BAB II TINJAUAN PUSTAKA

Transkripsi

1 BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Bahan Tambahan Pangan Bahan tambahan pangan (BTP) dalam Peraturan Menteri Kesehatan RI No.772/Menkes/Per/IX/88 dan No.1168/Menkes/PER/X/1999, adalah : Bahan yang biasanya tidak digunakan sebagai makanan dan biasanya bukan merupakan komponen khas makanan, mempunyai atau tidak mempunyai nilai gizi, yang dengan sengaja ditambahkan ke dalam makanan untuk maksud teknologi pada pembuatan, pengolahan, penyiapan, perlakuan, pengepakan, pengemasan, penyimpanan atau pengangkutan makanan untuk menghasilkan atau diharapkan menghasilkan (langsung atau tidak langsung) suatu komponen atau mempengaruhi sifat khas makanan tersebut. Bahan tambahan pangan berdasarkan keberadaannya dalam makanan pada umumnya dapat dibagi menjadi dua golongan besar, yaitu: 1. Bahan tambahan pangan yang ditambahkan dengan sengaja kedalam makanan, dengan mengetahui komposisi bahan tersebut dan maksud penambahan untuk mempertahankan kesegaran, cita rasa, dan membantu pengolahan. Contoh: pengawet, pewarna dan pengeras. 2. Bahan tambahan pangan yang tidak sengaja ditambahkan, akibat perlakuan selama proses produksi, pengolahan dan pengemasan, dapat pula merupakan residu dari bahan yang sengaja ditambahkan. Contoh: residu pestisida, antibiotik dan hidrokarbon aromatik polisiklis (Cahyadi, 2009). Penambahan bahan pangan dalam proses produksi pangan perlu diwaspadai bersama, baik oleh produsen maupun konsumen. Dampak 5

2 penggunaannya dapat berakibat positif maupun negatif bagi masyarakat dan sebaiknya dengan dosis dibawah ambang batas yang telah ditentukan. Jenis bahan tambahan pangan berdasarkan dampak penggunaannya ada dua jenis, yaitu: GRAS (Generally Recognized as Safe), zat ini aman penggunaannya dan tidak bersifat toksik dan jenis lainnya yaitu ADI (Acceptable Daily Intake), jenis ini selalu ditetapkan batas penggunaan hariannya demi menjaga atau melindungi kesehatan (Cahyadi, 2009). Penggolongan bahan tambahan pangan yang diizinkan ditambahkan dan yang dilarang, oleh Departemen Kesehatan diatur dengan Peraturan Menteri Kesehatan Republik Indonesia No. 722/MenKes/Per/IX/1988, disebutkan bahwa: Golongan bahan tambahan pangan yang diizinkan diantaranya sebagai berikut: antioksidan; antikempal; pengatur keasaman; pemanis buatan; pemutih dan pematang telur; pengemulsi, pemantap, dan pengental; pengawet; pengeras; pewarna; penyedap rasa dan aroma, penguat rasa; dan sekuestran. Selain itu, golongan bahan tambahan yang dilarang digunakan dalam makanan yaitu: natrium tetraborat; formalin; minyak nabati yang dibrominasi; kloramfenikol; kalium klorat;dietilpirokarbonat; nitrofuranzon; P-phenetilkarbamida; asam salisilat dan garamnya. 2.2 Pengawet Pengawet merupakan bahan tambahan pangan yang ditambahkan secara sengaja kedalam makanan. Dalam Peraturan Menteri Kesehatan Republik Indonesia No.722/Menkes/Per/IX/1988, disebutkan bahwa: Penambahan pengawet dimaksudkan untuk menghambat ataupun menghentikan aktivitas 6

