Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak N-Heksana dan Etil Asetat Daun Kelor (Moringa oleifera Lam.) Dengan MetodePeredaman Radikal Bebas DPPH

Transkripsi

1 Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak N-Heksana dan Etil Asetat Daun Kelor (Moringa oleifera Lam.) Dengan MetodePeredaman Radikal Bebas DPPH Ni Wayan Martiningsih 1*, I Made Pasek Anton Santiasa 2 Jurusan Analis Kimia Fakultas MIPA Universitas Pendidikan Ganesha, Singaraja, Bali 1* Jurusan Pendidikan Biologi Fakultas MIPA Universitas Pendidikan Ganesha, Singaraja, Bali 2 marti_chem03@yahoo.co.id Abstrak Kondisi lingkungan yang semakin memburuk dan adanya lubang pada lapisan ozon menyebabkan semakin mudahnya terbentuk zat-zat radikal, dalam bentuk logam ataupun nonlogam yang tentunya berdampak pada pencemaran terhadap pangan yang dikonsumsi manusia. Akibat yang ditimbulkan oleh lingkungan tercemar, kesalahan gaya hidup akan merangsang tumbuhnya radikal bebas yang dapat merusak tubuh kita. Ada berbagai macam bahan makanan yang memiliki khasiat sebagai antioksidan alami. Daun kelor sebagai salah satu alternatif bahan makanan sumber antioksidan belum banyak diteliti kegunaannya dalam menurunkan aktivitas radikal bebas di dalam tubuh.penelitian ini bertujuan untuk menguji aktivitas antioksidan dari daun kelor (Moringa oleiferalam.). Teknik ekstraksi yang digunakan dalam penelitian ini adalah teknik maserasi dengan menggunakan pelarut etanol. Ekstrak kental etanol yang dihasilkan kemudian dipartisi dengan n- heksana dan etil asetat. Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode DPPH.Berdasarkan perhitungan nilai IC 50 diperoleh hasil bahwa nilai IC 50 dari ekstrak n-heksana daun kelor sebesar 459,75 ppm (antioksidan kategori lemah), ekstrak etil asetat adalah 192,05 ppm (antioksidan kategori sedang) dan vitamin C sebesar 7,85 ppm (antioksidan kategori sangat kuat). Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan pada fraksi semipolar (etil asetat) lebih besar daripada fraksi nonpolar (n-heksana). Aktivitas antioksidan ekstrak n-heksana dan etil asetat daun kelor lebih lemah dibandingkan vitamin C. Kata kunci: daun kelor, ekstraksi, antioksidan, DPPH Abstract Environmental conditions worsened and the hole in the ozone layer caused more easily formed radical substances, in the form of metal or nonmetal which certainly have an impact on the contamination of food for human consumption.. The impact caused by the polluted environment, it will stimulate the growth of lifestyle free radicals that can damage our bodies. There are various kinds of foodstuffs that have efficacy as a natural antioxidant. Moringa leaves as an alternative food source of antioxidants have not been studied usefulness in reducing free radical activity in the body. This research aimed at testing the antioxidant activity of Moringa leaves (Moringa oleifera Lam.). The extract of Moringa leaves was prepared by maceration in ethanol. Crude ethanol extract was partitioned with n-hexane and ethyl acetate. DPPH method was used to examine the antioxidant activity of the extract. The IC 50 value of n-hexane extract is ppm (weak antioxidant activity), ethyl acetate extract is ppm (medium antioxidant activity) and vitamin C is 7,85 ppm (very strong antioxidant activity). These values suggested that antioxidant activity in semipolar fraction (ethyl acetate) is higher than nonpolar fraction (n-hexane). The antioxidant activity of n-hexane and ethyl acetate extract of Moringa leaves are weaker than vitamin C. Keywords :Moringa leaves, extraction, antioxidant, DPPH 1. Pendahuluan Kondisi lingkungan yang semakin memburuk dan adanya lubang pada lapisan ozon menyebabkan semakin