BAB I PENDAHULUAN. A. Latar Belakang. penuaan lebih cepat dibandingkan dengan orang lain (Wittenauer dkk., 2015).

Transkripsi

1 BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Proses penuaan dapat dilihat dari perubahan beberapa organ terutama kulit. Seiring bertambahnya usia, fungsi kulit ikut menurun. Sel kulit yang mati melekat lebih lama di lapisan terluar sehingga kulit menjadi kering, kusam dan terasa kasar. Proses penuaan pada setiap orang tidak sama, ada orang yang mengalami proses penuaan lebih cepat dibandingkan dengan orang lain (Wittenauer dkk., 2015). Penuaan terjadi akibat adanya radikal bebas terutama dari sinar UVB yang selanjutnya akan membentuk ROS, pembentukan ROS ini yang dapat menghambat proliferasi sel dan menurunkan aktivitas dari sel fibroblas yang memproduksi kolagen sehingga mengakibatkan terjadinya penuaan dini (Brennan dkk., 2003). Beberapa cara untuk mengurangi kerusakan kulit dari radikal bebas akibat sinar UV yaitu menghindari paparan UV yang berlebihan, pemakaian pelindung sinar UV, pemakaian tabir surya, obat topikal vitamin A atau turunannya, atau obat topikal yang mengandung antioksidan, serta mengkonsumsi antioksidan, baik yang terdapat pada makanan maupun berupa suplemen (Jusuf, 2005). Pengembangan bahan anti aging dari alam sangat diperlukan dikarenakan Indonesia mempunyai kekayaan alam yang sangat melimpah termasuk bahan yang berasal dari laut (kelautan). Perairan Indonesia yang luas ini banyak tumbuh biota laut dan ganggang atau rumput laut. Keberadaan yang besar ini sangat perlu dikembangkan mengingat hasil kelautan di Indonesia belum banyak dimanfaatkan

2 sebagai obat maupun kosmetik. Gammone dan D Orazio, (2015) mengatakan pentingnya ganggang laut sebagai sumber bahan fungsional telah diakui dengan baik karena efek yang menguntungkan dalam kesehatan. Karotenoid laut terbesar dapat ditemukan pada brown algae (rumput laut coklat) seperti Undaria pinnatifida atau Laminaria japonica, dan Hijikia fusiformis (Yu dkk., 2011), Turbinaria decurrens, Padina australis, Hormophysa triquetra (Nursid dkk., 2013). Karotenoid merupakan salah satu senyawa yang mempunyai aktivitas dalam menangkap radikal bebas sehingg memberikan perlindungan secara non-enzimatik. Salah satu kandungan dalam karotenoid yang dimanfaatkan sebagai antioksidan dan anti aging adalah fukosantin. Fukosantin diisolasi dari Laminaria japonica telah dilaporkan dapat menekan aktivitas tirosinase pada marmot yang di radiasi UVB dan melanogenesis pada tikus yang teradiasi UVB. Studi ini menunjukkan bahwa pemberian fukosantin oral mencegah atau meminimalkan efek negatif dari radiasi UV seperti pembentukan melanin. Rumput laut coklat spesies Turbinaria decurrens, Padina australis, dan Hormophysa triquetra terbukti memiliki aktivitas sebagai antioksidan (Nursid dkk., 2013). Selain itu, fukosantin telah terbukti memiliki sifat photoprotective di sel fibroblas manusia melalui penghambatan kerusakan DNA dan meningkatkan aktivitas antioksidan. Sifat protektif pada sel fibroblas dengan mencegah kematian sel akibat paparan sinar UVB dimaksudkan sebagai salah satu potensi anti aging fukosantin yang diisolasi dari ekstrak Sargassum siliquastrum (Heo & Jeon, 2009). Berdasarkan penelitian sebelumnya menyebutkan bahwa ekstrak etanol rumput laut coklat Turbinaria decurrens yang telah diuji secara kualitatif (KLT) dan

3 kuantitatif (KCKT) menghasilkan kandungan fukosantin sebesar 285,47 ± 5,59 mg atau 3,32% dalam 8590 gram ekstrak etanol rumput laut coklat Turbinaria decurrens yang mempunyai aktivitas sebagai antioksidan dan anti aging melalui penghambatan enzim etalase, kolagenase dan tirosinase (Wirasti, 2016). Sehingga pada penelitian ini akan dilakukan penelitian lebih lanjut yang berfokus pada aktivitas ekstrak etanol rumput laut coklat Turbinaria decurrens terhadap viabilitas sel Human Dermal Fibroblast Adult (HDFa) sebagai salah satu uji anti aging. Penentuan aktivitas ekstrak etanol rumput laut coklat (Turbinaria decurrens) yang berpotensi sebagai anti aging dilakukan dengan menghitung persentase viabilitas sel dan IC90. B. Rumusan Masalah Apakah pemberian ekstrak etanol rumput laut coklat Turbinaria decurrens mampu memberikan aktivitas dalam mempertahankan viabilitas sel Human Dermal Fibroblast Adult (HDFa) akibat paparan hidrogen peroksida sebagai salah satu uji anti aging? C. Tujuan penelitian Mengetahui aktivitas ekstrak etanol rumput laut coklat Turbinaria decurrens dalam mempertahankan viabilitas sel Human Dermal Fibroblast Adult (HDFa) akibat paparan hidrogen peroksida sebagai salah satu uji anti aging.

