilarutkan dalam konsentrasi tertentu, sehingga dalam media tumbuh nantinya jumlah tiap gram benar sesuai dengan ketentuan sebagai pelarut dipakai akuades (Yuwono, 2008). Untuk memenuhi faktor pertumbuhan tanaman, media kultur jaringan yang baik mengandung (Anonim, 2011) : 1. Hara anorganik Ada 12 hara mineral yang penting untuk pertumbuhan tanaman dan beberapa hara yang dilaporkan mempengaruhi pertumbuhan in vitro. Untuk pertumbuhan

5 normal dalam kultur jaringan, unsur unsur penting ini harus dimasukkan dalam media kultur. 2. Hara organik Tanaman yang tumbuh dalam kondisi normal bersifat autotrof dan dapat mensintesa semua kebutuhan bahan organiknya. Meskipun tanaman in vitro dapat mensintesa senyawa ini, diperkirakan mereka tidak menghasilkan vitamin dalam jumlah yang cukup untuk pertumbuhan yang sehat dan satu atau lebih vitamin mesti ditambahkan ke media. Thiamin merupakan vitamin yang penting, selain itu asam nikotin, piridoksin dan inositol biasanya ditambahkan. Selain bahan organik tersebut, bahan kompleks seringkali ditambahkan, termasuk ekstrak ragi, casein hydrolysate, air kelapa, jus jeruk, jaringan pisang, dan lain lain. Penambahan bahan kompleks ini menghasilkan media yang tak terdefinisi. Dengan penelitian yang cukup, semestinya bahan kompleks ini dapat diganti dengan zat tertentu, mungkin tambahan suatu vitamin atau asam amino. 3. Sumber karbon Tanaman dalam kultur jaringan tumbuh secara heterotrof dan karena mereka tidak cukup mensintesa kebutuhan karbonnya, maka sukrosa harus ditambahkan ke dalam media. Sumber karbon ini menyediakan energi bagi pertumbuhan tanaman dan juga sebagai bahan pembangun untuk memproduksi molekul yang lebih besar yang diperlukan untuk tumbuh. Biasanya sukrosa pada konsentrasi 1 5% digunakan sebagai sumber karbon tapi sumber karbon lain seperti glukosa, maltosa, galaktosa dan laktosa juga digunakan. Ketika sukrosa diautoklaf, terjadi hidrolisis untuk menghasilkan glukosa dan fruktosa yang dapat digunakan lebih efisien oleh tanaman dalam kultur. 4. Agar Umumnya jaringan dikulturkan pada media padat yang dibuat seperti gel dengan menggunakan agar atau pengganti agar sperti Gelrite atau Phytagel.Konsentrasi agar yang digunakan berkisar antara %. Pada konsentrasi tinggi agar menjadi sangat keras, sedikit sekali air yang tersedia, sehingga difusi hara ke tanaman sangat buruk. Agar dengan kualitas tinggi seperti Difco BiTek mahal harganya tapi lebih murni, tidak mengandung bahan lain yang mungkin mengganggu pertumbuhan. 5. ph

6 Media biasanya diatur pada kisaran tapi tanaman yang berbeda mungkin memerlukan ph yang berbeda untuk pertumbuhan optimum. Jika ph lebih tinggi dari 6.0, media mungkin menjadi terlalu keras dan jika ph kurang dari 5.2, agar tidak dapat memadat. 6. Zat Pengatur Tumbuh Pada media umumnya ditambahkan zat pengatur tumbuh. 7. Air Distilata biasanya digunakan dalam kultur jaringan, dan banyak lab menggunakan aquabides (air destilata ganda). Beberapa lab, dengan alasan ekonomi, menggunakan air hujan, tapi ini menyebabkan sulit mengontrol kandungan bahan organik dan non-organik pada media. 8. Pemilihan Media Jika tidak ada informasi awal, biasanya mulai dengan media MS (Murashige dan Skoog 1962). Media ini mengandung konsentrasi garam dan nitrat yang lebih tinggi dibandingkan media lain, dan telah sukses digunakan pada berbagai tanaman dikotil. Untuk inisiasi kalus, 2.4-D ditambahkan ke media dengan konsentrasi 1 5 mgl -1. Untuk multiplikasi tunas, sitokinin seperti BAP ditambahkan dan juga diberi auksin, seperti NAA pada konsentrasi yang rendah.untuk inisiasi akar, IBA pada konsentrasi 1 2 mgl-1 ditambahkan. Komponen media kultur yang lengkap adalah sebagai berikut : 1. Air destilasi (aquades) atau air bebas ion sebagai pelarut atau solvent 2. Hara-hara makro dan ikro 3. Gula (umumnya sukrosa) sebagai sumber energi 4. Vitamin, asam amino dan bahan organic lain 5. Zat pengatur tumbuh 6. Suplemen berupa bahan-bahan alami 7. Agar-agar atau gelrite sebagai pemadat media 2.2 Jenis-jenis Media Menurut Suryowinoto (1991), adapun jenis-jenis media kultur jaringan adalah sebagai berikut : a) Media Knop