3 mikroorganisme seperti bakteri, kapang dan khamir sehingga produk makanan dapat disimpan lebih lama. Efektifitas dari bahan pengawet yang ditambahkan tergantung terutama pada konsentrasi bahan pengawet yang digunakan, komposisi bahan makanan dan tipe organisme yang akan dihambat (Buckle, 1987). Konsentrasi bahan pengawet yang diizinkan ditambahkan selama proses pengolahan sifatnya adalah menghambat pertumbuhan mikroorganisme dan bukannya mematikan organismeorganisme pencemar. Oleh karena itu, sangat penting bahwa populasi mikroorganisme dari bahan pangan yang akan diawetkan harus dipertahankan minimum dengan cara penanganan dan pengolahan secara higienis. Jumlah bahan pengawet yang diizinkan akan mengawetkan bahan pangan dengan muatan mikroorganisme yang normal untuk suatu jangka waktu tertentu, tetapi kurang efektif jika dicampurkan kedalam bahan-bahan pangan yang membusuk atau terkontaminan secara berlebihan (Nurwantoro, 1999). 2.3 Nitrit dan Nitrat Nitrit dan nitrat terdapat dalam bentuk garam kalium dan natrium nitrit. Natrium nitrit berbentuk butiran berwarna putih dan kalium nitrit berwarna kuning atau putih dengan kelarutan dalam air yang cukup tinggi (Pratiwi, 2008). Garam nitrit atau nitrat selama dalam saluran pencernaan dapat mengalami perubahan oleh mikroba.yang terdapat di dalam makanan berasal dari pemakaian nitrit sebagai pengawet sekaligus pemberi warna cerah pada daging olahan (bacon) dan daging kaleng (Silalahi, 2006). Nitrit dan nitrat adalah senyawa nitrogen yang terdapat di alam. Kalium/natrium nitrit dan kalium/natrium nitrat (nitrit dan nitrat dalam bentuk 7

4 garamnya) telah digunakan dalam daging olahan (curing) selama berabad-abad di berbagai negara, termasuk Indonesia. Nitrit merupakan senyawa nitrogen yang reaktif. Sumber utama nitrit secara umum adalah makanan, terutama sayuran dan air minum. Hal yang perlu diperhatikan adalah pemakaian pupuk pada sayuran. Jika pupuk urea banyak digunakan, akan menyebabkan paparan pada manusia melalui sayuran, terutama sayuran yang berwarna hijau serta sayuran dari umbi dan air minum (Cassens, 1995). Sifat-sifat nitrit sebagai bahan pengawet, antara lain: a. Nitrit yang ditambahkan dalam bahan pangan sebelum bahan pangan tersebut dipanaskan bisa meningkatkan daya awet 10 kali lebih lama daripada bahan pangan dipanaskan terlebih dahulu selanjutnya ditambahkan nitrit. b. Selama penyimpanan mengakibatkan konsentrasi nitrit semakin menurun c. Sifat anti-botulinum nitrit tidak dipengaruhi oleh ph, kandungan garam, suhu inkubasi, jumlah spora Clostridium botulinum (Nurwantoro, 1999). Nitrit dan nitrat dapat terbentuk secara alamiah dalam lingkungan dan juga sengaja ditambahkan pada beberapa makanan olahan seperti daging olahan dan awetan dimana nitrit berfungsi sebagai pengawet dan pewarna. Nitrit dan nitrat sebagai pengawet makanan yang diizinkan, tetapi perlu diperhatikan penggunaannya dalam makanan agar tidak melampaui batas, sehingga tidak berdampak negatif bagi kesehatan manusia (Walters, 1996). 2.4 Nitrit dan Nitrat dalam Daging dan Hasil Olahannya Curing adalah suatu proses pengolahan yang dapat menghambat pertumbuhan organisme melalui penggunaan garam nitrit dan nitrat dan juga 8

5 berfungsi untuk mempertahankan warna daging. Manfaat melakukan curing adalah untuk mempertahankan warna yang stabil, aroma, tekstur dan kelezatan yang baik, dan untuk mengurangi pengerutan daging selama proses pengolahan, serta memperlama masa simpan produk daging (Soeparno, 1992). Penggunaan nitrit dan nitrat dalam proses pengolahan daging dapat dikombinasikan. Namun, nitrat sudah tidak lazim penggunaannya didalam proses pengolahan daging, meskipun selama proses pengolahan nitrat dapat terbentuk secara tidak sengaja (Soeparno, 1998). Tujuan pengguanaan nitrit dalam pengolahan daging ialah menghambat pertumbuhan bakteri klostridium botulinum, memperthankan warna merah daging agar tampil menarik, dan juga sebagai pembentuk cita rasa (Nurwantoro, 1999). Penggunaan nitrit berdasarkan Permenkes No.722/Menkes/IX/1988, adalah: Batas maksimum penggunaan nitrit pada kornet daging sapi adalah 50 mg/kg dan pada daging olahan dan daging awetan termasuk daging asap adalah 125 mg/kg. Sedangkan penggunaan nitrat pada daging olahan dan daging awetan termasuk kornet dan daging asap memiliki batas maksimum yakni 500 mg/kg Daging Daging adalah merupakan bahan pangan yang diperoleh dari hasil penyembelihan hewan-hewan ternak atau buruan. Hewan-hewan yang khusus diternakkan sebagai penghasil daging adalah berbagai spesies mamalia seperti: sapi, kerbau, kambing domba dan babi dan berbagai spesies unggas seperti ayam, kalkun dan bebek atau itik (Koswara, 2009). Daging menempati kedudukan penting dalam menu makanan, karena rasanya lezat dan merupakan sumber zat gizi utama, yaitu protein (Moehyi, 9

