METODE PENELITIAN. Penelitian ini dilaksanakan dari bulan September sampai Maret 2017.

Transkripsi

1 METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan dari bulan September sampai Maret Sampel dikumpulkan dari kawasan hutan mangrove Desa Lubuk Kertang, Kabupaten Langkat, Sumatera Utara. Isolasi lipid dari setiap sampel dilakukan di Laboratorium PT. Socfin Indonesia, analisis kromatografi lapis tipis (Thin Layer Chromatography) dan polyisoprenoid dilakukan di Laboratorium Fitokimia, Fakultas Farmasi, dan Laboratorium Budidaya Hutan Fakultas Kehutanan,, Medan. Alat dan Bahan Alat yang digunakan dalam pelaksanaan penelitian ini yaitu cutter dan gunting untuk memotong sampel menjadi bagian-bagian kecil, grinding machiene (Foss) untuk menghaluskan sampel, oven, inkubator, desikator, timbangan analitik, macropipettes (5-20 ml), micropippetes (5-200 µl), chamber, bar magnetik, TLC plates, TLC cutter, botol kocok, botol serum, corong, spatula, kamera, alat tulis, kantong plastik, aluminium foil, label name, silica gel dan amplop sampel. Bahan yang digunakan dalam pelaksanaan penelitian ini yaitu bagian organ vegetatif berupa akar dan daun R. communis, bagian akar dan daun M. candidum, dan akar dan daun B. asiatica. Sedangkan bahan kimia yang digunakan adalah, kloroform, metanol, aquades, etanol, KOH, heksan, toluen, etil asetat, aseton, polyisoprenoid Std, dan uap yodium.

2 Prosedur Penelitian Koleksi Sample Daun dan akar tiga spesies mangrove dikumpulkan dari daerah Desa Lubuk Kertang, Kabupaten Langkat, Sumatera Utara. Daun dan akar (sekitar 4-5 gram berat basah) dikumpulkan pada bulan September Tiga spesies mangrove yang daun dan akar nya dikumpulkan adalah R. communis, M. candidum, dan B. asiatica. Usia daun diperkirakan berumur 2-6 bulan. Tumbuhan mangrove yang dikoleksi tumbuh dengan paparan sinar matahari alami. Semua sampel segar disimpan dilemari es sebelum digunakan. Ektraksi Lipid Daun atau akar (masing-masing dengan berat 2 gram berat kering diekstrak dengan klorofom/methanol (CHCL 3 /CH 3 OH; berdasarkan volume 2:1). Kemudian diinkubasi pada suhu 40 ºC selama 24 jam. Dinding sel yang berisi ekstrak dalam CM21 disaring dengan kertas filtrasi No. 2 (Advantec, Tokyo, Jepang) dan yang tersisa adalah ekstrak lipid di dalam kloroform. Sebagian ekstrak dimurnikan untuk dianalisis kandungan lipidnya seperti yang digambarkan sebelumnya (Basyuni et al. 2007). Cairan ekstrak lipid yang pekat dikeringkan kemudian ditimbang dan di dapatkan berat lipidnya. Sehingga dapat diketahui kandungan total lipid/jaringan (mg/g jaringan). Saponifikasi Ekstrak lipid dari daun dan akar disaponifikasi pada suhu 65 ºC selama 24 jam dengan perbandingan :

3 2ml air (water) 2ml ethanol x sampel x sampel 0,45 KOH x sampel Setelah 24 jam di inkubasi di waterbath, sampel dikeringkan dengan oven bersuhu ºC sampai sampel benar-benar kering. Bahan kimia Dolichol dari hati babi diperoleh dari Sigma. Campuran standar senyawa dolichol (C 90 -C 105 ) diisolasi dari testis kuda dan campuran polyprenol (C 90 -C 100 ) dari Malus sp (Swiezewska & Danikiewicz 2005). Standar dolichol (C 95 -C 110 ) berasal dari cakalang hati tuna (Ishiguro et al. 2014). Bombiprenone (C 43 ) dimurnikan dengan kromatografi silika gel NSL dari CHCL3/CH3OH (2:1) berasal dari ekstrak daun kering Perilla dan fraksi yang sudah dimurnikan dikonfirmasi dengan memiliki nilai m/z [M + Na]. Analisis dengan dua dimensi kromatografi lapis tipis Dimensi pertama TLC dilakukan selama 60 menit diatas silika gel (20 x 3 cm) dengan sistem pelarut toluen-etil asetat (9:1), seperti yang dijelaskan oleh (Sagami et al. 1992). Dalam analisis TLC, famili polyprenol bergerak sedikit lebih cepat dari famili dolichol. Tepi longitudinal dari dimensi pertama TLC dengan lebar 1 cm dan zona konsentrasi dari fase reverse C-18 TLC yang dijepit dengan cara menggunakan dua bar magnetik (4,0 x 1,1 x 0,8 cm) dengan mengahadap setiap fase gel. Plat TLC yang terikat kemudian dikembangkan tegak lurus ke dimensi pertama untuk mentransfer polyprenol dan dolichol ke zona konsentrasi fase reverse TLC.