4 D. Manfaat penelitian 1. Manfaat teoritis Melengkapi bukti-bukti ilmiah tentang aktivitas anti aging ekstrak etanol rumput laut coklat Turbinaria decurrens. 2. Manfaat metodologis Memberikan informasi mengenai penggunaan metode kultur sel dengan MTT sebagai salah satu metode uji anti aging untuk bahan-bahan alam yang mangandung banyak senyawa. 3. Manfaat praktis Memberikan tambahan informasi kepada masyarakat mengenai potensi rumput laut coklat sebagai sumber anti aging alami. E. Keaslian penelitian Sampai saat ini, belum ada laporan penelitian tentang uji aktivitas terhadap viabilitas sel Human Dermal Fibroblast Adult (HDFa) sebagai salah satu uji anti aging dengan menghitung persentase viabilitas sel dan nilai IC90 dengan variasi konsentrasi dari ekstrak etanol rumput laut Turbinaria decurrens yang di uji menggunakan MTT (3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida) dan diukur menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm.

5 F. Tinjauan Pustaka 1. Rumput laut coklat Turbinaria decurrens a. Taksonomi dan kandungan Turbinaria decurrens merupakan salah satu spesies dari rumput laut yang mempunyai kadar fukosantin tinggi. Turbinaria mengandung asam lemak, tanin, fenol, asam alginat, laminarin, steroid, manitol, mineral (termasuk Ca, Cu, Fe, I, K, Mg, Na, Zn), fitohormon (auksin, sitokinin, giberelin) dan pigmen (karoten, klorofil a, klorofil c dan fukosantin) (PROSEA, 2016). Taksonomi dari Turbinaria decurrens yaitu : Kingdom Phylum Class Orde Family Genus Species Sinonim : Chromista : Ochrophyta : Phaeophyceae : Fucales : Sargassaceae : Turbinaria : Turbinaria decurrens : Turbinaria vulgaris var decurrens (bory) J. Agardh (Silva dkk., 1996)

6 b. Fukosantin a). Biosintesis Fukosantin Diatom, mikroalga uniseluler tertutup dalam frustule silicaceous, menghasilkan fukosantin, meskipun jalur biosintesis untuk xantofil tidak diketahui di fitoplankton tersebut. Menurut analisis genom dua spesies, T. pseudonana dan P. Tricornutum (Armbrust dkk., 2004); (Bowler dkk., 2008) dua jalur yang berbeda diusulkan, yaitu hipotesis diadinosantin dan hipotesis neosantin (Gambar 1). Gambar 1. Hipotesis mengenai jalur biosintesis fukosantin (A) Hipotesis Diadinosantin:β - karoten diubah menjadi fukosantin dan diatosantindari diadinosantin ; (B) Hipotesis Neosantin: β karoten diubah menjadi fukosantin dan diadinosantin dari neosantin diolah dari Mikami dan Hosokawa, (2013)

7 Hipotesis diadinosantin melibatkan konversi berurutan violasantin untuk diadinosantin, yang merupakan prekursor fukosantin. Hipotesis neosantin, di sisi lain, mengusulkan percabangan dari jalur dari neosantin untuk kedua diadinosantin dan fukosantin. Hipotesis kedua sepenuhnya mendukung usulan (Mikami dan Hosokawa, 2013) jalur untuk rumput laut coklat; yaitu turunan diadinosantin dan fukosantin dari neosantin (gambar 1). b). Struktur dan metabolisme fukosantin Karotenoid yaitu sekelompok zat fitokimia yang bertanggung jawab untuk warna makanan dan memainkan peran penting baik dalam pencegahan penyakit manusia dan pemeliharaan kesehatan yang baik. Menurut struktur kimianya dibagi menjadi karoten dan xanthophylls. Karoten tidak mengandung oksigen, yang larut dalam lemak dan larut dalam air. Berbeda dengan karotenoid lain, xantofil, mengandung oksigen dan dengan demikian sifat hidrofobik kecil. Karoten termasuk beta-karoten dan likopen. Xantofil adalah pigmen kuning yang pembentukan dari band kuning terlihat pada kromatografi awal pigmen daun. Struktur molekulnya mirip dengan karoten, tetapi xantofil mengandung atom oksigen, sedangkan karoten adalah murni hidrokarbon tanpa oksigen. Xantofil mengandung oksigen baik sebagai kelompok hidroksil atau pasangan atom hidrogen yang diganti dengan atom oksigen yang bertindak sebagai jembatan (epoksida). Untuk alasan ini, sifatnya menjadi lebih polar daripada karoten hidrokarbon murni, dan perbedaan ini yang memungkinkan pemisahan mereka dari karoten dengan berbagai jenis kromatografi (Gammone dan D Orazio, 2015).