6 1992). Protein merupakan salah satu komponen zat makanan yang penting bagi tubuh karena berperan dalam pertumbuhan sel, pengganti sel yang rusak dan sebagai bahan bakar dalam tubuh. Pigmen dalam otot daging terdiri dari protein yang disebut mioglobin. Mioglobin dengan oksigen akan membentuk oksimioglobin yang berwarna merah terang. Warna merah dari oksimioglobin tidak stabil, dan dengan oksidasi berlebih akan membentuk methemoglobin yang berwarna coklat (Lawrie, 2003) Kornet Kornet daging sapi dalam Standar Nasional Indonesia (SNI) tahun 2006 adalah: Produk yang dibuat dari daging sapi segar atau beku, tanpa tulang, boleh dicampur dengan daging bagian kepala dan jantung yang memenuhi persyaratan dan peraturan berlaku, dengan atau tanpa penambahan bahan tambahan pangan yang diijinkan melalui proses curing dan dikemas dalam wadah kedap udara (hermetis) dan disterilkan. Bahan dasar pembuatan kornet adalah daging sapi yang digiling dan bahan tambahan lainnya adalah garam dapur, nitrit, alkali fosfat, bahan pengisi, air, lemak gula (SNI, 2006). Cara pembuatan kornet daging sapi yaitu: daging sapi yang sudah digiling dimasukkan ke dalam mixer, lalu ditambahkan bumbu, dan bahan lainnya menjadi adonan yang homogen. Agar emulsi tetap terjaga stabilitasnya, pencampuran harus dilakukan dengan suhu rendah (10º-16ºC). Emulsi daging yang telah terbentuk selanjutnya diisikan ke dalam kaleng yang sebelumnya telah disterilkan dengan panas. Setelah ditutup, kaleng beserta isinya disterilisasi dengan cara memasukkan kaleng ke dalam retort dan dimasak pada suhu 120ºC dan tekanan 0,55 kg/cm 2, 10

7 selama 15 menit. Agar daging tidak mengalami pemanasan yang berlebihan, kaleng yang telah disterilkan harus segera didinginkan di dalam bak pendingin yang berisi air selama menit. Setelah permukaan kaleng dibersihkan dengan lap hingga kering, produk siap untuk diberi label dan dikemas (Anonim, 2012) Burger Daging burger berasal dari daging sapi yang sudah digiling dan diberi bumbu garam, merica dan pala. Agar bentuknya agak kaku dan mudah dibentuk maka tambahan suwiran kecil roti tawar putih. Setelah daging giling dan bumbu terduk rata, masukkan kedalam plastik atau cetakan lonjong kemudian dikukus. Setelah matang iris sesuai selera tebal tipisnya (Momies, 2005). Penggunaan nitrit dalam pengolahan burger terutama berfungsi sebagai pengawet. Bahan utama dalam burger disamping daging murni, daging berlemak juga ditambahkan untuk memberi rasa lezat. Daging hewan yang berbeda akan memberikan rasa yang berbeda dan produk yang berbeda dalam perbandingan protein dan juga lemak daging (Kramlich, 1978). 2.5 Kadar Nitrit dan Nitrat dalam Daging Penelitian tentang penetapan kadar nitrit dalam daging olahan telah dilakukan sebelumnya. Diantaranya pada sampel kornet daging sapi, daging burger sapi dan sosis daging sapi. Metode yang dipakai pada pemeriksaan kornet daging sapi, daging burger sapi dan sosis daging sapi tersebut adalah spektrofotometri sinar tampak dimana digunakan pereaksi asam sulfanilat dan NED. Hasil pemeriksaan kadar nitrit dan nitrat pada daging olahan secara spektrofotometri sinar tampak dapat dilihat pada Tabel

