I I I. BAHAN DAN METODE

Transkripsi

1 I I I. BAHAN DAN METODE 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Jurusan BDP, Institut Pertanian Bogor, dan berlangsung dari bulan Maret 1989 sawpai dengan bulan Juli Bahan dan Alat Penelitian Bahan Bahan tanaman yang digunakan adafah mbi bawang pu- tih varitas Lumbu Hijau. Benih ini diperoleh dari peta- ni bawang gutih Ciwicfey, Bandung. Medium dasar yang dipergunakan adalah d i m BIfS yaitu difikasi aiedium 35 (Dunstan dan Short, 1977) dan medium AZ (Abo El-Nil dan Zettler, 1976). Komposisi be- dua medim tersebut disajikan dala Tabef Lampiran 1 dan 2. Sebagai bahan pemadat digunakan Agar bacto "Difco" (Difco Lab, Detroit, Michigan, USA) dengan kon- sentrasi 8 g/l. Sukrosa sebanyak 30 gfl digunakan seba- gai sumber energi, sedangkan zat pengatur tumbuh seperti 2,4-D (2,4 -dichlorophenoxyacetic acid), 4 - CPA (4 - chlorophenoxyacetic acid), NAA (naphthaleneacetic acid), BA (6 - Benzyl Adenin), Kinetin (6 - furfurylamino purine), 2-iP (N6-2 - isopentenyl adenin dan Zeatin diberikan sesuai dengan perlakuan..

2 Dalam percobaan ini digunakan juga bahan-bahan untuk mensterilkan bahan tanaman seperti alkohol 70%, fungisida Benlate (2 g/l), Clorox 40%. serta Betadin sebagai bakterisida. Pada saat aklimatisasi digunakan pasir, tanah dan kompos yang steril, pupuk buatan d m Benlate. Untuk rnenguji 'kestabilan genetik dipergunakan 8-hidroksiquinolin sebagai pra perlakuan, sedangkan untuk fiksasi digunah asam asetat 45% satu bagian daa HC1 IN tiga bagian, Zat warna yang digunakan acetuorcein dan kemudian dilakukan metode Squash krosusom (Tabel Lampiran 3) Alat-alat Alat-alat yang digunakan adalah: autoclave untuk mensterilkan alat-alat (pinset, scalpel, bob1 biakan dan media). Laminar air-flow cabinet dfperguzrahan pada waktu menanam eksplan. Alat diseksi yang dlpergunakan ialah scalpel, pinset, dan gunting. Untuk arengukur be- asaman media digunakan ph meter model SA 520, Orion. Alat pemotret yang digunakan ialah Nikon FX - 35 WA dan mikroskop Nikon - Japan - optiphot. 3.3 Metode Penelitian e Penelitian ini terdiri dari dua macam yaitu: I. Penelitian morfogenesis tidak langsung (MTL) yang terdiri dari dua tahap. Tahap pertama induksi kalus dan tahap kedua regenerasi kalus. 11. Penelitian morfogenesis langsung (ML) dimana tunas langsung terbentuk. Bagan percobaan dapat dilihat pada Gambar 2.

3 Morfogenesis langsung Morf ogenesij langsung Media in& ksi kalus $ Hedia re enerasi $ Media re 1 enerasi Media Fnduksi perakaran (pengamatan j lah kromosom) "$ Aklimatisasi Media induksi pedaran (pengarnatan utalah kronwsoar) i Aklimatisasi Gambar 2, Ragan dari Penelitian Sebelum aaemasuki penelitian terlebih dahuln diada- kan penelitian pendahuluan yang bertujuan untuk menge- tahui selang konsentrasi dari auksin dan sitokinin serta teknik pewarnaan dan pemeriksaan kromosom. Untuk penelitian I yaitu morfogenesis tidak lang-. sung diadakan terlebih dahulu penelitian pendahuluan un- tuk menginduksi kalus. Media dasar yang digunakan ialah media AZ. Auksin yang digunakan untuk induksi kalus ialah 4-CPA (0; 1; 2; 4 mg/l) dan 2,4-D (0; 0,2; 0,5; 1,O mg/l) serta Kinetin (0,l mg/l). Terdiri dari 5