8 Pada umumnya karoten lebih berwarna oranye dari xanthophylls. Kelompok xanthophylls meliputi fukosantin, lutein, zeasantin, neosantin, cantasantin, violasantin, capsorubin, astaksantin, α- dan β- criptosantin, yang merupakan xantofil hanya dikenal mengandung cincin beta ionone. Dalam spesies lain dari mamalia, xanthophylls tertentu dapat dikonversi menjadi analog hidroksilasi retina. Mereka memiliki potensi biologis antioksidan karena struktur kimianya dan interaksi dengan membran biologis. Sifat antioksidan dianggap sebagai mekanisme utama yang bermanfaat untuk kesehatan. Sedangkan sifat reduktif dapat menjelaskan efek fisiologis sebagai antioksidan. Secara umum, konsentrasi karotenoid dalam plasma darah mencerminkan konsentrasi makanan yang tertelan (Gammone dan D Orazio, 2015). Fukosantin (Gambar 2) adalah xantofil, strukturnya berbeda termasuk ikatan yang tidak biasa yaitu ikatan allenic, kelompok epoksida, dan gugus karbonil terkonjugasi dalam rantai poliena dengan sifat antioksidan (Maeda dkk., 2008; Maeda dkk., 2009; Takaichi, 2011). Gambar 2. Struktur molekul Fukosantin (Mikami,2013). 2. Khasiat dan manfaat Fukosantin, sebuah karotenoid spesifik yang ditemukan dalam rumput laut coklat, makroalga, diatom, mikroalga, dan mempunyai sifat biologis yang luar biasa

9 (Peng dkk., 2011). Memiliki struktur yang unik termasuk ikatan allenic dana 5,6- monoepoxide dalam molekul. Fukosantin adalah salah satu yang paling berlimpah dari jumlah karotenoid >10 % dari estimasi total produksi alam karotenoid yang ada (Maeda dkk., 2008). Sejumlah penelitian telah menunjukkan bahwa fukosantin memiliki potensi yang cukup besar dan menjanjikan dalam aplikasi kesehatan manusia. Bioaktivitas dari fukosantin termasuk antioksidan, anti-inflamasi, antikanker, anti-obesitas, antidiabetes, antiangiogenik dan antimalaria, dan efek pelindung pada hati, pembuluh darah otak, tulang, kulit,dan mata (Yamamoto dkk., 2011). Fukosantin menghambat aktivitas tirosinase, melanogenesis di melanoma dan pigmentasi kulit yang diinduksi UVB. Pemberian topikal dari fukosantin (1%) secara signifikan menekan ekspresi mrna siklooksigenase (COX)-2, endotelin reseptor A, reseptor P75 neurotrophin (NTR), prostaglandin E reseptor 1 (EP1), melanocortin 1 reseptor (MC1R) dan protein-tirosinase yang terkait. Hasil ini menunjukkan bahwa fukosantin menunjukkan aktivitas anti-pigmen oleh pemberian topikal atau oral pada melanogenesis yang diinduksi UV-B (Shimoda dkk., 2010). Paparan kronis ultraviolet B (UVB) pada kulit menginduksi stress oksidatif, hal ini penyebab utama kanker kulit. Alga coklat pada kulit merupakan sumber potensial untuk antioksidan dan anti apoptosis, karena memproduksi senyawa pelindung terhadap faktor lingkungan, termasuk radiasi UV. Undaria Crenata (UCE) yang termasuk alga coklat berefek menghentikan aktivitas 1,1-difenil-2- pikrilhidrazil spesies oksigen radikal reaktif dan menginduksi intraseluler hidrogen

10 peroksida dan sinar UVB. UCE mengurangi apoptosis induksi UV-B, seperti yang ditunjukkan oleh penurunan apoptosis dan fragmentasi inti dan DNA, sehingga terjadi pemulihan viabilitas sel. UCE juga menurunkan tingkat stres oksidatif karena induksi UVB pada tingkat lipid, protein, dan DNA seperti yang ditunjukkan oleh penurunan di 8-isoprostan, karbonilasi protein dan DNA. Hal ini menunjukkan bahwa UCE mampu melindungi keratinosit manusia terhadap stres oksidatif karena induksi UVB (Hyun dkk., 2013). 3. Ekstraksi Ekstraksi merupakan suatu metode penyarian zat-zat aktif dari bagian tanaman obat, hewan dan beberapa jenis ikan termasuk biota laut. Zat-zat aktif terdapat di dalam sel, namun sel tanaman dan hewan berbeda ketebalannya, sehingga diperlukan metode ekstraksi dengan pelarut tertentu dalam mengekstraksi. Ekstraksi dalam penelitian bertujuan untuk menarik komponen kimia yang terdapat pada bahan alam. Ekstraksi ini didasarkan pada prinsip perpindahan massa komponen zat ke dalam pelarut, dimana perpindahan mulai terjadi pada lapisan antar muka kemudian berdifusi masuk ke dalam pelarut. Terdapat berbagai macam jenis ekstraksi, salah satunya ekstraksi secara maserasi. Ekstraksi secara maserasi merupakan cara ekstraksi paling sederhana. (Harbone, 1987) 4. Maserasi Maserasi adalah proses pengekstrakan simplisia dengan menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan (kamar). Maserasi bertujuan untuk menarik zat-zat berkhasiat yang tahan