8 Dari Tabel 2.1 dapat dilihat bahwa pemeriksaan kadar nitrit (daging burger sapi dan sosis daging sapi) dan nitrat (sosis daging sapi, kornet daging sapi dan daging sapi asap) oleh Lusiana dan Matondang masih memenuhi persyaratan untuk dikonsumsi karena kadarnya berada di bawah batas maksimum yang diizinkan yaitu 125 mg/kg (nitrit) dan 500 mg/kg (nitrat) sedangkan kadar nitrit kornet daging sapi (Rangkuti, 2008), burger daging sapi (Lestari, 2011) dan sosis daging sapi (Lusiana, 2013) melebihi batas persyaratan yang ditetapkan oleh Permenkes No. 722/Menkes/IX/1988. Tabel 2.1 Hasil pemeriksaan kadar nitrit dan nitrat pada daging olahan secara spektrofotometri sinar tampak No Sampel Kornet daging sapi Burger daging sapi Sosis daging sapi Kornet daging sapi Daging sapi asap Kadar (mg/kg) Persyaratan Nitrit Nitrat (mg/kg) Rujukan 70,34-109,75-50 Rangkut i, ,65-109, Lestari, ,96-107, Lusiana, - 2,00-47, ,95-34, ,69-32, Matond ang, 6,63-17, ,73-6, Efek Positif Nitrit dan Nitrat Penggunaan nitrit dalam makanan olahan terutama bertujuan sebagai pengawet yang hingga saat ini efektif digunakan untuk menghambat pertumbuhan mikroba patogen terutama Clostridium botulinum (Lawrie, 2003). Mikroba patogen paling berbahaya yang terdapat di dalam daging adalah Clostridium botulinum. Nitrit menghambat produksi toksin Clostridium botulinum dengan menghambat pertumbuhan dan perkembangan spora dan/atau dengan cara 12

9 membentuk senyawa penghambat yang akan terbentuk bila nitrat dalam daging dipanaskan (Soeparno, 1992). Peranan nitrit yang berhubungan dengan cita rasa adalah sifat nitrit sebagai antioksidan yaitu nitrit akan menghambat oksidasi lemak yang akan membentuk senyawa-senyawa karbonil seperti aldehid, asam-asam dan keton yang menyebabkan bau dan rasa tengik (Soeparno, 1992). Penambahan nitrit pada daging olahan dapat memberi warna merah yang menarik pada daging olahan. Pigmen dalam otot daging terdiri dari protein yang disebut mioglobin. Mioglobin dengan oksigen akan membentuk oksimioglobin yang berwarna merah terang. Warna merah dari oksimoglobin tidak stabil, dan dengan oksidasi berlebih akan membentuk methemoglobin yang berwarna coklat (Lawrie, 2003). Nitrogen monoksida merupakan suatu radikal bebas yang dapat terjadi didalam tubuh, dapat terbentuk melalui reaksi antara nitrit dan/atau nitrat, serta mempunyai peran yang menguntungkan diantaranya: pengaturan fungsi sel dan viabilitas jaringan (Silalahi, 2006). Nitrogen monoksida juga berperan sebagai vasodilator karena merupakan mediator berbagai bentuk vasodilatasi yang mengatur tekanan darah, bronchodilator, dan juga berperan dalam sistim kekebalan (Silalahi, 2005). 2.7 Efek Negatif Nitrit dan Nitrat Nitrit dapat bereaksi dengan zat-zat yang ada dalam saluran pencernaan. Nitrit juga dapat terbentuk melalui reduksi nitrat oleh bakteri pada infeksi kelenjar kemih. Sintesa nitrit dan nitrat juga terjadi didalam jaringan tubuh mamalia oleh 13

