Alamat korespondensi :

Transkripsi

1 Analisa Flow Cytometry pada Subpopulasi Sel T-Limfosit Bursa Fabricius Ayam Pedaging Pasca Infeksi typhimurium dan Pemberian Pakan Tambahan obtusa Septi Utami Dewi 1, Mochammad Sasmito Djati 1, Muhaimin Rifa i 1 1 Jurusan Biologi, Universitas Brawijaya Malang Alamat korespondensi : septiutamidewi@gmail.com ABSTRAK Tujuan penelitian ini adalah mengetahui adanya aktivitas imunomodulator daun obtusa pada organ bursa fabricius ayam pedaging yang terinfeksi bakteri typhimurium, serta mengetahui dosis optimum penambahan daun obtusa dalam mempengaruhi jumlah subpopulasi T-limfosit pada organ bursa fabricius ayam pedaging yang terinfeksi typhimurium. Prosedur kerja yang dilakukan adalah konfirmasi isolat bakteri typhimurium, pemberian daun obtusa, infeksi bakteri typhimurium, pembedahan, isolasi sel, analisis Flow Cytometri, analisis data. Hasil penelitian menunjukkan bahwa Pemberian pakan alami dengan tambahan daun obtusa dengan variasi dosis 0,08%, 0,16%, tidak memberikan pengaruh terhadap jumlah relatif CD8 + dan B220 + pada Bursa fabricius. Sehingga, tidak ada perbedaan yang signifikan antara pakan pabrik dan pakan alami dengan tambahan daun obtusa.. Namun, pada dosis 0,26 % fase finisher terlihat peningkatan jumlah relatif sel CD4 + yang siginifikan dibandingkan fase starter. Dapat disimpulkan bahwa, dosis 0,26% merupakan dosis optimum dalam meningkatkan proses proliferasi jumlah sel CD4 + sebagai agen imunomodulator pada bursa fabricius ayam pedaging. Kata kunci : Ayam pedaging, bursa fabricius, flow cytometry, obtusa, typhimurium typhymurium ABSTRACT This study aimed to determine the development of T lymphocytes from bursa fabricius of broiler that have been given additional feed obtusa after infected typhimurium and determine the optimum dose of the addition of leaf obtusa in influencing the number of T-lymphocyte subpopulations in organ bursa fabricius infected broiler. The procedure is the confirmation of the typhimurium isolates, giving the leaves obtusa, typhimurium bacterial infections, surgery, cell isolation, Flow Cytometry analysis, data analysis. The results showed that natural feeding with additional obtusa leaves with a dose variation of 0.08%, 0.16%, does not give effect to the relative amount, CD8 + and B220 + on the Bursa fabricius. There wasn t significant between the feed mill and natural food with obtusa. Dose of 0.26% proved to increase the relative number of CD4 + cells significantly in organ bursa fabricius. The results of CD4 + T cell activation would play an important role in establishing and maximizing the body's immune system. Keywords : broiler, bursa fabricius, flow cytometry, obtusa, typhimurium PENDAHULUAN Indonesia merupakan negara dengan sentra peternakan hewan unggas yang cukup tinggi, salah satunya adalah sentra peternakan ayam pedaging (broiler). Pakan ayam pedaging pada umumnya tersusun atas kebutuhan pertumbuhan, energi, dan membantu sistem metabolisme serta meningkatkan ketahanan tubuh ayam. Oleh sebab itu, para peternak ayam pedaging selalu memberikan vaksin dan antibiotika untuk mengurangi penyakit-penyakit tersebut. Namun, beberapa vaksin dan antibiotika merupakan zat bioaktif yang memiliki dampak negatif pada kesehatan konsumen daging ayam [1]. Sehingga diperlukan adanya alternatif untuk melindungi kesehatan konsumen dari efek samping penggunaan vaksin dan zat antibiotika. Pakan alternatif ini diharapkan dapat meningkatkan sistem kekebalan tubuh ayam. Pakan alternatif tersebut adalah daun Kedondong Laut ( obtusa) yang merupakan salah satu obat herbal dengan kandungan senyawa polysciosida [2]. Senyawa tersebut memiliki peran dalam sistem imunitas dan humoral serta merupakan Jurnal Biotropika Vol. 1 No