11 pemanasan maupun yang tidak tahan pemanasan. Secara teknologi maserasi termasuk ekstraksi dengan prinsip metode pencapaian konsentrasi pada keseimbangan (Depkes RI, 2000). Maserasi berasal dari bahasa latin Macerace berarti mengairi dan melunakan. Dasar dari maserasi adalah melarutnya bahan kandungan simplisia dari sel yang rusak, yang terbentuk pada saat penghalusan, ekstraksi (difusi) bahan kandungan dari sel yang masih utuh (Voigh, 1994). 5. Ekstrak Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang terisi diperlakukan sedemikian sehingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Depkes RI, 1995). Ekstrak dikelompokan atas dasar sifatnya, yaitu (Voight, 1995): a. Ekstrak encer adalah sediaan yang memiliki konsistensi semacam madu dan dapat dituang. b. Ekstrak kental adalah sediaan yang dilihat dalam keadaan dingin dan tidak dapat dituang. Kandungan airnya berjumlah sampai 30%. Tingginya kandungan air menyebabkan ketidakstabilan sediaan obat karena cemaran bakteri. c. Ekstrak kering adalah sediaan yang memiliki konsistensi kering dan mudah dituang, sebaiknya memiliki kandungan lembab tidak lebih dari 5%.

12 d. Ekstrak cair, ekstrak yang dibuat sedemikiannya sehingga 1 bagian simplisia sesuai dengan 2 bagian ekstrak cair. Proses ekstraksi dapat melalui tahap dari pembuatan serbuk, pembasahan, penyarian, dan pemekatan. Sistem pelarut yang digunakan dalam ekstraksi harus dipilih berdasarkan kemampuannya dalam melarutkan jumlah yang maksimum dari zat aktif dan yang seminimum mungkin bagi unsur yang tidak diinginkan (Depkes RI, 2000). 6. Kulit Kulit merupakan organ tubuh yang terletak paling luar dari lingkungan hidup yang membatasi dari lingkungan hidup manusia. Luas kulit orang dewasa kira-kira 15% berat badan. Kulit juga sangat kompleks, elastis dan sensitive, bervariasi pada keadaan iklim, umur, seks, ras, dan juga tergantung pada lokasi tubuh (Djuanda dkk., 1999). Secara garis besar kulit tersusun dari tiga lapisan utama yaitu: 1. Lapisan epidermis merupakan lapisan luar kulit yang tipis dan avaskuler. Lapisan penyusun epidermis mengalami regenerasi setiap 4-6 minggu. Lapisan ini tediri dari stratum korneum, stratum lusidum, stratum granulosum, stratum spinosum dan stratum basal. a. Stratum corneum (lapisan tanduk) adalah lapisan kulit terluar yang terdiri dari sel keratinosit, mudah terkelupas dan terus berganti. b. Stratum lusidum berupa garis translusen, biasanya terdapat pada kulit tebal telapak kaki dan telapak tangan. Tidak tampak pada kulit tipis.

13 c. Stratum granulosum terdiri dari 3-5 lapis sel polygonal gepeng, dengan inti ditengah dan sitoplasma terdiri oleh granula basofilik kasar yang dinamakan granula keratohialin. Granula ini mengandung protein kaya histidin. d. Stratum spinosum atau lapisan Malphigi terdiri berkas-berkas filament yang dinamakan tonofibril. Pada lapisan ini terdapat sel Langerhans. e. Stratum basal merupakan satu lapis sel yang mengandung melanosit dan diperbaharui setiap 28 hari untuk migrasi ke permukaan. Pada lapisan ini terjadi aktifitas mitosis yang hebat dan bertanggungjawab dalam pembaharuan sel epidermis secara konstan (Djuanda dkk., 1999). 2. Lapisan dermis Lapisan dermis merupakan lapisan di bawah dermis yang jauh lebih tebal daripada epidermis. Lapisan ini terdiri dari lapisan elastik dan fibrosa padat dengan elemen-elemen selular dan folikel rambut. Secara garis besar dibagi menjadi dua bagian yakni: a. Pars papilare yaitu bagian tipis mengandung jaringan ikat jarang, berisi ujung serabut saraf dan pembuluh darah. b. Pars retikulare adalah bagian tebal terdiri dari jaringan ikat padat, berisi kelenjar sebasea, kelenjar keringat dan folikel rambut (Djuanda dkk., 1999). 3. Lapisan subkutis Lapisan subkutis merupakan lapisan di bawah dermis, terdiri atas jaringan ikat longgar berisi sel-sel lemak di dalamnya. Sel-sel lemak merupakan sel bulat, besar, dengan inti terdesak ke pinggir sitoplasma lemak yang bertambah. Lapisan sel-sel lemak disebut penikulus adipose, berfungsi sebagai cadangan makanan. Di lapisan