4 Dimensi kedua fase reverse RP-18 silika gel TLC dilakukan dengan pelarut aseton selama sekitar 30 menit. Posisi polyisoprenoid alkohol dipisahkan dan dikembangkan dengan uap yodium (iodine vapor). Gambar kromatografi yang diperoleh dan discan digital dengan seri printer Canon E400. Konsentrasi polyprenol dan dolichol terdeteksi pada HPTLC RP-18 diukur menggunakan ImageJ 1.46r (Schneider et al. 2012) dengan standar dolichol dan polyprenol sebagai acuan.

5 HASIL DAN PEMBAHASAN Profil Polyisoprenoid di Mangrove Ikutan Penelitian dilakukan untuk menganalisis kandungan dan kuantifikasi senyawa polyisoprenoid pada organ vegetatif tiga jenis mangrove ikutan. Dari hasil ekstraksi daun dan akar R. communis, M. candidum, dan B. asiatica. diperoleh total lipid dolichol dan polyprenol. Hasil ekstraksi yang diperoleh terlihat pada Tabel 1. Tabel 1. Total lipid dan pembagian nilai dolichol dan polyprenol pada daun dan akar R. communis, M. candidum, dan B. asiatica. Jenis Jari nga n Lipid total (mg/g dw) Polyisopreno Polypreno id (mg/g dw) ls (mg/g) Dolicho ls (mg/g) Typ % in total lipid % in polyisoprenoid e Polyisopreno Polypreno Dolicho Polypreno Dolicho id ls ls ls ls B. asiatica Dau n 629,5 132,6 11,2 121,3 21,1 1,8 19,3 8,4 91,5 I M. candidum Dau n 606,8±63,9 140,3 95,3 45,1 23,1 15,7 7,4 67,9 32,1 II R. communis Dau n 860,6±14,6 20,4 20,4 nd 2,4 2,4 nd 100,0 nd III B. asiatica Aka r 595,0 46,8 nd 46,8 7,9 nd 7,9 nd 100,0 I M. candidum Aka r 528,4±1, 90 33,8 14,8 19 6,4 2,8 3,6 43,8 56,2 II R. Aka 534,1±11 31,1 nd 31,1 5,8 nd 5,8 nd 100,0 I communis r,9 nd = not detected/ tidak terdeteksi. Penyebaran polyprenol dan dolichol dengan panjang rantai karbon dari setiap famili disajikan pada Tabel 1. Dari Tabel 1 dapat dilihat total lipid dan nilai

6 dari polyprenol dan dolichol dari masing-masing jaringan daun dan akar dari tiga jenis mangrove ikutan. Total lipid dinyatakan sebagai perkiraan gravimetri fraksi lipid. Berdasarkan Tabel 1, total lipid pada jaringan daun berkisar dari 606,5 sampai 860,6 mg/g dengan total lipid terkecil terdapat pada daun M. candidum (606,5 mg/g) dan yang terbesar pada R. communis (860,6 mg/g), sedangkan total lipid pada jaringan akar berkisar dari 528,4 sampai 595,0 mg/g dengan total lipid terkecil ditemukan pada akar M. candidum (528,4 mg/g) dan total lipid terbesar pada B. asiatica (595,0 mg/g). Jumlah polyisoprenoid terbesar pada jaringan daun terdapat pada jaringan daun M. candidum (140,3 mg/g) dan pada jaringan akar terdapat pada B. asiatica (46,8 mg/g), sedangkan nilai polyisoprenoid terkecil terdapat pada jaringan daun dan akar R. communis masing-masing 20,4 mg/g dan 31,1 mg/g. Basyuni et al. (2016) membagi polyprenol dan dolichol pada daun dan akar kedalam tiga tipe (I, II, III). Tipe-I terdapat dominasi dolichol lebih dari 90%, tipe-ii mengandung kedua senyawa polyprenol dan dolichol pada jaringan tumbuhan, sedangkan tipe-iii dominasi senyawa polyprenol lebih dari 90%. Pada jaringan daun dan akar ketiga jenis mangrove ikutan, dapat ditemukan ketiga tipe diatas sedangkan pada jaringan akar dari ketiga jenis mangrove ikutan terbagi ke dalam tipe-i dan II. Sama dengan pengamatan sebelumnya yaitu pada daun mangrove Okinawa, tipe-i, II dan III juga ditemukan pada jaringan daun dan pada pengematan akar mangrove juga hanya ditemukan tipe-i dan II (Basyuni et al. 2016). Namun, hasil yang konsisten didapatkan pada tiga akar mangrove ikutan yang menunjukkan bahwa dolichol lebih berlimpah daripada