2 senyawa dari kelompok asam oleanic saponin. Saponin adalah senyawa yang berperan dalam proses mengalirnya nutrisi pada hewan dan manusia. Saponin juga diketahui dapat berperan dalam permeabilitas membran, sebagai imunostimulan, agen karsinogen, dan hypocholesterolaemic [3]. Selain saponin, terdapat pula flavonoid. Senyawa flavonoid dikenal berperan sebagai agen imunomodulator, antiviral dan antioksidan. Senyawa flavonoid juga diduga dapat memacu proliferasi limfosit, meningkatkan jumlah sel T dan meningkatkan aktivitas IL-2 [4] Berdasarkan penelitian sebelumnya yang dilakukan dengan menggunakan hewan coba mencit dan terinfeksi typhimurium, khasiat daun obtusa dapat memobilisasi haematopoetic stem cells [5]. Oleh karena itu, penelitian ini menggunakan hewan coba ayam pedaging (broiler) agar lebih aplikatif dan mengetahui secara spesifik pada organ bursa fabricius. Pendewasaan limfosit B terjadi di bursa fabricius pada unggas, sedangkan pada mamalia terjadi di hati fetus, tonsil, usus buntu dan jaringan limfoid dalam dinding usus. Pendewasaan limfosit T terjadi di organ timus [6]. Sehingga diharapkan dapat diperoleh informasi mengenai aktifitas haematopoetic stem cell (CD4 +, CD8 +, B220 + ) dengan infeksi typhimurium dan diamati modulasi serta perkembangan imunitas seluler. METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Percobaan ini dilakukan pada Maret- September 2012 di laboratorium Mikrobiologi, Laboratorium Fisiologi Hewan, Fakultas MIPA, Jurusan Biologi, serta Laboratorium Lapang Sumber Sekar-DAU Fakultas Peternakan, Universitas Brawijaya, Malang. Deskripsi Hewan Coba dan Estimasi Besar Sampel Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah DOC broiler strain Lohman varian platinum. Ayam akan dipelihara selama 1 bulan. Penelitian ini menggunakan 5 perlakuan dengan setiap perlakuan 3 ulangan, dan masing-masing ulangan di duplo. Sehingga jumlah seluru seluruh sampel ayam yang digunakan adalah 60 ekor. Deskripsi Perlakuan dan Rancangan Percobaan Penelitian ini menggunakan rancangan acak kelompok yang terdiri dari 5 perlakuan dengan 3 ulangan pada masing-masing perlakuan seperti pada tabel berikut: Tabel 3.1. Rancangan Kelompok perlakuan Perlakuan Kelompok Starter Finisher Pakan Pabrik A1B1 (T0) A1B2 (T0) Pakan Pabrik+ A2B1 (T1) A2B2 (T1) obtusa (0,08%) + obtusa(0,16%) + obtusa (0,26%) + A3B1 (T2) A5B1 (T3) A7B1 (T4) A3B2 (T2) A5B1 (T3) A7B2 (T4) Pemberian Daun obtusa Bagian tanaman obtusa yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun dewasa. Daun obtusa kemudian dicuci dan dikering anginkan. Kemudian dihaluskan menggunakan blender kering. Hasil tersebut kemudian disaring. Bubuk obtusa ditimbang untuk selanjutnya digunakan sebagai campuran pakan tambahan ayam pedaging. Infeksi bakteri typhimurium typhimurium yang telah dikonfirmasi sebelumnya dan disimpan dalam medium NA miring ditumbuhkan pada medium cair NB dan diinkubasi selama 1 x 24 Jurnal Biotropika Vol. 1 No

3 jam. Medium NB baru tersebut dihitung jumlah sel bakteri tiap 1 jam untuk mendapatkan jumlah sel bakteri 10 8 sel/ml. Perhitungan sel dilakukan dengan menggunakan haemocytometer. Biakan bakteri yang telah difiksasi dengan menggunakan larutan formalin 4%, dihitung dengan menggunakan haemocytometer. Berdasarkan perhitungan tersebut diperoleh jumlah sel bakteri sebanyak 727 sel/ml. Selanjutnya dilakukan sentrifuse dengan kecepatan rpm selama 10 menit pada suhu 25 0 C. Pellet yang diperoleh diresuspensi dengan larutan garam fisiologis NaCl 0,9%. Suspensi trsebut kemudian diinfeksikan pada broiler yang digunakan pada percobaan. Pembedahan Kegiatan ini dibagi menjadi 2 yaitu satu kali pada fase starter dan satu kali pada fase finisher. Pada fase starter pembedahan dilakukan pada saat ayam berumur 17 hari. Selanjutnya pada fase finisher ayam dibedah pada umur 35 hari. Kegiatan ini dilakukan dengan menyembelih