14 ini terdapat ujung-ujung saraf tepi, pembuluh darah dan getah bening. Tebal tipisnya jaringan lemak tidak sama bergantung pada lokasinya. Di abdomen dapat mencapai ketebalan 3 cm, berbeda dengan daerah di kelopak mata yang sangat sedikit jaringan lemaknya (Djuanda dkk., 1999). Lapisan kulit pada manusia mempunyai peranan yang sangat penting, selain fungsi utama yang menjamin kelangsungan hidup juga mempunyai fungsi sebagai proteksi, absorbsi, ekskresi, persepsi, pengaturan suhu tubuh (termoregulasi), pembentukan pigmen, pembentukan vitamin D dan keratinisasi (Djuanda dkk., 1999). 7. Penuaan dini Penuaan dini adalah proses penuaan kulit yang lebih cepat dari waktunya (Noormindhawati, 2013). Penuaan dini bisa terjadi pada siapa saja terutama di Indonesia yang merupakan daerah beriklim tropis dengan sinar matahari berlimpah. Proses degeneratif kulit yang terlalu sering terpapar sinar ultraviolet berlangsung lebih cepat (Muliyawan dan Suriana, 2013). Anti aging atau anti penuaan adalah sediaan yang berfungsi menghambat proses kerusakan pada kulit (degeneratif), sehingga mampu menghambat timbulnya tandatanda penuaan pada kulit (Muliyawan dan Suriana, 2013). Penuaan pada kulit adalah suatu mekanisme biologis yang ditandai dengan adanya perubahan struktur maupun elastisitas kulit, yang terjadi bersama dengan waktu sebagai bagian dari proses penuaan fisiologis (intrinsik) maupun yang dipicu oleh efek dari luar (ekstrinsik) (Pinnell, 2003). Penuaan kulit pada dasarnya terbagi menjadi 2 kelompok, yaitu penuaan intrinsik/kronologi (chronological aging)

15 merupakan proses penuaan yang berlangsung secara alamiah yang disebabkan berbagai faktor dari dalam tubuh sendiri, seperti genetik, hormonal, dan ras. Fenomena ini tidak dapat dicegah dan penuaan ekstrinsik (photoaging) yang disebabkan oleh faktor eksternal seperti sinar matahari/ultraviolet, polusi udara, suhu, asap rokok, alat elektronik, nutrisi yang tidak seimbang dan berbagai faktor eksternal lainnya yang dapat mempercepat proses penuaan kulit sehingga terjadi penuaan dini. Proses ini dapat dicegah dengan menghindari faktor-faktor yang mempercepat proses tersebut (Jusuf, 2005). Salah satu penuaan ekstrinsik bisa disebabkan karena adanya radikal bebas yang menyebabkan penuaan dini. Adanya radikal bebas yang terdapat dalam tubuh dapat menimbulkan berbagai kerusakan baik pada sel maupun jaringan. Tubuh mempunyai sistem perlindungan endogen terhadap adanya senyawa radikal bebas. Sistem perlindungan tersebut berupa perlindungan secara enzimatik dan nonenzimatik. Perlindungan secara enzimatik dapat berupa enzim-enzim dalam tubuh yang dapat mengubah senyawa radikal bebas menjadi senyawa yang tidak berbahaya bagi tubuh. Enzim katalase dapat mengubah hidrogen peroksida yang bersifat radikal menjadi air dan oksigen (Kang dkk., 2006). Perlindungan secara non-enzimatik berupa senyawa-senyawa yang mempunyai aktivitas dalam menangkap radikal bebas seperti senyawa polifenol, asam askorbat dan karotenoid (Yoo dkk., 2008). Secara klinis pada penuaan ekstrinsik (terutama akibat radiasi sinar UV), kulit menjadi kering, kasar, tidak merata, warnanya tidak merata (hipo/hiperpigmentasi), terjadi kerutan yang dalam atau atrofi yang parah, pembentukan lentigo solaris,

16 timbulnya lesi kulit premalignan, tidak elastis dan kaku, serta leathery appearance (Pinnell, 2003). 8. Radikal bebas Radikal bebas adalah molekul yang pada orbit terluarnya mempunyai satu atau lebih elektron tidak berpasangan (Chen dkk., 1996). Elektron tidak berpasangan pada radikal bebas bersifat tidak stabil dan reaktif (Valko dkk., 2006). Radikal bebas dapat bersumber dari dalam tubuh (endogen) yang dihasilkan oleh proses respirasi aerobik sel mitokondria, fagositosis sel lasing, sel peroksisom dan enzim sitokrom p450. Radikal bebas dapat berupa reactive oxygen species (ROS) dan reactive nitrogen species (RNS) (Valko dkk., 2006). a. Reactive oxygen species (ROS). Oksigen yang sangat esensial bagi kehidupan, ternyata mempunyai peranan dalam kematian sel dan jaringan. Oksigen dalam bentuk molekul (dioksigen) mempunyai konfigurasi elektron yang unik dan bersifat radikal. Penambahan satu elektron pada molekul dioksigen dapat membentuk radikal anion superoksida. Radikal anion superoksida dihasilkan dari proses metabolisme aerobik atau dari radiasi fisik terhadap molekul dioksigen. Superoksida yang dihasilkan disebut sebagai ROS primer. Senyawa ROS primer yang bersifat reaktif akan berinteraksi dengan senyawa lain membentuk ROS sekunder (Valko dkk., 2006). Di dalam tubuh, radikal bebas sebagian besar dihasilkan oleh mitokondria melalui proses respirasi aerobik, dimana terjadi proses reduksi oksigen menjadi air. Pada proses respirasi aerobik terbentuk senyawa