7 Dapat juga digunakan untuk menumbuhkan kalus wortel. Kultur kalus, biasanya ditumbuhkan pada media dengan kosentrasi garam-garam yang rendah seperti dalam kultur akar dengan penambahan suplemen seperti glucosa, gelatine, thiamine, cysteine-hcl dan IAA. b) Media White Dikembangkan oleh Hildebrant untuk keperluan kultur jaringan tumor bunga matahari, ditemukan bahwa unsur makro yang dibutuhkan kultur tersebut, lebih tinggi dari pada yang dibutuhkan oleh kultur tembakau. Unsur F, Ca, Hg dan S pada media untuk tumor bunga matahari ini, sama dengan media untuk jaringan normal yang dikembangkan kemudian. Konsentrasi NO3- dan K+ yang digunakan Hildebrant ini lebih tinggi dari media white, tetapi masih lebih rendah dari pada media-media lain yang umum digunakan sekarang. c) Media Knudson dan media Vacin and Went Media ini dikembangkan khusus untuk kultur anggrek. Tanaman yang ditanam di kebun dapat tumbuh dengan baik dengan pemupukan yang hanya mengandung N dari Nitrat. Knudson pada tahun 1922, menemukan penambahan 7.6 mm NH4+ disamping 8.5 mm NO3-, sangat baik untuk perkencambahan dan pertumbuhan biji anggrek. Penambahan NH4+ ternyata dibutuhkan untuk perkembangan protocorm. Media Nitsch & Nitsch, menggunakan NO3- dan K+ dengan kadar yang cukup tinggi untuk mengkulturkan jaringan tanaman artichoke Jerussalem. Penambahan ammonium khlorida sebanyak 0.1 mm, menghasilkan pertumbuhan jaringan yang menurun. Pertumbuhan sel dari jaringan suatu organ dibandingkan dengan jaringan tumor tanaman Venca rosea (Catharanthus roseus), menunjukkan bahwa penambahan ammonium ke dalam media White yang sudah dimodifikasi, mempunyai pertumbuhan yang lebih baik. Konsentrasi NO3-, NH4-, K+ dan H2PO4- yang diperoleh, hampir sama dengan yang dikembangkan oleh Miller. d) Media Murashige & Skoog (media MS) Merupakan perbaikan komposisi media Skoog, terutama kebutuhan garam anorganik yang mendukung pertumbuhan optimum pada kultur jaringan tembakau. Media MS mengandung 40 mm N dalam bentuk NO3 dan 29 mm N dalam bentuk NH4+. Kandungan N ini, lima kali lebih tinggi dari N total yang terdapat pada media

8 Miller, 15 kali lebih tinggi dari media tembakau Hildebrant, dan 19 kali lebih tinggi dari media White. Kalium juga ditingkatkan sampai 20 mm, sedangkan P, 1.25 mm. Unsur makro lainnya konsentrasinya dinaikkan sedikit. Pertama kali unsur-unsur makro dalam media MS dibuat untuk kultur kalus tembakau, tetapi komposisi MS ini sudah umum digunakan untuk kultur jaringan jenis tanaman lain. Media MS paling banyak digunakan untuk berbagai tujuan kultur pada tahun-tahun sesudah penemuan media MS, sehingga dikembangkan media-media lain berdasarkan media MS tersebut, antara lain media : 1. Lin & Staba, menggunakan media dengan setengah dari komposisi unsur makro MS, dan memodifikasi : 9 mm ammonium nitrat yang seharusnya 10mM, sedangkan KH2 PO4 yang dikurangi menjadi 0.5 Mm, tidak mm. Larutan senyawa makro dari media Lin & Staba, kemudian digunakan oleh Halperin untuk penelitian embryogenesis kultur jaringan wortel dan juga digunakan oleh Bourgin & Nitsch (1967 dalam Gunawan 1988) dalam penelitian kultur anther. 2. Modifikasi media MS yang lain dibuat oleh Durzan et ali (1973 dalam Gunawan 1988) untuk kultur suspensi sel white spruce dengan cara mengurangi konsentrasi K+ dan NO3-, dan menambah konsentrasi Ca2+ nya. 3. Chaturvedi et al (1978) mengubah media MS dengan menurunkan konsentrasi NO3-, K+, Ca2+, Mg2+ dan SO4-2 untuk keperluan kultur pucuk Bougainvillea glabra. Senyawa-senyawa di dalam media MS dapat terjadi pengendapan persenyawaan, ini terlihat jelas pada media cair. Kebanyakan dari persenyawaan yang mengendap adalah fosfat dan besi, kemudian dalam jumlah yang lebih sedikit adalah Ca, K, N, Zn dan Mn. Senyawa paling sedikit adalah senyawa yang mengandung unsur C, Mg, H, Si, Mo, S, Ca dan Co. Setelah tujuh hari dibiarkan, maka kira-kira 50% dari Fe dan 13% dari PO4+, mengendap (Dalton et al, 1983). Pengendapan unsur-unsur tersebut mungkin tidak penting, karena unsur-unsur tersebut masih tersedia bagi jaringan tanaman dan pengaruh pengendapannya belum diketahui. Untuk mengatasi pengendapan Fe, Dalton dan grupnya menganjurkan supaya konsentrasi Fe dikurangi sampai 1/3 dengan EDTA yang tetap. e) Media Gamborg B5 (media B5)