ayam pedaging fase stater sejumlah 30 ekor, dan pada fase finisher sejumlah 30 ekor. Setelah disembelih dan diambil organ bursa fabricius, organ tersebut disimpan dalam suhu rendah agar sel-sel pada organ tetap stabil. Selanjutnya, organ tersebut dibawa ke Laboratorium Fisiologi Hewan, Jurusan Biologi Fakultas MIPA, Universitas Brawijaya untuk diisolasi sel dari organ bursa fabricius. Isolasi Sel Sel yang akan dihitung populasinya, diisolasi dari organ bursa fabricius. Sel tersebut digerus dengan menggunakan ujung spuid, dan disuspensi dengan PBS. Selanjutnya sel-sel difilter menggunakan wire. Kemudian hasil yang diperoleh disentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpm pada suhu 20 0 C selama 5 menit. Supernatan yang diperoleh dibuang dan pellet diresuspensi dengan PBS 1 ml. Selanjutnya dilakukan pipeting untuk mendapatkan homogenat, dipindahkan pada mikrosentrifuse baru dan ditambah 500 µl lalu disentrifuse pada kecepatan 1500 rpm, suhu 20 0 C selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pellet selanjutnya diinkubasi dengan antibodi untuk proses analisis selanjutnya. Analisis Flowcytometri Sel yang telah diisolasi dan diperoleh, selanjutnya dianalisis Flow Cytometry untuk mendeteksi subpopulasi T-limfosit (CD4 +, CD8 +, B220 + ). Analisis dilakukan dengan komputer dan diatur pada keadaan acquiring serta dilakukan setting sesuai parameter yang akan dianalisis. Kemudian sampel yang telah diberi antibodi ditambah 1 ml PBS dan ditempatkan pada kuvet flowcytometer. Selanjutnya dipilih acquire dan flowcytometer akan menghitung jumlah sel total serta jumlah sel yang terdeteksi oleh label antibodi. Hasil yang diperoleh akan diolah dengan program BD cellquest Pro TM. Analisis Data Analisis data dilakukan dengan menggunakan metode One Way ANOVA pada program SPSS 16 for Windows. HASIL DAN PEMBAHASAN Senyawa flavonoid yang terkandung dalam daun Polycias obtusa adalah sebagai imunomodulator, yaitu dengan meningkatkan aktivitas IL-2 dan proliferasi limfosit. Telah diketahui bahwa IL-2 adalah sitokin yang berfungsi sebagai salah satu faktor limfosit berdiferensiasi. Resistensi hewan terhadap infeksi mikroba sangat tergantung pada aktivasi dari sel T-CD4 + yang berdiferensiasi menjadi dua kelompok berdasarkan pola sekresi sitokin, yaitu pola respon Th1 dan pola respon Th2 [7]. Ayam adalah salah satu sumber penularan penting typhimurium. Masalahnya berawal dari peternakan, dimana anak ayam yang dipelihara dalam kondisi komersial sangat rentan terhadap infeksi typhimurium karena mikroflora usus lambat berkembang sehingga kalah bersaing jika ada serangan bakteri pathogen enterik [8]. Perbandingan Jumlah Relatif Sel CD4 + Jurnal Biotropika Vol. 1 No

4 Gambar 1. Jumlah Relatif Sel T CD4 + (%) fase (p>0.05) Berdasarkan gambar 1, dapat disimpulkan bahwa semua perlakuan dengan menggunakan pakan pabrik maupun obtusa tidak memberikan pengaruh yang berbeda nyata (p>0,05) dalam meningkatkan jumlah relatif sel CD4 + pada fase starter dan finisher ayam pedaging, khususnya pada organ bursa fabricius. Namun, pada dosis 3 (T4) terlihat peningkatan jumlah relatif sel CD4 + yang siginifikan. Hal ini berarti bahwa, dosis 0,26% merupakan dosis optimum dalam meningkatkan proses proliferasi jumlah sel CD4 + pada bursa fabricius ayam pedaging. Hasil yang tidak signifikan ini disebabkkan karena waktu perlakuan masih dalam tahap adaptasi. Respon imunologik hewan muda masih berada pada tingkatan imunologis paling rendah [9] perlakuan tidak signifikan. Perlakuan T2 memiliki jumlah relatif sel CD8 + lebih tinggi 2,14 % dari perlakuan T1 yang berjumlah 1,09%. Kemudian pada perlakuan T3 mengalami peningkatan sebesar 1,59% jika dibandingkan dengan perlakuan T1. Selanjutnya pada perlakuan T4 juga mengalami peningkatan sebesar 1,84% dibandingkan dengan perlakuan