mudahnya terbentuk zat-zat radikal, dalam bentuk logam ataupun nonlogam yang tentunya berdampak pada pencemaran terhadap pangan yang dikonsumsi manusia (Kumalaningsih, 2001). Hal inilah yang memotivasi para peneliti pangan dan gizi untuk mengeksplorasi senyawa-senyawa alami yang dapat menunda, menghambat, dan mencegah proses oksidasi atau terjadinya reaksi antioksidasi radikal bebas di tubuh kita yang diketahui sebagai salah satu penyebab rusak atau matinya sel-sel di dalam tubuh kita. Karena tanpa disadari dalam tubuh kita terusmenerus terbentuk radikal bebas melalui peristiwa metabolisme sel normal, peradangan, kekurangan gizi, dan akibat 398

2 respon terhadap pengaruh dari luar tubuh seperti polusi, sinar ultraviolet, dan asap rokok. Akibat yang ditimbulkan oleh lingkungan tercemar, kesalahan gaya hidup akan merangsang tumbuhnya radikal bebas yang dapat merusak tubuh kita. Daun kelor sebagai salah satu alternatif bahan makanan sumber antioksidan belum banyak diteliti kegunaannya dalam menurunkan aktivitas radikal bebas di dalam tubuh. Kelor sudah dikenal luas di Indonesia, khususnya di daerah pedesaan, tetapi belum dimanfaatkan secara maksimal dalam kehidupan. Di Indonesia pohon kelor banyak ditanam sebagai pagar hidup, ditanam di sepanjang ladang atau tepi sawah, berfungsi sebagai tanaman penghijau. Selain itu tanaman kelor juga dikenal sebagai tanaman obat berkhasiat dengan memanfaatkan seluruh bagian dari tanaman kelor mulai dari daun, kulit batang, biji, hingga akarnya (Simbolan dkk., 2007). Charoensin (2014) telah meneliti bahwa ekstrak metanol daun kelor memiliki aktivitas antioksidan lebih besar dibandingkan dengan ekstrak diklorometana daun kelor. Melihat dari publikasi di Indonesia tentang daun kelor yang masih terbatas terutama tentang aktivitas antioksidan pada kondisi pelarut yang berbeda, maka perlu dilakukan penelitian untuk mencari perbandingan aktivitas antioksidan pada daun kelor dalam pelarut non polar dan semi polar. Pelarut yang digunakan dalam penelitian ini adalah n- heksana dan etil asetat yang merupakan pelarut umum dalam penelitian kimia. Pengukuran perbandingan aktivitas antioksidan dilakukan secara spektrofotometri UV-Vis dengan metode yang sudah baku, sederhana, serta memerlukan sedikit sampel yaitu menggunakan metode DPPH (1,1-difenil 2-pikril hidrazil) dimana perubahan warna yang khas dari senyawa ini dapat juga diamati secara visual (Blois, 1958). 2. Metode Penelitian 2.1 Persiapan Daun kelor yang dijadikan sampel dicuci bersih, diiris, dan dikeringkan dengan cara diangin-anginkan di udara terbuka tanpa terkena sinar matahari langsung. Setelah kering, digerus atau diblender sehingga diperoleh bubuk sampel kering. Hasil ayakan disimpan di dalam kantong plastik yang ditutup rapat. 2.2 Ekstraksi Metabolit Serbuk daun kelor yang telah ditimbang dimaserasi dengan etanol. Setiap 24 jam ekstrak tersebut disaring dan diganti pelarutnya. Ekstraksi ini dilakukan berulang sampai ekstrak terakhir tidak mengandung metabolit. Filtrat etanol yang diperoleh kemudian dievaporasi sehingga dihasilkan ekstrak kental etanol. Selanjutnya ekstrak tersebut dilarutkan ke dalam air sebanyak 200 ml. Ekstrak air ini dipartisi dengan n-heksana, lalu dipisahkan dan lapisan n-heksana dievaporasi, sehingga diperoleh ekstrak n- heksana. Residu (lapisan air) dipartisi dengan etil asetat dan dipisahkan. Lapisan etil asetat dievaporasi sehingga diperoleh ekstrak etil asetat. Ekstrak n-heksana dan etil asetat masing-masing dilakukan uji antioksidan. 