9 Pertama kali dikembangkan untuk kultur kalus kedelai dengan konsentrasi nitrat dan amonium lebih rendah dibandingkan media MS. Untuk selanjutnya media B5 dikembangkan untuk kultur kalus dan suspensi, serta sangat baik sebagai media dasar untuk meregenerasi seluruh bagian tanaman.. Pada masa ini media B5 juga digunakan untuk kultur-kultur lain. Media ini dikembangkan dari komposisi PRL-4, media ini menggunakan konsentrasi NH4+ yang rendah, karena konsentrasi yang lebih tinggi dari 2 mm menghambat pertumbuhan sel kedelai. Fosfat yang diberikan setelah 1 mm, Ca2+ antara 1-4 mm, sedangkan Mg2+ antara mm (Gamborg et al, 1968). f) Media Schenk & Hildebrant (media SH) Merupakan media yang juga cukup terkenal, untuk kultur kalus tanaman monokotil dan dikotil. Konsentrasi ion-ion dalam komposisi media SH sangat mirip dengan komposisi pada media Gamborg dengan perbedaan kecil yaitu level Ca2+, Mg2+, dan PO4-3 yang lebih tinggi. Schenk & Hildebrant mempelajari pertumbuhan jaringan dari 37 jenis tanaman dalam media SH dan mendapatkan bahwa: 32 % dari spesies yang dicobakan, tumbuh dengan sangat baik, 19% baik, 30% sedang, 14% kurang baik, dan 5% buruk pertumbuhannya. Tetapi karena zat tumbuh yang diberikan pada tiap jenis tanaman tersebut berbeda. Media SH ini cukup luas penggunaannya, terutama untuk tanaman legume. g) Media WPM (Woody Plant Medium) Yang dikembangkan oleh Lioyd & Mc Coen pada tahun 1981, merupakan media dengan konsentrasi ion yang lebih rendah dari media MS. Media diperuntukkan khusus tanaman berkayu, dan dikembangkan oleh ahli lain, tetapi sulfat yang digunakan lebih tinggi dari sulfat pada media WPM. Saat ini WPM banyak digunakan untuk perbanyakan tanaman hias berperawakan perdu dan pohon-pohon. h) Media N6 Media N6 mempunyai ciri perbandingan NH₄+ dan NO₃ yang jauh perbandinganya. Amonium yang diberikan dalam bentuk (NH₄)SO₄ hanya sebanyak 363 mg/l, sedangkan KNO₃ 2830 mg/l. Seperti halnya peralatan kultur, media yang digunakan juga perlu dilakukan sterilisasi untuk menciptakan kondisi lingkungan yang aseptic bagi eksplan. Untuk media kultur

10 yang tidak mengandung bahan-bahan yang Heat-labile, sterilisasi dilakukan dengan autoklaf pada temperature 121Oc, tekanan antara 15 psi atau 1 atm dengan waktu antara menit tergantung dari volume wadah dan volume media. Untuk ml media dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran ml, sterilisasi dilakukan pada tekanan 15 psi dengan waktu 20 menit. Untuk 20 botol volume 1 liter membutuhkan waktu yang lebih lama yaitu 34 menit, 10 botol volume 2 liter memerlukan waktu 37 menit, 5 botol 4 liter waktu yang digunakan 52 menit. Dengan waktu yang lebih lama. Dalam sterilisasi aquadest dan media, setelah waktu sterilisasi yang diinginkan sudah tercapai, autoklaf tidak boleh diturunkan tekanannya secara mendadak. Bila tekanan diturunkan mendadak, cairan didalamnya mendidih dan meluap (bubbled up). Untuk bahan-bahan yang heat-labile dalam bentuk larutan, sterilisasi dilakukan dengan menyaring larutan melalui filter yang mempunyai ukuran pori um. Diameter filter yang bermacam-macam tergantung dari volume larutan yang ingin disterilkan. Untuk volume larutan 10 ml, dipergunakan filter yang dipasang di ujung jarum suntik. Bahan yang heat labile antara lain : GA3, Thiamin-HCL, Ca-panthothenate, Antibiotik: carbenocilin (Anonimous, 2009).