17 intermediet ROS seperti anion superoksida, hidrogen peroksida, dan hidroksi radikal (Birben dkk., 2012). Senyawa H2O2 bersifat relatif permeabel terhadap membran sel, kurang reaktif dan merupakan radikal lemah dengan waktu paruh yang lama (Ryter dkk., 2007). Dengan adanya katalis logam seperti Fe, tingkat ketoksikan H2O2 terhadap sel menjadi lebih tinggi karena diubah menjadi molekul yang lebih reaktif (Mates dkk., 1999) melalui reaksi Fenton: H2O2 + Fe 2+ Fe 3+ + OH + OH (1) b. Reactive nitrogen species (RNS). Senyawa NO dihasilkan oleh nitric oxide synthetases (NOSs). Enzim NOSs dapat mengubah L-arginin menjadi L sitrulin (Sugamura dan Keany, 2011). NO berperan sebagai molekul sinyal dalam berbagai proses fisiologis, seperti neurotransmiter, pengaturan tekanan darah, mekanisme pertahanan tubuh, relaksasi otot polos, dan regulasi sistem imun. Waktu paruh senyawa NO hanya beberapa detik pada media air. Senyawa NO lebih stabil pada lingkungan dengan konsentrasi oksigen rendah. Senyawa NO mudah larut baik dalam air dan lemak, sehingga mudah berdifusi melalui membran sitoplasma (Valko dkk., 2006). Selain dari dalam tubuh (endogen), radikal bebas juga dapat bersumber dari luar tubuh (eksogen). Radikal bebas eksogen berasal dari menghirup asap rokok, paparan ozon, hiperoksia, radiasi sinar pengion, dan ion logam berat (Birben dkk., 2012). Spesies radikal bebas dapat menimbulkan beberapa akibat seperti proses adaptasi dengan meningkatkan sistem pertahanan antioksidan serta menimbulkan kerusakan jaringan misalnya kerusakan DNA, lipid, dan protein.

18 a. Kerusakan DNA. Senyawa radikal dapat merusak basa DNA, memecah rantai DNA, kesalahan penyandian gen dan dapat mengakibatkan terjadinya mutagenesis. Radikal bebas seperti OH dan H dapat bereaksi dengan basa DNA dan atom hidrogen senyawa gula yang terikat pada basa DNA. Atom C4-C5 basa pirimidin sangat sensitif terhadap serangan radikal bebas. Reaksi oksidasi basa pirimidin oleh radikal bebas menghasilkan senyawa seperti timin glikol, residu urea, 5-hidroksideoksiuridin, dan 5- hidroksideoksisitidin. Reaksi oksidasi basa purin oleh radikal bebas dapat menghasilkan senyawa seperti 8-hidroksideoksiguanosin (8-OhdG), 8- hidroksideoksiadenisin, dan formamidopirimidin. Senyawa 8-OhdG berhubungan dengan proses karsinogenesis dan digunakan sebagai marker adanya oksidasi DNA (Nisha dan Deshwal, 2011). Fragmentasi DNA oleh radikal bebas menyebabkan aktivasi enzim poli ADP-ribosa sintetase yang berfungsi dalam sistem repair DNA. Adanya kerusakan yang parah pada DNA membuat sel tidak dapat berfungsi secara normal dan mati (Sarma dkk., 2010). b. Peroksidasi membran lipid. Senyawa radikal bebas seperti ROS dan RNS dapat mengoksidasi membran sel yang terdiri atas fosfolipid. Senyawa fosfolipid mengandung asam lemak tak jenuh yang peka terhadap serangan radikal bebas. Proses oksidasi lipid terdiri dari (1) inisiasi, yaitu pembentukan radikal asam lemak tak jenuh oleh senyawa radikal bebas, (2) propagasi, radikal asam lemak tak jenuh bereaksi baik dengan oksigen maupun asam lemak lain membentuk peroksida lipid, dan (3) terminasi,