7 polyprenol, sama dengan penelitian sebelumnya yang menemukan hal serupa pada akar mangrove di Okinawa (Basyuni et al. 2016). Daun dan akar B. asiatica dan akar R. communis masuk ke dalam tipe-i. Sedangkan daun dan akar M. candidum termasuk kedalam tipe-ii, dapat dilihat jumlah polyprenol dengan panjang rantai yang mirip dengan dolichol ditemukan pada dua jaringan ini (Gambar 2B dan 2E). Pada tipe-iii, penemuan polyprenol lebih dari 90%, yang juga sama dengan pengamatan saat penelitian pada mangrove Okinawa (Basyuni et al. 2016), seperti yang ditunjukkan pada jaringan daun R. communis yang termasuk kedalam tipe-iii, karena pada jaringan ini hanya ditemukan 100% polyprenol. Distribusi dari dominasi polyprenol lebih dari pada dolichol, dan sama dengan tipe-iii pada daun tidak terlihat pada jaringan akar dari tiga jenis mangrove ikutan. Pada jaringan akar dan daun R. communis dapat dilihat perbedaan rantai panjang senyawa polyisoprenoid, meskipun pada jaringan daun dan akar B. asiatica serta daun dan akar M. candidum ditemukan dolichol dan polyprenol, namun terdapat perbedaan konsentrasi dolichol dan polyprenol (Gambar 2), hal ini diduga karena perbedaan umur pada jaringan dan perbedaan lingkungan dari masing-masing jenis. Hal ini sesuai dengan pernyataan Tateyama et al. (1999) yang menyatakan distribusi rantai panjang polyprenol belum tentu sama dengan rantai panjang dolichol di jaringan yang sama, hal ini juga didukung pernyataan Suga et al. (1989) yang menyatakan konsentrasi polyisoprenoid pada tanaman mengalami perubahan yang disebabkan oleh perbedaan umur dan juga musim. Selain itu perbedaan konsentrasi dolichol dan polyprenol akan meningkat disetiap

8 jaringan tanaman dengan pertambahan umur dan dengan meningkatmya cekaman lingkungan (Swiezewska & Danikiewiez 2005). Analisis Kromatografi Lapis Tipis Kandungan senyawa polyisoprenoid dari tiga jenis mangrove ikutan dianalisis menggunakan metode kromatografi lapis tipis (Sagami et al. 1992, Basyuni et al. 2016) dapat dilihat pada Gambar 2. Polyisoprenoid dengan rantai panjang yang berbeda dipisahkan menjadi famili polyprenols dan dolichol. Sedangkan Tabel 2 menjelaskan tentang penyebaran polyprenols dan dolichols dengan panjang rantai karbon dari setiap famili. (A) (B) (C) (D) (E) (F) Gambar 2. Analisis dua dimensi kromatografi dari daun B. asiatica (A), daun M. candidum (B), daun R. communis (C), akar B. asiatica (D), akar M. candidum (E), dan akar R. communis (F). Identifikasi rantai panjang polyisoprenoid dari tiga jenis mangrove ikutan pada daun dan akar menggunakan metode analisis kromatografi lapis tipis (Sagami et al. 1992, Basyuni et al. 2016) untuk memisahkan dolichol dan