11 BAB III METODOLOGI PRAKTIKUM 3.1 Waktu dan Tempat Praktikum Pembuatan Media ini dilaksanakan pada hari Jum'at tanggal 7 November 2014 pukul WIB dan bertempat di Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman Fakultas Pertanian Universitas Jambi. 3.2 Alat dan Bahan Adapun alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah gelas ukur, gelas piala (ukuran 2 L), timbangan digital, hot plate dan termometernya, stirer, ph meter, corong, botol kultur, karet dan plastik, dan pipet tetes. Bahan-bahan yang diperlukan dan digunakan dalam praktikum pembuatan media yaitu berupa bahan media MS yang isinya berupa : 1. Unsur hara makro : KNO 3 = 712,500 mg/l NH 4 NO 3 = 618,750 mg/l CaCl 2.2H 2 O = 165,000 mg/l MgSO 4.7H 2 O = 138,750 mg/l KH 2 PO 4 = 63,750 mg/l 2. Unsur hara mikro : MnSO 4.4H 2 O = 8,363 mg/l ZnSO 4.7H 2 O = 3,225 mg/l KI = 0,311 mg/l Na 2 MoO 4.2 H 2 O = 0,094 mg/l CuSO 4.5H 2 O = 0,009 mg/l 3. Besi FeSO4.7H2O = 10,425 mg/l Na 2 -EDTA.2H 2 O = 13,975 mg/l 4. Vitamin Mio-inositol = 37,500 mg/l Thiamin HCl = 0,045 mg/l

12 Piridoksin HCl = 0,195 mg/l Glisin = 0,045 mg/l 5. ZPT Sitokinin = 1 mg/l Auksin = 1 mg/l 6. Bahan pemadat (agar) = 10,5 g/l 7. Sukrosa = 45 g/l 8. KOH atau NaOH = 1 M 9. HCl = 1 M 3.3 Prosedur Kerja 1. Pembuatan larutan stok a. Larutan stok A, merupakan larutan unsur hara makro 1. Menimbang pesenyawaan NH 4 NO 3 sebanyak 20,625 gr 2. Memasukan bahan yang telah ditimbang tersebut ke dalam gelas piala bersih yang telah berisi aquades atau air bebas ion kurang lebih 250 ml. Selanjutnya melakukan pengadukan hingga larut merata dengan menggunakan hotplate, jika berhasil larutan berwarna bening 3. Memindahkan larutan tersebut ke dalam botol dan ditutup dengan plastik dan diikat dengan karet serta diberi label "A". Selanjutnya menyimpan larutan stok ke dalam ruangan pendingin. b. Larutan stok B KNO 3 (23,750 gr) c. Larutan stok C merupakan campuran KH 2 PO 4 (8,500 gr), H 3 BO 3 (0,310 gr), Kl (0,042 gr), Na 2 MoO 4. 2H 2 O (0,013 gr) dan CoCl 2. 6H 2 O (0,001 gr) d. Larutan stok D merupakan CaCl 2. 2H 2 O (22,000 gr) e. Larutan stok E merupakan campuran MgSO 4. 7H 2 O (18,500 gr), MnSO 4. 4H 2 O (1,115 gr), ZnSO 4. 4H 2 O (0,430 gr) dan CuSO 4. 5H 2 O (0,001 gr) f. Larutan Stok F merupakan campuran Na 2 EDTA (1,865 gr) dan FeSO 4. 7H 2 O (1,390 gr) ** Untuk langkah kerja larutan stok B, C, D, E dan F hampir sama dengan larutan stok A hanya berbeda dijumlah senyawa dan pemberian nama label.

13 2. Pembuatan Medium Kultur a. Menimbang sukrosa (gulaku) sebanyak 45 gr dan agar-agar sebanyak 10,5 gr b. Menyiapkan gelas piala berukuran 2000 ml (2 liter) lalu dimasukkan vitamin (15 ml), sukrosa (45 gr) dan agar-agar (10,5 gr) serta larutan A (30 ml), larutan B (30 ml), larutan C (7,5 ml), larutan D (7,5 ml), larutan E (7,5ml) dan Larutan F (7,5 ml) c. Menambahkan aquades ke dalam gelas piala hingga mencapai volume 1500 ml (dilebihkan sedikit untuk mengantisipasi larutan yang menguap) d. Menghomogenkan larutan hingga merata dengan menggunakan Hot Plate dan Magnetik stirrer dan ditunggu hingga mendidih kemudian diukur ph nya. ph larutan diukur menggunakan ph meter elektrik hingga mencapai ph yang dibutuhkan yaitu 5,7 5,8. Jika terlalu asam tambahkan NaOH atau KOH 1 M, dan jika terlalu basa tambahkan HCl 1 M. e. Medium yang telah mendidih tersebut dituangkan ke dalam botol-botol kultur. f. Botol kultur ditutup menggunakan plastik dan karet yang telah disterilkan dan disimpan di ruang kultur. Sterilisasi Media a. Botol kultur yang sudah berisi medium dimasukkan ke dalam autoclave dengan tekanan 15-17,5 psi pada suhu 120 o C selama 20 menit, sampai tiga kali. b. Botol diangkat dan disimpan dalam ruang inkubasi sampai siap digunakan. c. Medium siap digunakan.