19 pembentukan asam lemak non-radikal akibat adanya dua radikal asam lemak yang bereaksi (Schafer dkk., 2000). Adanya kerusakan membran lipid dapat menyebabkan fluiditas dan permeabilitas membran terganggu. Kerusakan membran lipid juga menyebabkan terganggunya fungsi protein yang terikat pada membran seperti enzim dan reseptor (Sarma dkk., 2010). c. Kerusakan protein. Senyawa radikal bebas dapat menyerang protein, membuat protein mengalami fragmentasi, cross-linking dan modifikasi molekul protein. Reaksi antara protein dan radikal bebas dapat membentuk protein hidroperoksida yang bersifat reaktif dan dapat menginisiasi pembentukkan radikal bebas baru (Devasagayam dkk., 2004). Kerusakan pada protein dapat mengganggu fungsi enzimatik dan mengganggu proses signaling yang diperantarai oleh reseptor protein (Sarma dkk., 2010). Pengaruh senyawa radikal pada protein kolagen dan elastin menyebabkan fragmentasi protein kolagen dan elastin, menyebabkan kulit menjadi keriput dan kasar (Kammeyer dan Luiten, 2015). Senyawa radikal bebas lebih lanjut dapat menimbulkan kematian sel baik secara apoptosis maupun secara nekrosis (Halliwell, 1992). 9. Fibroblas Fibroblas adalah jenis sel utama dalam dermis. Fibroblas memproduksi kolagen, elastin, protein matriks lainnya, dan enzim seperti kolagenese dan stromelysin. Di dalam dermis juga terdapat sel mast, leukosit polimorfonuklear, limfosit dan maktofag (Baumann dan Saghfari, 2009).

20 Fibroblas merupakan sel yang banyak terdapat pada jaringan ikat terutama pada kulit. Sel fibroblas terlibat secara aktif dalam pembentukan serat-serat terutama serat kolagen dan matriks amorf ekstraseluler. Selain itu fibroblas menghasilkan serat-serat retikulin, elastin, glikosamin, dan glikoprotein dari substansi interseluler amorf. Fibroblas terlibat pada pertumbuhan normal, proses penyembuhan luka dan aktifitas fisiologis dari tiap jaringan dan organ dalam tubuh. Fungsi utama fibroblas adalah menjaga integritas jaringan pendukung dengan cara mengatur perubahan umur matriks ekstraseluler secara berkesinambungan (Freshney, 2005). Sel fibroblas mudah untuk dikultur karena memiliki kemampuan tumbuh dan melekat yang tinggi dan regenerasi cepat (Freshney, 2005). Kultur sel fibroblas telah banyak digunakan antara lain untuk penelitian proses penyembuhan luka, mekanisme penuaan kulit. Metode ini banyak digunakan untuk melihat perkembangan sel proliferasi kinetik seluler serta biosintesis komponen matriks ekstraseluler (Akira, 1998). Sel fibroblas memiliki bentuk aktif dan bentuk tidak aktif. Bentuk aktif disebut sel fibroblast sedangkan bentuk tidak aktif disebut sel fibrosit (Junquieira dan Carneiro, 2005) (Gambar 3). Fibroblas meiliki aktivitas sintesis yang giat, mempunyai banyak prosesus sitoplasmik tidak teratur, nucleus berbentuk bulat telur, besar dan berwarna muda dengan kromatin halus dan suatu nukleolus yang jelas, sitoplasma penuh dengan retikulum sitoplasmik granuler dan apparatus golgi berkembang dengan baik (Harjana, 2011). Fibrosit berukuran lebih kecil dari pada fibroblas dan cenderung berbentuk kumparan serta mempunyai prosesus lebih sedikit dari fibroblas, mempunyai nukleus berbentuk panjang dan lebih kecil dari

21 fibroblas, sitoplasma asidopilik, mempunyai retikulum endoplasmik granuler dan aparatus golgi yang kurang berkembang jika dibanding dengan fibroblas, pada kondisi tertentu untuk kepentingan sintesis, suatu fibrosit bisa menjadi aktif sebagai fibroblas (Harjana, 2011). A B Gambar 3. Sel Fibroblas (A) dan Fibrosit (B) (Junquieira dan Corneiro, 2005) Sel yang diperoleh secara langsung dari pasien dan tumbuh pada medium kultur disebut sebagai kultur primer. Berbeda dengan biakan keratinosit, fibroblas lebih mudah tumbuh dan dapat dilakukan subkultur. Subkultur fibroblas dilakukan dengan memindahkan fibroblas murni dari petridesk kultur primer ke dalam medium segar kemudian ditempatkan dalam petridesk baru untuk memulai pertumbuhan kembali. Media yang banyak digunakan untuk transport dan media pertumbuhan fibroblas adalah Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM), atau Roswell Park Memorial Institute (RPMI). Medium ini ditambahkan penisilin, streptomisin dan fetal bovine serum (FBS) atau fetal calf serum (FCS) (Yuli dkk.,