4 perlakuan. Untuk jelasnya komposisi perlakuan untuk induksi kalus dapat dilihat pada Tabel Lampiran 4. Untuk penelitian I1 yaitu morfogenesis langsung (ML) diadakan terlebih dahulu penelitian sebanyak 13 penelitian pendahuluan dengan media dasar BDS dan kombinasi dari NAA (0-1,8 mg/l) + BA (0-18 mg/l). Selain NAA dan BA ada pula yang ditambah dengan zat pengatur tumbuh lain seperti GA (0,1 mg/l). Perlaknaa lahnya ditambah dengan asam amino glutamin ( glisin ( mg/l), ada pula yang ditambah retardan CCC 0,5-1 w/l, dan Coumarin 30 utg/f. Ada pula ditambrth Picloram O,l - 8 wl. Perlakuan lain ialah antara 2-iP (0-10 mg/l) + ficlorm (0,5-8 mg/ll. Selain itu kombinasi antara NAA (0,Ol - 8 W l ) + 2-iP (0,l - 8 mg/l), untuk jelasnya komposisi zat pengatur tumbuh dari penelitian pendahuluan 1 sanxpai peselftian pendahuluan 13, dapat dilihat pada Tabel Lampiran 5 sampai pada Tabel Lampiran 17. Berdasarkan hasil dari penelitian pendahuluan diadakanlah penelitian-penelitian selanjutnya. Untuk morfogenesis tidak langsung diadakan satu penelitian induksi kalus. Komposisi zat pengatyr tumbuh untuk induksi kalus dapat dilihat pada Tabel 1. Untuk penelitian re- generasi kalus ada 2 penelitian komposisi zat pengatur tumbuh yang dapat dilihat pada Tabel 2, dan Tabel 3.

5 Tabel 1. Komposisi Zat Pengatur Tumbuh untuk Induksi Kalus dengan Media AZ Kode per1 akuan Kinetin ( W/l) Tabel 2. Komposisf Zat Pengatur Tumbuh untuk Regenerasi Kalus dengan Media A2 Kode perlakuan Penelitian morfogenesis langsung ada empat peneli- tian (penelitian 2.1; 2.2; 2.3 din 2.4). Komposisi zat pengatur tumbuh untuk induksi tunas langsung dapat di- lihat pada Tabel 4; 5; 6 dan 7.

6 Tabel 3. Komposisi Zat Pengatur Tumbuh untuk Regenerasi Kalus dengan Media MS Kude IAA Kinetin Zeatin perlakuan (mg/l) (mg/l) (mg/l) Tabel 4. Komposisi Zat Pengatur Ttmbuh uatuk Induksi 'funas secara Langsung pada Penelitian 2.1 Kode WM F CI 2-iP Air kelapa Gfisrtia Zeol it per1 akuan (mg/l) (ag/l) (agj1) (1) leg/ t I (g/i t f 0 5 It) Karena hasil dari kombinasi hormon 2-iP + NAA ku- rang baik, demikian juga glisin maka pada penelitian 2.2 tidak digunakan lagi. Kombinasi NAA + BA ditambah, de- mikian juga konsentrasi air kelapa.

7 Tabel 5. Komposisi Zat Pengatur Tumbuh untuk Induksi Tunas seeara Langsung pada Penelitian 2.2 Rode NAA BA Air kelapa Zeolit perlakuan (~/l) (mgfl) (X) (g/l)

8 Konsentrasi NAA 1,35 mg/l, juga BA 7,5 mg/l dan air kelapa 5% belum dicobakan sehingga diadakan penelitian 2.3. Komposisi zat pengatur tumbuh untuk penelitian berikutnya yaitu penelitian 2.3 dan 2.4 dapat dilihat pada Tabel 6 dan 7. Tabel 6. Komposisi Zat Pengatmr Tmtbuh untatk Induksi Tunas secara Lawsmag pada Penelitia-n 2.3 Rode N M BA Air kelapa perlakuan 1 f mg/l) (9) Karena penelitian dengan NAA + BA yang lebih leng- kap belum ada sehingga diadakan penelitian berikut yaitu penelitian 2.4.