14 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil Praktikum a. Pembuatan Larutan Stok Komposisi Medium Murashige dan Skoog (MS) (1962) pada ph 5,6-5,8 Pemakaian Stok Senyawa per liter stok Stok per liter medium A NH 4 NO 3 20,625 gr 30,0 ml 618,750 mg B KNO 3 23,750 gr 30,0 ml 712,500 mg C KH 2 PO 4 8,500 gr 7,5 ml 63,750 mg H 3 BO 3 0,310 gr 2,325 mg Kl 0,042 gr 0,311 mg Na 2 MoO 4. 2H 2 O 0,013 gr 0,094 mg CoCl 2. 6H 2 O 0,001 gr 0,009 mg D CaCl 2. 2H 2 O 22,000 gr 7,5 ml 165,000 mg E MgSO 4. 7H 2 O 18,500 gr 7,5 ml 138,750 mg MnSO 4. 4H 2 O 1,115 gr 8,363 mg ZnSO 4. 4H 2 O 0,430 gr 3,225 mg CuSO 4. 5H 2 O 0,001 gr 0,009 mg F Na 2 EDTA 1,865 gr 7,5 ml 13,975 mg FeSO 4. 7H 2 O 1,390 gr 10,425 mg Myo-inositol 2,500 gr 15,0 ml 37,500 mg Glisin 0,050 gr 0,750 mg Niasin 0,013 gr 0,195 mg Piridoksin-HCl 0,013 gr 0,195 mg Tiamin-HCl 0,003 gr 0,045 mg Sukrosa 45,000 mg Agar - agar 10,500 mg

15 No. Gambar 1. Keterangan Proses pembuatan larutan stok 2. Larutan stok yang telah selesai dan harus disimpan di tempat yang dingin (kulkas) b. Pembuatan Media MS No. Gambar 1. Keterangan Penimbangan sukrosa (gula) sebanyak 45 gram

16 2. Penimbangan agar-agar sebanyak 10,5 gram 3. Memasukkan agar-agar (10,5 gr), sukrosa (45 gr), vitamin 15 ml, larutan stok A, B, C, D, E dan F ke dalam gelas piala ukuran 2 liter lalu ditambahkan aquades hingga mencapai 1500 ml 4. Media yang telah mendidih (berwarna bening) dan selanjutnya dipindahkan ke botol-botol kultur

17 5. Media yang telah dipindahkan ke botol-botol kultur dan ditutup rapat dengan plastik dan karet lalu disimpan atau disusun di ruang kultur 4.2 Pembahasan a. Pembuatan Larutan Stok Media merupakan suatu bahan yang penting untuk pertumbuhan kultur. Media untuk pertumbuhan kultur dapat berupa media padat dan media cair. Media padat biasanya digunakan untuk mengkulturkan kalus kemudian diinduksi menjadi tanaman lengkap, sedangkan media cair biasanya digunakan untuk kultur sel. Komponen yang penting dalam suatu media adalah senyawa anorganik, sumber karbon, vitamin, zat pengatur tumbuh, dan suplemen organik (Yuwono 2008). Larutan Stok Media merupakan tempat tumbuhnya tanaman. Semua kebutuhan yang diperlukan oleh tanaman untuk tumbuh dan berkembang harus terkandung dalam media tersebut. Dalam media kultur jaringan (kuljar) telah tersedia unr makro, unsur mikro, vitamin, hormon (zat perangsang tumbuh) dan lain-lain. Formula ini memang memudahkan pekerjaan, tapi untuk suatu penelitian yang memerlukan perubahan komposisi dalam satu atau beberapa komponen, maka pemisahan komponen-komponen penyusun media perlu dilakukan. Secara umum kebutuhan nutrisi setiap tanaman sama, tetapi secara khusus kebutuhanya berbeda. Kesamaanya adalah tanaman memerlukan hara makro dan mikro, vitamin-vitamin, karbohidrat, asam amino dan N-organik, ZPT, zat pemadat dan kadang ada penambahan seperti air kelapa, ekstrak ragi, jus tomat, ekstak kentang, bufer organik maupun arang aktif. Kebutuhan tiap tanaman berbeda pada hal komposisi dan jumlah yang diperlukan.