10 bakteri heterotrop. Jika ph lambung meningkat, bakteri akan berkembang yang kemudian dapat mereduksi nitrat menjadi nitrit. Nitrat diabsorbsi dengan cepat pada saluran pencernaan bagian atas, dan sebagian besar dikeluarkan melalui urin. Pengeluaran melalui urin mempunyai waktu paruh sekitar 5 jam. Sebagian nitrat yang diangkut dalam darah dikeluarkan melalui kelenjar ludah. Nitrat yang berada dalam rongga mulut dapat direduksi menjadi nitrit oleh mikroba rongga mulut dan kemudian tertelan. Sebanyak 25% dari asupan nitrat dikeluarkan melalui kelenjar ludah. Sekitar 20% dari nitrat dalam kelenjar ludah direduksi menjadi nitrit, dengan demikian sekitar 5% dari seluruh asupan nitrat akan direduksi menjadi nitrit dalam ludah dan tertelan kembali (Cassens, 1995). Efek negatif dari nitrit dan Nitrat diantaranya yaitu dapat menyebabkan terjadinya methaemoglobinemia dan terbentuknya nitrosamin yang bersifat karsiogenik. 1. Methaemoglobinemia adalah dan berkurangnya kemampuan hemoglobin untuk mengangkut oksigen disebabkan karena hemoglobin terpapar oksidator, termasuk nitrit. Hemoglobin yang di dalamnya ferro (Fe 2+ ) diubah menjadi ferri (Fe 3+ ) menyebabkan kemampuan mengangkut oksigen berkurangdan dan warna darah menjadi coklat. Sebenarnya darah manusia secara normal mengandung methaemoglobin pada konsentrasi tidak melebihi 2%. Tetapi, jika kadarnya meningkat menjadi 20% dapat menyebabkan gangguan pada pengangkutan oksigen yang nyata, namun masih dapat ditoleransi. Darah yang mengandung methaemoglobin yang tinggi disebut methaemoglobinemia, terjadi gejala kulit biru (sianosis), sesak napas, mual dan muntah, serta shock. Kematian dapat terjadi jika kadar methaemoglobin mencapai 70% (Hill, 1996). 14

11 2. Penggunaan nitrit dan nitrat sebagai pengawet untuk mempertahankan warna daging atau ikan ternyata menimbulkan efek yang membahayakan. Nitrit dapat berikatan dengan amino atau amida dan membentuk turunan nitrosamin yang bersifat toksik (Mirvish, 2008). Senyawa nitrosamin yang dihasilkan dari reaksi nitrit dengan amin sekunder merupakan senyawa yang bersifat karsinogenik. Nitrosamin terbentuk melalui reaksi kimia antara agen nitrosasi dan senyawa amin yang mudah dinitrosasi. Pada umumnya, prekursor (bahan baku) pembentuk nitrosamin adalah amin sekunder dan tertier. Agen nitrosasi yang paling penting dalam pembentukan nitrosamin adalah N2O3 yang mudah terbentuk dari nitrit dalam suasana asam sebagai berikut: NO H + HNO 2 HNO2 + H + H2NO2 + H 2 NO NO 2 - N 2 O 3 + H 2 O N2O3 bereaksi dengan pasangan elektron bebas yang ada pada amin sekunder membentuk nitrosamin. R2NH + N2O3 R2N N=O + HNO2 (Winarno, 1992). Kondisi ph juga berpengaruh terhadap reaksi kimia yang dapat berlangsung. Kondisi ph yang optimum untuk nitrosasi senyawa amin sekunder berkisar antar 2,5 dan 3,5 (Winarno, 1992). Amin-amin sekunder yang paling banyak ditemukan dalam daging adalah piperidin, dietil amin, pirolidin, dan dietil amin (Lawrie, 2003). 15

12 Untuk mencegah terbentuknya nitrosamin maka dianjurkan untuk menambahkan zat yang dapat menghambat proses tersebut misalnya penambahan vitamin C dan vitamin E (Cassens, 1995). 2.8 Analisis Nitrit dan Nitrat Analisis Secara Kualitatif Pemeriksaan kualitatif nitrit dapat dilakukan dengan menggunakan pereaksi asam sulfanilat dan N-(1-naftil) etilen dihidroklorida (NED). Larutan yang mengandung nitrit dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan beberapa tetes asam sulfanilat dan NED lalu dikocok, dibiarkan beberapa menit, terbentuk warna ungu merah (Vogel, 1979). HSO 3 NH 2 +HNO 2 HSO 3 N + Cl+ 2H 2 O Asam sulfanilat N Garam diazonium HSO 3 N + Cl + NHCH 2 CH 2 NH 2 N Garam diazonium NED HSO3 N = N NHCH2CH2NH2 + HCl Senyawa azo (merah) Reaksi antara nitrit dengan asam sulfanilat dan NED (Roth dan Gottfried, 1998). 16