9 Tabel 7. Komposisi Zat Pengatur Tumbuh untuk Induksi Tunas secara Langsung pada Penelitian 2.4 Kode perlakuan NhA BA Air kelapa ( mg/l) 1 C%)

10 3.3.1 Rancangan Penelitian Data penelitian dianalisa secara non-parametrik dengan uji tabel kontingensi, untuk jumlah kultur berproliferasi (bertunas) dan jumlah kultur berakar. Untuk jumlah tunas/kultur dan Jumlah akar/kultur diuji dengan prosedur W - Tukey. ' Peldrsanaan Penelitian Mew Pada penelitian f digunakan medium da-sar AZ sedang- kan untuk penelitian 11 digunakan medium BDS. Wntnlr peal- buatan medium, dibuat larutan stok terlebih dahulu agar helarutan setiap unsur yang digunakan lebih baik, juga agar ketelitian unsur yang digunakan lebih tinggi, bask untuk larutan garam maupun untuk larutan hormon. Keasallsan medium diatur Agar bacto "Difco" kemudian ditambahkan dan dipanaskan hingga men- didih sambil terus diaduk. Selanjutnya dimasukkan ke dala botol kultur sebanyak a1 per botol dan di- sterilkan dengan autoklaf pada tekanan 17 psi, 121 c se- lama 30 rnenit. i3a Alat - alat dan P e r s w Semua alat-alat yang akan dipakai untuk memotong eksplan seperti scalpel, pinset, gunting, pisau, dibungkus dengan kertas sampul, dan disterilkan dalam autoklaf pada tekanan 19 psi selama 50 menit.

11 Siung yang digunakan sebagai eksplan adalah siung yang terdapat di bagian luar, sedangkan siung yang terletak di bagian dalam umbi dibuang karena kualitasnya kurang baik. Siung-siung yang telah dipilih ini dibuang kulitnya lalu dicuci dengan detergen agar kotoran-kotoran hilang. Selanjutnjra adalah merendam siung dafam larutan Benlate selama 30 menit - 60 menit, setelah itu dibilas dengan air sterif sebanyak tiga kali. Sterilisasi berikutnya dilakukan di drtlam "Lantiaar air-flow cabinet" yang telah disterilkan dengan sinar UV selama 1 jam. Siung direndaat dalam larutm Clorox 40% selanta 20 menit, kemudian dibilas dengan air steril sebanyak tiga kali. Isolasi eksplan dilakukan dalam cawan petri dengan memotong tunas siung, yang digunakan sebagai eksplan hanya sebagian tunas beserta cakramnya (G-r 1) kirakira 0.5 cm panjangnya. Eksplan ditanam pada btof biakan yang berisi medium sesuai perlakuan. Kultur disimpan pada rak kultur dalam ruangan yang diatur suhunya sekitar 27O~. Lampu TL digunakan sebagai sumber cahaya. Aklimatisasi Sebelum planlet dipindah ke lapang, maka terlebih dahulu diadakan aklimatisasi. Planlet terlebih dahulu direndam dalam larutan Benlate selama kira-kira 5 menit, *

12 selanjutnya ditanam pada media steril campuran.pasir, tanah dan humus dengan perbandingan 1 : 1 : 1. Wadah yang digunakan untuk menanam adalah pot-pot plastik kecil dan kemudian ditutup dengan botol transparan untuk menjaga kelembaban. Setelah 2 minggu tanaman dalam pot dapat dipindahkan ke rumah kaca selama kira-kira 3-4 minggu kemudian tanaman siap dipindahkan ke lapangan Penearnatan Pengamatan untuk welihat kultur yang terkontaminasi dilakukan tiga hari setelah dikulturkan. Sedangkan perrgamatan terhadap pertambahan dan perkembangan eksplan dilakukan 8 minggu setelah dikulturkan dan untuk sefan- jutnya dilakukan setiap 2 minggu. Peubah yang diamati adalah : Untuk penelitian I (MTL): 1. fersentase kultur yang berkalus 2. Berat basah kalus 3. Berat kering kalus dengan mengeringkan kalus dalam oven pada suhu 60O~ selama 24 jam. 4. Kalus yang terbentuk apakah kalus kompak, kalus remah atau kalus embrionik.. 5. Pengamatan jumlah kromosom dilakukan pada planlet yang berasal dari kalus.

13 Untuk penelitian I1 (ML): 6. Pengamatan jumlah kromosom dilakukan pada planlet yang berasal dari morfogenesis langsung. 7. Persentase eksplan yang bertunas 8. Jumlah kultur yang berthas 9. Jumlah tunas/kultkar yang terbentuk 10. Jwnlah kultur yang berakar 11. Jumlah akar/kultur yang terbentuk-