2.3 Uji Antioksidan Hasil evaporasi yang berupa ekstrak kental kemudian diuji aktivitas antioksidannya menggunakan metode DPPH dengan alat Spektrofotometer UV-Vis. dibuat lima deret konsentrasi yang menghasilkan pengukuran absorban pada alat spektrofotometer dalam range 0 sampai 1. Masing-masing konsentrasi diambil 2 ml dan ditambahkan DPPH sebanyak 1 ml dengan konsentrasi 40 ppm. Campuran didiamkan selama 30 menit di tempat gelap dan diukur absorbansinya pada λ 517 nm. Perlakuan ini diulang sebanyak 3 kali. Aktivitas antioksidan dapat dinyatakan dengan satuan persen inhibisi. Nilai ini diperoleh dengan rumus persamaan 1 berikut (Molyneux, 2004). % inhibisi= absorbansi kontrol-absorbansi sampel absorbansi kontrol Metanol digunakan sebagai blanko. Kontrol dibuat dengan cara yang sama tetapi tidak menggunakan ekstrak. Sedangkan untuk pembanding dibuat dengan cara yang sama tetapi ekstrak diganti dengan vitamin C. 2.4 Analisis Data Analisis data pada penelitian ini, dilakukan dengan cara mendiskripsikan data-data yang diperoleh dalam bentuk tabel dan grafik untuk mengetahui perbandingan aktivitas antioksidan ekstrak n-heksana dan etil asetat daun kelor (Moringa oleifera Lam.) dengan vitamin C. 3. Hasil dan Pembahasan 3.1 Hasil Aktivitas antioksidan dari ekstrak n- heksana dan etil asetat daun kelor diuji menggunakan spektrofotometer UV-Vis 100% 399

3 % inhibisi % inhibisi % inhibisi SEMINAR NASIONAL RISET INOVATIF III, TAHUN 2015 berdasarkan penurunan nilai absorbansi DPPH setelah diberi sampel uji terhadap kontrol pada setiap kenaikan konsentrasi. Setelah diperoleh hasil pengukuran absorbansi menggunakan spektrofotometer UV-Vis, dilakukan perhitungan untuk mencari persen peredaman (% inhibisi) dengan menggunakan persamaan 1.Hasil pengujian menggunakan spektrofotometer UV-Vis disajikan pada Tabel 1. y = x R² = Tabel 1: Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak n-heksana dan Etil Asetat Daun Kelor serta Vitamin C Uji Ekstrak n- heksana daun kelor Ekstrak etil asetat daun kelor Vitamin C Konsen trasi (mg/l) Absor bansi Kontr ol Absorb ansi Rata- Rata % Inhibi si 100 0,301 0,267 11, ,301 0,243 19, ,301 0,191 41, ,301 0,167 44, ,301 0,148 50,94 5 0,301 0,265 11, ,301 0,246 18, ,301 0,192 36, ,301 0,183 39, ,301 0,145 51,66 2 0,301 0,284 5,81 4 0,301 0,249 17,44 6 0,301 0,202 33,06 8 0,301 0,134 52, ,301 0,104 65,45 Kekuatan antioksidan ekstrak aseton daun kelor ditentukan berdasarkan perbandingan antara nilai IC 50 sampel uji dengan nilai IC 50 dari vitamin C oleh karena itu dibuat kurva hubungan antara konsentrasi dengan persen inhibisi pada setiap sampel uji untuk memperoleh persamaan regresi linier y = ax + b. Analisis IC 50 dihitung berdasarkan persamaan regresi linier yang didapatkan dengan memplot konsentrasi larutan uji dan persen peredaman DPPH sebagai parameter aktivitas antioksidan. Konsentrasi larutan uji sebagai absis dan persen peredaman sebagai ordinat. Kurva hubungan konsentrasi (mg/l) dengan % inhibisi pada sampel uji ekstrak n- heksana daun kelor disajikan pada Gambar 1 dan kurva hubungan konsentrasi (mg/l) dengan % inhibisi pada sampel uji ekstrak etil asetat daun kelor disajikan pada dapat Gambar 2. Gambar 1. Hubungan dengan % Inhibisi pada UjiEkstrak n-heksana Daun Kelor y = x R² = Gambar 2 Hubungan dengan % Inhibisi pada UjiEkstrak Etil Asetat Daun Kelor Dari Gambar 1dan 2 tentang hubungan konsentrasi (mg/l) dengan % inhibisi pada ekstrak n-heksanadan etil asetat daun kelor, dapat kita lihat bahwa terjadi kenaikan % inhibisi pada setiap kenaikan konsentrasi. Nilai R 2 yang diperoleh pada kurva hubungan konsentrasi (mg/l) dengan % inhibisi pada sampel uji ekstrak daun kelor di atas 0,900 menunjukkan bahwa kurva tersebut linier.kurva hubungan konsentrasi (mg/l) dengan % inhibisi pada vitamin C disajikan pada dapat Gambar 3. Berdasarkan Gambar 3 tentang hubungan konsentrasi (mg/l) dengan % inhibisi pada vitamin C, dapat kita lihat bahwa juga terjadi kenaikan % inhibisi pada setiap kenaikan konsentrasi. Nilai R 2 yang diperoleh pada kurva hubungan konsentrasi (mg/l) dengan % inhibisi pada vitamin C sebesar 0,986 menunjukkan bahwa kurva tersebut linier. y = 7.866x R² =