22 2015). Kultur sel adalah teknik yang biasa digunakan untuk mengembangkan sel diluar tubuh (in vitro). Keuntungan penggunaan kultur sel adalah lingkungan tempat hidup sel dapat dikontrol dan diatur sehingga kondisi fisiologi dari kultur relatif konstan. Kelemahan teknik tersebut adalah sel yang dikultur mengalami perubahan sifat karena perkembangbiakan sel dalam tubuh (in vivo) bekerja secara terintergritas dalam satu jaringan, sedangkan dalam kultur sel terpisah-pisah. Kondisi lingkungan kultur harus dibuat semirip mungkin dengan lingkungan awal di dalam tubuh supaya sel tumbuh dengan baik (Zarisman, 2006). 10. Viabilitas sel Viabilitas sel adalah kemungkinan sel untuk dapat hidup setelah terpapar suatu bahan. Uji viabilitas ini dilakukan dengan menguji sampel menggunakan suatu stressor penginduksi toksisitas pada sel. Adanya sel yang bertahan hidup ditentukan dengan MTT assay. Viabilitas sel pada penelitian ini diukur dengan MTT assay yaitu suatu metode yang digunakan untuk mengetahui aktivitas selular setelah terpapar dengan bahan uji berdasarkan aktivitas succinic dehydrogenase mitokondria sel yang mengubah methylthiazole tetrazolium berwarna kuning menjadi kristal formazan ungu. Senyawa yang terlibat dalam proses reduksi garam tetrazolium adalah nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH), dan suksinat. Proses ini dapat terjadi jika sel masih dapat beraktivitas. Perubahan warna yang terjadi, diukur dengan menggunakan microplate reader pada panjang gelombang nm. Kemudian hasilnya dipresentasekan terhadap kontrol (Riss dkk., 2015).

23 Gambar 4. Struktur MTT dan produk formazan (Riss dkk., 2015) Pengukuran dilakukan menggunakan ELISA reader. ELISA adalah suatu teknik deteksi dengan metode serologis yang berdasarkan atas reaksi spesifik antara antigen dan antibodi, mempunyai sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi dengan menggunakan enzim sebagai indikator. Prinsip dasar ELISA (Burgess G.W., 1995) adalah analisis interaksi antara antigen dan antibodi yang teradsorpsi secara pasif pada permukaan fase padat dengan menggunakan konjugat antibody atau antigen yang dilabel enzim. Enzim ini akan bereaksi dengan substrat dan menghasilkan warna. Warna yang timbul dapat ditentukan secara kualitatif dengan pandangan mata atau kuantitatif dengan pembacaan nilai absorbansi (OD) pada ELISA plate reader (Burgess, 1995). G. Landasan Teori Berdasarkan penelitian sebelumnya uji aktivitas antioksidan dan anti penuaan dini rumput laut coklat Turbinaria decurrens (Wirasti, 2016) menyebutkan bahwa ekstrak etanol rumput laut coklat Turbinaria decurrens yang telah diuji secara kualitatif dan kuantitatif mengandung fukosantin sebesar 3,32% yang memiliki aktivitas antioksidan dan anti penuaan dini. Pada penelitian terdahulu dalam Nursid

24 (2013) menyebutkan bahwa kandungan fukosantin dalam rumput laut coklat Turbinaria decurrens memiliki bioaktivitas yang sangat baik seperti antioksidan (Nomura dkk., 1997), antikanker (Yoshiko & Hoyuku, 2007), anti sinar ultraviolet (Urikura dkk., 2011) dan sebagai antitumor HeLa (tumor serviks) dan T47D (tumor payudara). Penelitian lain yang dilakukan oleh Heo & Jeon (2009) mengatakan bahwa ekstrak metanol Sargassum siliquastrum yang mengandung fukosantin dimanfaatkan untuk melindungi sel fibroblas manusia akibat UV-B. Evaluasi kemampuan melindungi sel fibroblas menggunakan metode 2,7 - dichorodihydrofluoroscein diacetate (DCFH-DA), 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl) 2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) dan cornet assay. Hasilnya menunjukkan bahwa ROS yang diproduksi akibat radiasi UV-B berkurang sangat signifikan. Peningkatan jumlah sel yang bertahan hidup dapat mencapai 87,47 % akibat efek dari fukosantin. Peningkatan jumlah sel fibroblas yang betahan hidup menunjukkan bahwa ekstrak metanol S.siliquastrum yang mengandung fukosantin dapat mengurangi adanya kerusakan kolagen yang diproduksi oleh sel fibroblas kulit manusia dimana hal ini berperan dalam proses penuaan. Dengan peningkatan sel fibroblas yang bertahan hidup menunjukkan bahwa ekstrak metanol S.siliquastrum yang mengandung fukosantin dapat berpotensi sebagai anti aging (Heo & Jeon, 2009). Namun sampai saat ini, belum ditemukan penelitian mengenai aktivitas ekstrak etanol rumput laut coklat T.decurrens terhadap viabilitas sel Human Dermal Fibroblast Adult (HDFa) akibat paparan hidrogen peroksida sebagai salah satu uji anti aging.

25 H. Hipotesis Ekstrak etanol rumput laut coklat Turbinaria decurrens memiliki aktivitas dalam mempertahankan viabilitas sel Human Dermal Fibroblast Adult (HDFa) akibat paparan hidrogen peroksida sebagai salah satu potensi anti aging.