T1. Namun, dari seluruh perlakuan, dosis 1 (T2) memiliki jumlah relatif sel CD8 + yang lebih tinggi. Hal ini dikarenakan bakteri typhimurium merupakan bakteri intraseluler, sehingga tubuh membutuhkan peran dari sel CD8 + yang merupakan sel T sitotoksik yang berperan dalam membunuh sel-sel yang terinfeksi oleh bakteri tersebut. Sehingga pada fase starter, dosis 0,08% optimum untuk meningkatkan jumlah relatif sel CD8 +. Perbandingan Jumlah Relatif Sel B220 + Sel limfosit B berasal dari sumsum tulang belakang dan mengalami pendewasaan pada jaringan ekivalen bursa. Jumlah sel limfosit B dalam keadaan normal berkisar antara 10 dan 15%. Setiap limfosit B memiliki 105 B cell receptor (BCR), dan setiap BCR memiliki dua tempat pengikatan yang identik [10]. Perbandingan Jumlah Relatif Sel CD8 + Gambar 3. Jumlah Relatif sel B220 + pada fase (p>0,05) Gambar 2. Jumlah relatif sel CD8 + (%) bursa fabricius fase (p>0,05) Berdasarkan gambar diatas, jumlah relatif sel CD8 + pada fase starter menunjukkan bahwa perbedaan tiap Berdasarkan Gambar 3, jumlah relatif sel B220 + pada fase starter di semua perlakuan mengalami perbedaan yang tidak signifikan. Perlakuan T2 memiliki jumlah relatif sel B220 + sebesar 7,30% jika dibandingkan T3, T1, dan T4 yang bejumlah 4,17%, 5,22%, dan 1,33%. Hal ini berarti bahwa masing-masing Jurnal Biotropika Vol. 1 No

5 perlakuan tidak berbeda nyata dan tidak berpengaruh terhadap jumlah relatif B Selanjutnya, pada fase finisher mengalami peningkatan jumlah relatif sel B220 + yang cenderung tinggi dibandingkan pada fase starter. Namun, perbedaan jumlah relatif sel antar perlakuan pada fase finisher mengalami perbedaan yang tidak siginifikan tidak memberikan pengaruh terhadap jumlah relatif sel B KESIMPULAN Pemberian pakan alami dengan tambahan daun obtusa dengan variasi dosis 0,08%, 0,16%, tidak memberikan pengaruh terhadap jumlah relatif, CD8 + dan B220 + pada bursa fabricius. Sehingga, tidak ada perbedaan yang signifikan antara pakan pabrik dan pakan alami dengan tambahan daun obtusa. Dosis 0,26% terbukti mampu meningkatkan jumlah relatif sel CD4 + secara signifikan pada organ bursa fabricius. Hasil aktivasi sel T CD4 + akan memainkan peran penting dalam mendirikan dan memaksimumkan sistem kekebalan tubuh. UCAPAN TERIMA KASIH Ucapan terimakasih diberikan kepada Project Staff Research Grant IM-HERE 2011/2012. Fifth Edition. W.B. Saunders Company. California [5]Wulan, S Mobilisasi Hematopoietic Stem Cells dengan Menggunakan Daun Obtusa pada Pakan untuk Meningkatkan Imunitas Seluler Anak Ayam Pedaging. Fakultas MIPA, Universitas Brwijaya. [6] Eerola E, Veromma T, Toivanen P Special Features in The Structural Organization of The Avian Lymphoid System Avian Immunology : Basic and Practice. Boca Raton : CRC Pr. hlm : 9-21 [7] Tizard, I.R Immunology: An Introduction 6 th Ed. New York: Saunders College Publishing. pp [8] Fenner J, Fransk Virologi Veteriner. Edisi ke-2. Harya P, Penerjemah. Semarang : IKIP Semarang Press [9] Thorns, C.J., I.M. Mc Laren, and M.G. Sojka The Use Of Latex Agglutination To Specifically Detect typhimurium Enteritidis. Int. J. Food Microbiol. 21: [10] Samuel, C.E Antiviral actions of interferon. Clinical Microbiol. Rev. 14(4): DAFTAR PUSTAKA [1] Lee, Dhany Vietnamese Ginseng. (Online), ( Overseas - A Worldwide Resource for Vietnamese Culture,Business,andTelecommunicati on/2008/november.mht, diakses tanggal 15 Juli 2012) [2] Huan, V. D.,Satoshi Y., Kazuhiro O., Ryoji K., Kazuo Y., Nguyen T. N., Hoang M. C Oleanane Saponins From Fruticosa.Abstrak Sciencedirect, 15 Juli 2012) [3] Francis, G., Zohar K., Harinder P. S. M., Klaus B The biological action of saponins in animal systems. British Journal of Nutrition, 88: [4] Abbas, A.K., dan A.H. Lichtman Cellular and Molecular Immunology. Jurnal Biotropika Vol. 1 No