4 Gambar 3 Hubungan dengan % Inhibisi pada Vitamin C Berdasarkan persamaan regresi sederhana yang telah diperoleh, maka nilai IC 50 dapat dihitung dengan menentukan konsentrasi sampel uji yang menyebabkan persentase peredaman sebesar 50%. Nilai IC 50 dari ekstrak n-heksana dan etil asetat daun kelor serta vitamin C dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2. Nilai IC 50 Ekstrak n-heksana dan Etil Asetat Daun Kelor serta Vitamin C IC 50 (µg/ml) Ekstrak n-heksana daun kelor 459,75 Ekstrak etil asetat daun kelor 192,05 Vitamin C 7, Pembahasan Metode yang digunakan dalam pengujian aktivitas antioksidan dalam penelitian ini adalah metode DPPH (1,1- diphenyl-2-picrylhidrazyl) menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Metode ini dipilih karena merupakan metode yang sederhana, cepat, dan mudah untuk skrining aktivitas penangkap radikal beberapa senyawa. Selain itu metode ini terbukti akurat dan praktis (Prakash dkk., 2001). DPPH adalah radikal bebas yang stabil pada suhu kamar dan berwarna ungu. Apabila DPPH direaksikan dengan senyawa peredam radikal bebas, misalnya flavonoid maka intensitas warna ungu akan berkurang dan bila senyawa peredam radikal bebas yang bereaksi jumlahnya besar, maka DPPH dapat berubah warna menjadi kuning. Perubahan warna ini dapat diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis. DPPH memberikan serapan kuat pada panjang gelombang 517 nm dengan warna violet gelap. Penangkap radikal bebas menyebabkan elektron menjadi berpasangan kemudian menyebabkan penghilangan warna yang sebanding dengan jumlah elektron yang diambil (Sunarni, 2005). Pada sampel yang mengandung senyawa antioksidan, semakin tinggi konsentrasi berarti semakin banyak pula senyawa yang akan menyumbangkan elektron atau atom hidrogennya kepada radikal bebas DPPH, yang turut menyebabkan pemudaran warna pada DPPH. DPPH yang awalnya berwarna ungu tua, jika direaksikan dengan senyawa antioksidan dalam jumlah besar akan berubah menjadi warna kuning. Perubahan warna DPPH ini terkait pula dengan energi yang dimiliki radikal bebas DPPH. Saat berada dalam bentuk radikal, DPPH cenderung tidak stabil (reaktif) dan memiliki energi yang besar karena selalu bereaksi mencari pasangan elektronnya, namun setelah mendapat pasangan elektronnya, DPPH menjadi lebih stabil (energinya rendah). Pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan dengan memipet 2 ml dari masingmasing larutan uji (ekstrak n-heksana, etil asetat dan vitamin C) dan dimasukkan ke dalam vial, ditambahkan 1 ml DPPH 40 ppm kemudiandidiamkan di ruangan gelap selama 30 menit. Tujuandilakukan penyimpanan di ruang gelap ini adalah agar tidak ada radikal yang terbentuk selain radikal bebas DPPH yang sengaja ditambahkan. Karena yang diukur pada penelitian ini adalah berapa konsentrasi DPPH yang tersisa setelah ditambahkan/ bereaksi dengan sampel. Vitamin C digunakan sebagai pembanding karena vitamin C berfungsi sebagai antioksidan sekunder yang berasal dari alam. Besarnya aktivitas peredaman radikal bebas DPPH ditandai dengan nilai IC 50 (50% Inhibitory Concentration). Berdasarkan Tabel 1 diperoleh hasil bahwa terjadi penurunan nilai absorbansi DPPH yang diberi sampel terhadap kontrol pada setiap kenaikan konsentrasi. Penurunan nilai absorbansi DPPH ini mengindikasikan bahwa telah terjadi penangkapan atau peredaman radikal bebas DPPH oleh sampel uji. Penurunan nilai absorbansi ini juga