9 polyprenol. Analisis polyisoprenoid pada jaringan daun dari tiga jenis mangrove ikutan menunjukkan bahwa tipe-ii lebih mendominasi dari pada hanya ditemukan salah satu senyawa polyprenol atau dolichol. Pengamatan ini berlawanan dengan daun dan akar pada hutan mangrove bahwa mayoritas polyisoprenoid alkoholnya adalah dolichol daripada polyprenol. Berdasarkan hasil dari analisis kromatografi lapis tipis dari polyisoprenoid dari jaringan daun dan akar B. asiatica, daun dan akar M. candidum dan akar R. communis ditemukan dolichol dengan panjang rantai masing C 55 -C 140, C 75 -C 100, C 50 -C 115, C 75 -C 90, dan C 80 -C 90 (Tabel 2). Dengan metode yang sama ditemukan juga senyawa polyisoprenoid polyprenol pada jaringan daun B. asiatica, daun dan akar M. candidum, dan jaringan daun R. communis dengan masing-masing panjang rantai C 80 -C 95, C 45 - C 140, C 80 -C 90 dan C 60 -C 65 (Tabel 2). Menariknya, pada jaringan daun R. communis tampak berbeda dengan yang lain, karena bahwa pada spesies ini hanya mengandung rantai pendek polyprenol (C 80 -C 90 ) sedangkan rantai panjang dolichol dan polyprenol tidak terdeteksi. Penemuan ini serupa dengan penelitian pada famili dari Euphorbiaceae, Lauraceae, Magnoliaceae, dan Moraceae (Jankowski et al. 1994; Swiezewska et al. 1994; Marczewski et al. 2007) Pada daun B. asiatica, rantai karbon pada dolichol ditemukan lebih panjang (>C 100 atau lebih) daripada polyprenol (C 80 -C 95 ) (Gambar 2A dan 2B), sedangkan pada akar M. candidum (Gambar 2E) rantai karbon dolichol dan polyprenol tidak jauh berbeda meskipun sedikit lebih panjang pada rantai karbon dolichol (C 75 -C 90 ) dari polyprenol (C 80 -C 90 ). Namun bagaimanapun, rantai karbon dolichol yang ditemukan pada jaringan daun menujukkan bahwa hasil yang didapat sedikit berbeda dengan penelitian yang telah dilakukan sebelumnya

10 (Skoczylas et al. 1994), yaitu dolichol tidak ditemukan pada jaringan daun, sedangkan pada jaringan daun L. racemosa di mangrove Okinawa (Basyuni et al. 2016) ditemukan dolichol. Perbedaan yang ada ini mungkin disebabkan karena perbedaan usia pada daun dan kondisi lingkungannya. Pengamatan ini menunjukkan bahwa jalur biosintesis dari polyprenol rantai pendek, polyprenol rantai menengah, polyprenol rantai panjang dan dolichol yang berbeda diatur dalam kerajaan tumbuhan, termasuk tumbuhan mangrove (Chouda & Jankowski 2005). Berbeda dengan daun M. candidum yang justru memperlihatkan panjang rantai karbon polyprenol (>C 100 atau lebih) ditemukan lebih panjang dibanding dolichol (C 50 -C 115 ) (Gambar 2B). Sedangkan pada daun R. communis (Gambar 2C), senyawa polyprenol 100% ditemukan dan tidak terdeteksi adanya senyawa dolichol, hampir sama dengan akar B. asiatica dan akar R. communis yang 100% ditemukan satu jenis senyawa, pada kedua jaringan tersebut hanya terdeteksi senyawa dolichol dan tidak terdeteksi adanya polyprenol (Gambar 2D dan 2F). Menurut Tateyama et al. (1999) bahwa rantai panjang dolichol bervariasi pada setiap jaringan, bahkan pada spesies yang sama dan muncul untuk membentuk famili yang berbeda dengan molekul spesies yang mendominasi. Polyprenol juga terjadi menjadi satu atau dua keluarga polyprenol, khususnya polyprenol tipe-fikaprenol (polyprenol rantai pendek) dan polyprenol rantai panjang, tergantung pada tumbuhan dan jaringannya. Dua famili polyprenol ditemukan pada daun M. candidun, temuan ini juga didukung dengan beberapa penelitian sebelumnya pada dua famili polyprenol di jaringan daun tua dari tumbuhan mangrove mayor K. obovata (Basyuni et al. 2016).

11 Tabel 2. Panjang rantai karbon pada pada daun dan akar R. communis, M. candidum, dan B. asiatica. Jenis Jaringan (C43) Polyprenol Dolichol B. asiatica Daun and more M. candidum Daun and more R. communis Daun B. asiatica Akar M. candidum Akar R. communis Akar Tabel 2 menggambarkan distribusi dolichol dan polyprenol pada masingmasing daun dan akar dari tiga jenis mangrove ikutan B. asiatica, M. candidum, dan R. communis. Dolichol ditemukan disemua jaringan kecuali pada jaringan daun R. communis yang hanya ditemukan polyprenol rantai pendek, yakni C 60 -C 65. Senyawa bombiprenone (C 43 ) terdeteksi pada daun B. asiatica dan M. candidum (Tabel 2). Tidak ada senyawa polyprenol yang terdeteksi di akar B. asiatica dan akar R. communis. Senyawa polyprenol pada akar hanya terdapat pada akar M. candidum dalam jumlah kecil yakni C 80 -C 90. Namun polyprenol mendominasi pada daun M. candidum dengan rantai panjang C 45 -C 140, dan senyawa polyprenol terdapat pada semua jaringan daun. Berdasarkan penelitian sebelumnya (Basyuni et al. 2016), pada jaringan daun H. tiliaceus yang termasuk kedalam mangrove ikutan, juga hanya ditemukan rantai pendek polypernol. Hal ini sesuai dengan pernyataan Swiezewska et al. (1994); Tateyama et al. (1999); Swiezewska dan Danikiewska (2005), yang menyatakan bahwa dalam dunia tumbuhan terutama pada jaringan daun, polyprenol biasanya terdeteksi dengan konsentrasi yang berlimpah dibandingkan dengan dolichol.