18 Pada praktikum kali ini yaitu pembuatan larutan stok. Diawali dengan penimbangan media komponen penyusun larutan stok dengan menggunakan timbangan analitik. Setelah dilakukan penimbangan sesuai dengan kebutuhan yaitu berdasarkan kepekatan atau konsentrasi yang dinginkan, maka dilakukan proses pelarutan dengan menggunakan aquades murni yang tidak mengandung ion. Untuk larutan stok yang terdiri lebih dari satu persenyawaan maka proses pelarutan dilakukan pada tempat yang berbeda hal ini dilakukan untuk mencegah terjadinya reaksi kimia antara masing-msing persenyawaan misalnya reaksi penggaraman yang dapat meyebabkan degradasi atau penurunan dari larutan stok itu sendiri. Larutan stok A mengandung NH 4 NO 3 sebanyak 1.650,000 mg. Untuk membuat larutan stok A kita memerlukan 82,500 gr. Tetapi dalam praktikum ini hanya membuat larutan stok A hanya 250 ml dengan kepekatan 50 saja, maka kami hanya memerlukan NH 4 NO 3 sebanyak 20,625 g (82,500 gr : 4). Pembuatan larutan stok A, yaitu dengan menimbang NH 4 NO 3 sebanyak 20,625 g, kemudian memasukkannya ke dalam gelas kimia dan menambahkan akuades sekitar 250 ml, kemudian sambil diaduk meggunakan magnetic stirrer melarutkannya menggunakan hot plate. Setelah larutan stok terlarut sempurna, larutan persenyawaan tersebut dituangkan pada botol yang telah disiapkan dan ditutup rapat kemudian diberi lebel A. Larutan harus terlarut sempurna agar pada waktu diletakkan dilemari es tidak terjadi endapan. Biasanya larutan yang sudah mengalami pengendapan, tidak dapat digunakan lagi. Pengendapan larutan stok umumnya terjadi bila kepekatan dapat dihindari dengan membuat larutan yang tidak terlalu pekat atau tidak menggunakan larutan campuran, yaitu dengan membuat satu larutan stok hanya untuk satu jenis bahan (terutama untuk unsur hara makro). Kondisi simpan juga diperhatikan, karena ada beberapa bahan yang tidak tahan dalam suhu tinggi atau cahaya. Pembuatan larutan stok B, yaitu dengan menimbang KNO 3 sebanyak 23,750 g, kemudian memasukkannya ke dalam gelas kimia dan menambahkan akuades sekitar 250 ml, kemudian sambil diaduk meggunakan magnetic stirrer melarutkannya menggunakan hot plate. Setelah larutan stok terlarut sempurna, larutan persenyawaan tersebut dituangkan pada botol dan diberi lebel B. Pembuatan larutan stok C, yaitu masing-masing media dimasukkan ke dalam gelas kimia secara terpisah dan menambahkan akuades masing-masing 30 ml, kemudian

19 sambil diaduk meggunakan magnetic stirrer melarutkannya menggunakan hot plate. Setelah larutan stok terlarut sempurna, larutan persenyawaan tersebut digabung pada labu ukur secara berurut yaitu KH 2 PO 4, H 3 BO 3, KI, Na 2 MoO 4.2H 2 O, dan CoCl 2.6H 2 O, supaya tidak terjadi penggumpalan atau pengendapan, dan ditepatkan volumenya dengan menggunakan aquades sampai batas 250 ml. Setelah volumenya sudah ditepatkan maka larutan stok tersebut dipindahkan botol ditutup rapat kemudian diberi lebel C. Karena kami di dalam praktikum ini membuat larutan stok D hanya 250 ml dengan kepekatan 50, maka kami hanya memerlukan CaCl 2.2H 2 O sebanyak 22 g,. Pembuatan larutan stok D, yaitu dengan menimbang CaCl 2.2H 2 O sebanyak 22 g, kemudian memasukkannya ke dalam botol kultur dan menambahkan akuades sekitar 100 ml, kemudian sambil diaduk meggunakan magnetic stirrer melarutkannya menggunakan hot plate. Setelah larutan stok terlarut sempurna, larutan persenyawaan tersebut dituangkan pada labu ukur dan ditepatkan volumenya dengan menggunakan aquades sampai batas 250 ml. Setelah volumenya sudah ditepatkan maka larutan stok tersebut dipindahkan ke botol ditutup rapat kemudian diberi lebel D. Pembuatan larutan stok E, yaitu dengan menimbang MnSO 4.7H 2 O, MgSO 4.7 H 2 O, kemudian memasukkannya ke dalam botol kultur dan menambahkan akuades sekitar 250 ml. Larutan dimasukkan ke dalam botol yang terpisah, kemudian sambil diaduk meggunakan magnetic stirrer melarutkannya menggunakan hot plate. Setelah larutan stok terlarut sempurna, larutan persenyawaan tersebut digabung pada labu ukur secara berurut yaitu MgSO 4 kemudian KH 2 PO 4 supaya tidak terjadi penggumpalan atau pengendapan, dan ditepatkan volumenya dengan menggunakan aquades sampai batas 250 ml. Setelah volumenya sudah ditepatkan maka larutan stok tersebut dipindahkan ke botol ditutup rapat kemudian diberi lebel E. Larutan stok F mengandung FeSO 4.7H 2 O dan Na 2.EDTA sebanyak 1,865 g dan 1,390 g. Pembuatan larutan stok F, yaitu dengan menimbang FeSO 4.7H 2 O dan Na 2.EDTA masing-masing sebanyak 1,865 g dan 1,390 g, kemudian memasukkannya ke dalam gelas piala secara terpisah dan menambahkan akuades masing-masing sekitar 100 ml, kemudian sambil diaduk meggunakan magnetic stirrer melarutkannya menggunakan hot plate. Setelah larutan stok terlarut sempurna, larutan persenyawaan tersebut digabung pada labu ukur secara berurut yaitu FeSO 4.7H 2 O kemudian Na 2.EDTA supaya