menunjukkan adanya aktivitas antioksidan dari ekstrak n-heksana dan etil asetat daun kelor serta vitamin C. Selain itu dapat dilihat juga bahwa terjadi kenaikan persen peredaman seiring dengan pertambahan nilai konsentrasi. Hal ini menunjukkan bahwa terdapat hubungan antara kenaikan konsentrasi sampel uji dengan peningkatan peredaman radikal bebas. Hubungan tersebut diberikan oleh persamaan regresi linier sampel uji seperti yang tersedia pada Gambar 1-3. Parameter yang umum digunakan untuk mengetahui besarnya aktivitas antioksidan pada suatu ekstrak bahan adalah dengan menentukan nilai inhibitor concentration 50% (IC 50 ) bahan antioksidan tersebut. IC 50 merupakan bilangan yang menunjukkan konsentrasi ekstrak yang mampu menghambat aktivitas radikal sebesar 50% (Molyneux, 2004). Nilai IC 50 diperoleh dari regresi linier dengan mengganti nilai y dengan 50 dari persamaan y= a + bx. Semakin kecil nilai IC 50, maka semakin tinggi aktivitas antioksidan suatu bahan. Nilai IC 50 < 50 ppm menunjukkan kekuatan antioksidan sangat aktif, nilai IC ppm menunjukkan kekuatan antioksidan aktif, nilai IC ppm 401

5 menunjukkan kekuatan antioksidan sedang, nilai IC ppm menunjukkan kekuatan antioksidan lemah, dan nilai IC 50> 500 ppm menunjukkan kekuatan antioksidan tidak aktif (Jun, et. al., 2003).. Ekstrak n-heksana daun kelor mempunyai IC 50 sebesar 459,75 ppm sehingga dapat dikategorikan kekuatan antioksidannya lemah. Ekstrak etil asetat daun kelor mempunyai aktivitas antioksidan sedang dalam menghambat radikal bebas DPPH, karena pada konsentrasi kurang dari 250 ppm telah dapat menghambat 50% radikal bebas DPPH (IC 50 sebesar 192,05 ppm). Berdasarkan Tabel 2 dapat diketahui bahwa ekstrak n-heksana dan etil asetat daun kelor memiliki aktivitas antioksidan jauh lebih rendah dibandingkan aktivitas antioksidan vitamin C sebagai kontrol positifnya yang memiliki aktivitas antioksidan yang sangat kuat dengan nilai IC 50 sebesar 7,85 ppm. Hal ini disebabkan karena pada penelitian ini yang diuji masih berupa ekstrak kasar, sehingga kemungkinan senyawa murni yang dikandung memiliki aktivitas antioksidan yang lebih kuat dibandingkan ekstrak kasarnya. 4. Simpulan Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan maka dapat disimpulkan sebagai berikut. 1. Aktivitas antioksidan pada fraksi semipolar yaitu etil asetat (IC 50 = 192,05 ppm) lebih besar daripada fraksi nonpolar yaitu n-heksana(ic 50 = 459,75 ppm). 2. Aktivitas antioksidan ekstrak n- heksana dan etil asetat daun kelor lebih lemah dibandingkan vitamin C. 5. Ucapan Terima Kasih Ucapan terima kasih disampaikan kepada Lembaga Penelitian UNDIKSHA yang telah mendanai penelitian ini melalui dana penelitian dosen pemula institusi. 6. Daftar Pustaka Blois, M. S Antioxidant Determination by the Use of Stable Free radical. Nature, 181 : Charoensin, S Antioxidant and anticancer activities of Moringa oleifera leaves. J. Med. Plants Res, 8(7): Jun, M.H.Y., Yu. J., Fong, X., Wan, C.S., Yang, C.T., and Ho. (2003). Comparison of Antioxidant activitiesof isoflavonoids from kudzu root(puereria labata Ohwl). J. Food. Sci. Institute of technologist. Vol 68; p Kumalaningsih Antosianin Alami. Surabaya: Trubus Agrisarana. Molyneux, P The Use of the Stable Free Radical Diphenylpicryl-hidrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity, Songklanakarin J. Sci. Technol. 26 (2) Prakash, A., Rigelhof, F., Miller, E Antioxidant Activity. Medallion Laboratories : Analithycal Progress. 19 (2): 1 4. Simbolan, J.M., dkk Cegah Malnutrisi dengan Kelor. Yogyakarta: Kanisius Sunarni, T Aktivitas Antioksidan Penangkap Radikal Bebas Beberapa Kecambah Dari Biji Tanaman Familia Papilionaceae, Jurnal FarmasiIndonesia 2 (2), 2001,