12 Dolichol bertindak sebagai lipid pembawa gula dalam biosintesis N- glikoprotein. Oleh karena itu, meskipun pada daun B. asiatica panjang rantai dolichol lebih besar dari polyprenol dan sekalipun itu di jaringan daun tumbuhan mangrove, hal ini dikarenakan bahwa reduktase polyprenol bertanggung jawab untuk konversi dari polyprenol ke dolichol mungkin aktif pada jaringan daun B. asiatica, seperti yang ditemukan pada hewan (Pattison & Amtmann 2009; Cantagrel et al. 2010), dimana dolichol merupakan senyawa polyisoprenoid utama dan hanya beberapa polyprenol dapat ditemukan (Chojnacki & Dallner 1988; Daniels & Hemming 1990; Sagami et al. 1992). Sedangkan dolichol yang ditemukan pada lima dari enam jaringan termasuk akar dan daun, mendominasi pada ketiga jaringan akar mangrove ikutan, hanya ada satu janis mangrove ikutan dari jaringan akar yang ditemukan kedua senyawa polyprenol dan senyawa dolichol namun itupun dalam jumlah kecil. Seperti yang bisa dilihat pada tabel 2, pada akar B. asiatica hanya ditemukan dolichol (C 75 -C 100 ), M. candidum dengan panjang rantai dolichol C 75 -C 90, sedangkan pada jaringan akar R. communis (C 80 -C 90 ). Hasil ini didukung dengan penelitian sebelumnya yang melaporkan bahwa dolichol lebih dominan daripada polyprenol dengan rantai panjang di akar Hevea brasiliensis (Tateyama et al. 1999), akar Coluria geoides (Skorupinska-Tudek et al. 2003), dan akar tumbuhan mangrove (Basyuni et al. 2016). Oleh sebab itu, jumlah besar dari dolichol yang ada bahkan pada lima dari enam jaringan tiga jenis mangrove ikutan, menyiratkan bahwa polyprenol tidak memainkan peran penting dalam beberapa jaringan mangrove ikutan, walaupun fungsi dari polyprenol pada dunia tumbuhan tetap tidak jelas. Dominasi dolichol

13 yang jelas mungkin adalah hasil dari zona mangrove ikutan yang berada dipesisir dengan kondisi iklim tropis atau subtropis. Dimasa mendatang, akan sangat penting untuk memahami keberadaan dolichol pada tumbuhan mangrove ikutan ini yang dapat berfungsi sebagai lipid pembawa gula dalam biosintesis N-glikoprotein (Pattison & Amtmann, 2009; Cantagrel et al. 2010). Temuan ini menjelaskan bahwa distribusi polyprenol dan dolichol ditemukan pada tiga jenis mangrove ikutan yang bervariasi tergantung dari setiap jaringan.

14 KESIMPULAN Analisis kromatografi lapis tipis dua dimensi dari jaringan daun dan akar B. asiatica, daun dan akar M. candidum dan akar R. communis ditemukan senyawa dolichol dengan panjang rantai masing C 55 -C 140, C 75 -C 100, C 50 -C 115, C 75 - C 90, dan C 80 -C 90, ditemukan juga senyawa polyisoprenoid polyprenol pada jaringan daun B. asiatica, daun dan akar M. candidum, dan jaringan daun R. communis dengan masing-masing panjang rantai C 80 -C 95, C 45 -C 140, C 80 -C 90 dan C 60 -C 65. Jumlah polyisoprenoid terbesar terdapat pada jaringan daun M. candidum (140,3 mg/g) dan pada jaringan akar pada B. asiatica (46,8 mg/g), sedangkan nilai polyisoprenoid terkecil terdapat pada jaringan daun dan akar R. communis masing-masing 20,4 mg/g dan 31,1 mg/g. Saran Sebaiknya dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui manfaat farmakologi dari tiga jenis mangrove ikutan R. communis, M. candidum, dan B. asiatica berdasarkan senyawa polyisoprenoid yang telah ditemukan..