13 Pemeriksaan kualitatif nitrat dapat dilakukan dengan mereduksi nitrat menjadi nitrit menggunakan logam Zn, pereaksi asam sulfanilat dan NED. Larutan yang mengandung nitrat direduksi menjadi nitrit dengan cara ke dalam filtrat dimasukkan sedikit logam Zn dalam larutan asam asetat. Kemudian nitrat dapat dideteksi memakai pereaksi asam sulfanilat dan NED, warna ungu merah menunjukkan adanya nitrat Analisis Secara Kuantitatif Penetapan kadar nitrit dan nitrat dapat dilakukan dengan metode spektrofotometri sinar tampak dan volumetrik, yaitu permanganometri dan serimetri (Hess, 2000) Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau serapan suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Spektrofotometer merupakan penggabungan dari dua fungsi alat yang terdiri dari spektrometer yang menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer sebagai alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorpsi. Jika suatu molekul sederhana dikenakan radiasi elektromagnetik maka molekul tesebut akan menyerap radiasi elektromagnetik. Interaksi antara molekul dengan radiasi elektromagnetik ini akan meningkatkan energi dari tingkat dasar ke tingkat tereksitasi (Rohman, 2007). Hukum Lambert-Beer menyatakan bahwa intensitas yang diteruskan oleh larutan zat penyerap berbanding lurus dengan tebal sel dan konsentrasi larutan serta berbanding terbalik dengan transmitan. Cara kerja alat spektrofotometer sinar tampak ini adalah dimana sinar dari sumber radiasi diteruskan menuju monokromator kemudian cahaya dari monokromator diarahkan terpisah melalui 17

14 blanko dan sampel dengan sebuah cermin berotasi. Kedua cahaya lalu bergantian berubah arah karena pemantulan dari cermin yang berotasi secara kontinyu. Detektor menerima cahaya dari blanko dan sampel secara bergantian secara berulang-ulang. Sinyal listrik dari detektor diproses, diubah ke digital dan dibandingkan antara sampel dengan blanko (Rohman, 2007). Apabila radiasi atau cahaya putih dilewatkan melalui larutan yang berwarna maka radiasi dengan panjang gelombang tertentu akan diserap secara selektif dan radiasi sinar lainnya akan diteruskan. Absorbansi maksimum dari larutan berwarna terjadi pada daerah warna yang berlawanan dengan warna yang diamati,dengan kata lain warna yang diserap adalah warna komplementer dari warna yang diamati, (Harris, 1982). Daftar tabel panjang gelombang dan warna komplementernya dapat dilihat pada Tabel 2.2. Tabel 2.2 Daftar panjang gelombang dan warna komplementer Panjang Gelombang Serapan Maksimum (nm) Warna yang Diserap Warna yang Diamati Lembayung (violet) Kuning kehijauan Biru violet Kuning Biru Jingga Hijau kebiruan Merah Hijau Lembayung (violet) Hijau kekuningan Ungu Kuning Biru violet Jingga Biru Merah Hijau kebiruan Ungu Hijau Sumber: Harris, D.C (1982) Metode spektrofotometri sinar tampak digunakan untuk pemeriksaan kuantitatif nitrit dengan pereaksi asam sulfanilat dan NED yang membentuk warna ungu merah dan dapat diukur dengan panjang gelombang maksimum 540 nm (Hess, 2000). Metode ini berdasarkan atas reaksi diazotasi dimana senyawa amin 18

15 primer aromatik dikopling dengan NED. Dengan adanya nitrit maka akan menghasilkan senyawa yang berwarna ungu kemerahan yang dapat diukur secara spektrofotometri sinar tampak. Pada analisis menggunakan alat spektrofotometer sinar tampak dapat dilakukan pemilihan panjang gelombang dan pembuatan kurva kalibrasi. Waktu kerja (operating time) digunakan untuk mengetahui kapan pengukuran dilakukan karena pembentukan warna paling stabil terjadi pada rentang waktu tersebut. Waktu kerja ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu pengukuran dengan absorban larutan. Panjang gelombang yang digunakan adalah panjang gelombang yang memiliki absorbansi maksimum dari suatu larutan baku pada konsentrasi tertentu. Kurva kalibrasi menunjukkan hubungan antara absorbansi dan konsentrasi baku sehingga diperoleh persamaan regresi linier. Persamaan regresi ini dipakai untuk menghitung kadar analit dalam sampel (Rohman, 2007). Logam Zn dapat dipakai untuk mereduksi nitrat menjadi nitrit. Prosedur yang umum dilakukan untuk mereduksi nitrat menjadi nitrit menggunakan reduktor logam Zn dan penentuan hasil nitrit berdasarkan atas reaksi diazotasi dimana senyawa amin primer aromatik dikopling dengan NED. Dengan adanya nitrit akan menghasilkan senyawa berwarna ungu kemerahan yang dapat diukur secara spektrofotometri sinar tampak. Maka kadar nitrat adalah selisih total nitrit sebelum reduksi dengan nitrit sesudah reduksi (Vogel, 1990) 19