20 tidak terjadi penggumpalan atau pengendapan, dan ditepatkan volumenya dengan menggunakan aquades sampai batas 250 ml. Setelah volumenya sudah ditepatkan maka larutan stok tersebut dipindahkan botol ditutup rapat kemudian diberi lebel F. Setelah selesai membuat larutan stok, larutan stok yang telah jadi disimpan pada lemari pendingin secara berurutan (A-F). gelas Erlenmeyer tersebut (tempat larutan stok) sebelumnya telah dibaluti dengan aluminium foil yang telah disterilkan. Untuk penggunaannya dalam pembuatan media yaitu dengan cara mengencerkan larutan stok yang telah dipipet sesuai dengan kebutuhan dengan menggunakan aquades. Dengan adanya larutan stok dapat memberi keuntungan antara lain yaitu menghemat waktu pekerjaan, menimbang bahan media setiap kali ingin membuat media, mengatasi kesulitan menimbang dalam konsentrasi kecil dan mengurangi kerusakan bahan kimia akibat terlalu sering dibuka dan ditutup. Larutan stok dalam bentuk cair disimpan di dalam lemari es. Pembuatan larutan stok harus dilakukan dengan cermat, sebab larutan stok yang terlalu pekat akan mengalami penendapan di dalam lemari es. Jika terjadi pengendapan, maka sebelum larutan stok digunakan terlebih dahulu harus dipanaskan. Pembuatan media dikelompokan berdasarkan jenis bahan kimia yang digunakan, sehingga jika bahan kimia tersebut dicampur tidak terjadi interaksi yang menghasilkan senyawa baru. Biasanya pengelompokan dilakukan berdasarkan stok hara makro, stok hara mikro, vitamin dan stok hormone, terutama jika larutan stok tidak disimpan terlalu lama. Senyawa-senyawa di dalam media MS dapat terjadi pengendapan persenyawaan, ini terlihat jelas pada media cair. Kebanyakan dari persenyawaan yang mengendap adalah fosfat dan besi, kemudian dalam jumlah yang lebih sedikit adalah Ca, K, N, Zn dan Mn. Senyawa paling sedikit adalah senyawa yang mengandung unsur C, Mg, H, Si, Mo, S, Ca dan Co. Pengendapan unsur-unsur tersebut mungkin tidak penting, karena unsur-unsur tersebut masih tersedia bagi jaringan tanaman dan pengaruh pengendapannya belum diketahui. Untuk mengatasi pengendapan Fe, Dalton dan grupnya menganjurkan supaya konsentrasi Fe dikurangi sampai 1/3 dengan EDTA yang tetap (Dalton et al, 1983).

21 b. Pembuatan Media MS Media Murashige & Skoog (media MS) merupakan media yang digunakan hampir pada semua macam tanaman terutama herbaceous. Media ini memiliki konsentrasi garam-garam mineral yang tinggi, terutama kebutuhan garam anorganik yang mendukung pertumbuhan optimum pada kultur jaringan tembakau dan senyawa N dalam bentuk NO - 3 dan NH + 4. Menurut Gamborg dan Shyluk (1981) dalam Gunawan (1988), sel-sel tanaman membutuhkan ph yang sedikit asam berkisar antara 5,5 5,8. Pengaturan ph, biasa dilakukan dengan dengan menggunakan NaOH (atau kadang-kadang KOH) atau HCL pada waktu semua komponen sudah dicampurkan. Pada praktikum yang telah di laksanakan dilakukan penambahan NaoH untuk mencapai ph netral. Agar dapat mencukupi kebutuhan karbon, maka sukrosa harus ditambahkan ke dalam media. Tanaman dalam kultur jaringan tumbuh secara heterotrof dan karena mereka tidak cukup mensintesa kebutuhan karbonnya. Sumber karbon ini menyediakan energy bagi pertumbuhan tanaman dan juga sebagai bahan pembangun untuk memproduksi molekul yang lebih besar yang diperlukan untuk tumbuh. Bahan pemadat media yang digunakan adalah agar-agar. Agar-agar adalah campuran polisakarida yang diperoleh dari beberapa spesies algae. Dalam analisa unsur, diperoleh data bahwa agar-agar mengandung sedikit unsur Ca, Mg, K, dan Na (Debergh, 1982 dalam Gunawan, 1992). Smith (1992) menyatakan pemilihan media kultur jaringan merupakan kunci sukses dalam kultur jaringan. Hal ini menyebabkan banyak diadakan penelitian untuk memodifikasi media-media yang memberikan respon berbeda terhadap berbagai macam tanaman. Sumber karbon merupakan salah satu faktor yang sangat penting untuk menentukan keberhasilan kultur jaringan selain kombinasi zat tumbuh (ZPT). Sumber karbon berfungsi sebagai sumber energi yang dibutuhkan oleh sel untuk dapat melakukan pertumbuhan (Kimball, 1994). Glukosa dan fruktosa sebagai hasil hidrolisis sukrosa dapat merangsang pertumbuhan beberapa jaringan. Konsentrasi sukrosa berpengaruh terhadap pertumbuhan kalus (Srilestari, 2005). Pada praktikum yang kami lakukan penambahan NaOH pada larutan sebab ph larutan berada di bawah kisaran ph yang dianjurkan yaitu sebesar 5,6 karena bahan pembuat medianya kebanyakan golongan asam. Kemudian dilakukan pengukuran ph

22 dan ditetapkan sampai 5.8. Pengaturan ph dilkukan untuk menjamin ketersediaan unsure hara bagi eksplan di dalam botol kultur. Karena pada praktikum ini, media yang digunakan adalah media padat maka diperlukan bahan pemadat berupa agar. Agar yang diberikan yaitu sebesar 10,5 gram dimasukkan kedalam larutan penyusun media dan dipanaskan. Pengukuran ph tidak lagi dilakukan karena apabila larutan media yang telah ditambahkan agar diukur ph-nya maka akan merusak ph-meter. Konsentrasi agar yang terlalu tinggi dapat mengurangi difusi persenyawaan dari dan ke arah eksplan sehingga pengambilan hara dan zat tumbuh berkurang, sedangkan zat penghambat dari eksplan tetap berkumpul di sekitar eksplan. Setelah mencapai titik didih yang ditandai dengan larutan berwarna bening dan terdapat gelembung maka larutan dituangkan ke dalam botol-botol kultur. Kemudian botol ditutup dengan plastik dan diikat dengan karet yang sebelumnya telah disterilkan dan dilakukan sterilisasi basah dengan menggunakan autoclave selam 20 menit pada suhu C dan pada tekanan 15 psi. Setelah itu botol-botol kultur diletakan di dalam ruang kulur pada rak-rak yang telah tersedia.

23 BAB V PENUTUP 5.1 Kesimpulan Dari hasil dan pembahasan dapat disimpulkan bahwa : Dengan adanya larutan stok dapat memberi keuntungan antara lain yaitu menghemat waktu pekerjaan, menimbang bahan media setiap kali ingin membuat media, mengatasi kesulitan menimbang dalam konsentrasi kecil. Dari hasil praktikum dapat disimpulkan bahwa dalam proses pembuatan larutan stok yang terdiri dari stok A-F melalui beberapa tahapan antara lain: penimbangan persenyawaan, pelarutan senyawa kimia dengan menggunakan aquades, penetapan volume akhir, pelabelan dan panyimpanan pada lemari es. Sterilisasi merupakan suatu proses atau kegiatan membebaskan suatu bahan atau benda dari semua mikroorganisme. Sterilisasi yang digunakan pada praktikum ini dengan menggunakan senyawa kimia dan pemanasan uap air bertekanan (Autoklaf) Media Murashige dan Skoog (MS Medium) adalah media yang khusus dibuat untuk pertumbuhan kalus dalam kultur jaringan, tetapi bisa diapikasikan ke semua jenis tanaman walau kurang spesifik. 5.2 Saran Sebaiknya dalam praktikum pembuatan media menggunakan massa atau konsentrasi senyawa yang sesuai agar tidak terjadi pengendapan pada botol stok dan mahasiswa diberi waktu yang cukup untuk lebih mengenal dan memahami media-media yang digunakan dalam kultur jaringan agar mahasiswa lebih memahaminya.

24 DAFTAR PUSTAKA Gunawan, L.W Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan Pusat Antar Universitas (PAU) Bioteknologi IPB Bogor. 165 hal. Hendaryono dan Ir Ari Wijayani, Teknik Kultur Jaringan. Kanisius, Yogyakarta Kimball, J.W Biologi. Erlangga. Bogor Lawalata, Imelda Jeanette Pemberian Beberapa Kombinasi ZPT Terhadap Regenerasi Tanaman Gloxinia (Siningia speciosa) dari Eksplan Batang dan Daun Secara In Vitr. J.Exp. Life Sci. Vol. 1 No. 2, Feb 2011.Ambon Marlin, dkk Penuntun Praktikum Kultur Jaringan. Fakultas Pertanian Universitas Bengkulu, Bengkulu. Nugroho, A dan H. Sugianto Pedoman Pelaksanaan Tehnik Kultur Jaringan. Penebar Swadaya, Jakarta. Sitorus, Ertina Novaria, DKK Induksi Kalus Binahong (Basella rubra L.) Secara In Vitro Pada Media Murashige & Skoog Dengan Konsentrasi Sukrosa Yang Berbeda. BIOMA, Juni 2011 ISSN: Vol. 13, No. 1.Semarang Smith, R.S Plant Tissue Culture Techniques and Experiments. Academic Press. USA. Srilestari, R Induksi Embrio Somatik Kacang tanah Pada Berbagai Macam Vitamin dan Sukrosa. Ilmu pertanian Vol. 12. No. 1. Hal Yusnita, Kultur Jaringan Cara Memperbanyak Tanaman Srcara Efisien. P.T Agromedia Pustaka, Tangerang. Zulkarnain Kultur Jaringan Tanaman : Solusi Perbanyakan Tanaman Budidaya. Bumi Aksara, Jakarta

25