BAHAN DAN METODE Lokasi dan Waktu Bahan dan Alat

Transkripsi

1 17 BAHAN DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian dilakukan di Bagian Teknologi Hasil Ternak, Departemen IPTP Laboratorium Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor (Laboratorium Terpadu Analisis Hasil Ternak dan Laboratorium Pengolahan Susu), dan Laboratorium Pusat Penelitian Bioteknologi, LIPI Cibinong. Penelitian dilaksanakan dari bulan Maret 2009 sampai Januari Bahan dan Alat Sampel kolostrum dan susu kambing dari bangsa Peranakan Etawah (PE) berumur 10 bulan yang berasal dari peternakan perseorangan, Cimahpar (Bogor Utara) yang diberi pakan hijauan berupa rumput lapang dan konsentrat berupa ampas tahu, sampel kolostrum dan susu kambing Jawarandu berumur 9 bulan yang berasal dari peternakan perseorangan di Ciapus (Bogor Selatan), pakan yang digunakan adalah rumput lapang, ampas tahu dan kurma, serta sampel kolostrum dan susu kambing dari bangsa Persilangan Saanen jantan dengan PE betina (SAPE) berumur 10 bulan yang digunakan berasal dari peternakan perseorangan, Cariu (Kabupaten Bogor), yang diberi pakan hijauan berupa rumput lapang dan konsentrat berupa ampas tahu. Sampel kolostrum dan susu yang digunakan merupakan hasil pemerahan hari ke-1 (H1), hari ke-2 (H2), hari ke-3 (H3), hari ke-4 (H4), hari ke-5 (H5), hari ke-6 (H6), hari ke-7 (H7) dan hari ke-8 (H8), sebanyak 150 ml dan sebanyak 250 ml. Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian meliputi bahan kimia untuk uji kualitas susu dan penentuan kadar laktoferin. Bahan-bahan tersebut yaitu H 2 SO 4 91%-92%, fenolftalein, NaOH 0.25 N, NaOH 0.1 N, NaOH 2 N, formalin 40%, 0.4 ml kalium oksalat jenuh, amil alkohol, air deionisasi, NaCl, HCl, NaOH, ethanolamine 20 mmol/l, 10% gel, larutan TCA 12 %, larutan staining Coomassie Blue R-250, larutan metanol:akuades:asam asetat (5:4:1). Buffer yang digunakan adalah Buffer A: ethanolamine 20 mmol/l ph 9.5 dan Buffer B: ethanolamine 20 mmol/l ph NaCl 1 M. Elution buffer yang digunakan adalah gradien Buffer A 100 %, Buffer A 90% + Buffer B 10 %, Buffer A 80% +

2 18 Buffer B 20%, Buffer A 70% + Buffer B 30%, Buffer A 60 % + Buffer B 40%, Buffer A 50% + Buffer B 50%, dan Buffer A 40% + Buffer B 60%. Setiap fraksi protein yang dihasilkan diperiksa dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 280 nm. Peralatan yang digunakan adalah autoclave, refrigerator, freezer, pemanas Bunsen, high speed centrifuge (sentrifugasi dingin Hettich Zentrifugen Mikro 200R), membran dialisis, penukar kation kromatografi dengan menggunakan Hi- Trap Q-SP (GE Healthcare), magnetic stirer, microtube 2 ml dan 50 ml, Bio Rad Mini Protean 3 System, spektrofotometer Genesys UV10R, Corning Steril Syringe Filter 0.2 µm, penangas air, kompor listrik, pipet volumetrik, mikro pipet, butirometer, penyumbat karet, laktodensimeter, ph meter, buret, gelas ukur, gelas piala, labu Erlenmeyer, tabung reaksi, timbangan analitik dan alumunium foil. Perancangan Percobaan dan Perlakuan Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) pola faktorial (3 8) dengan tiga ulangan. Faktor pertama adalah bangsa kambing perah (PE, Jawarandu dan SAPE), dan faktor kedua adalah hari pemerahan (hari ke-1, ke-2, ke-3, ke-4, ke-5, ke-6, ke-7 dan ke-8). Model matematika rancangan penelitian ini menurut Gasperz (1989) adalah: Y ijk = µ + α i + β j + (αβ) ij + ε (ijk) Keterangan : Y ijk = hasil pengamatan kandungan laktoferin pada bangsa kambing perah ke-i dan kelompok ke-j µ = nilai tengah umum α i = pengaruh perbedaan bangsa kambing perah ke-i β j = pengaruh hari pemerahan susu ke-j (αβ) ij = pengaruh interaksi antara bangsa kambing perah yang berbeda ke-i dengan hari pemerahan susu ke-j i = bangsa kambing perah yang berbeda j = hari pemerahan ε ij = pengaruh galat percobaan dari satuan percobaan ke-k yang memperoleh kombinasi perlakuan ij

3 19 Data kandungan nutrisi kolostrum dan susu kambing serta kandungan laktoferin yang didapat dianalisis dengan menggunakan sidik ragam. Apabila hasilnya nyata maka dilanjutkan dengan uji Tukey (Steel dan Torrie, 1995) Peubah Peubah yang diamati meliputi kandungan nutrisi kolostrum dan susu serta konsentrasi laktoferin pada kambing PE, Jawarandu dan SAPE. Kandungan Nutrisi Kolostrum dan Susu Kambing. Kandungan nutrisi kolostrum dan susu kambing PE, Jawarandu dan SAPE, dapat dilihat dari komposisi kolostrum dan susu yang dihasilkan. Penentuan kualitas kimia kolostrum dan susu kambing dapat dilihat melalui komposisinya yang meliputi bahan kering, bahan kering tanpa lemak, kadar lemak, kadar protein, berat jenis dan ph. Kandungan Laktoferin. Whey yang dihasilkan dari sentrifugasi dilakukan pengujian kromatografi untuk mengetahui kadar laktoferin yang terkandung dalam whey dari kolostrum dan susu tersebut. Hasil kromatografi dapat menunjukkan kandungan laktoferin yang berbeda tergantung dari whey kolostrum atau susu serta jenis bangsa kambing perah yang digunakan. Prosedur Pengumpulan Sampel Susu. Sampel susu yang digunakan merupakan sampel individu yang diperoleh dari berbagai bangsa kambing. Susu yang dianalisa antara lain bangsa PE, Jawarandu, Persilangan Saanen Jantan dan PE betina (SAPE), Susu kambing tersebut diperoleh dari beberapa peternakan di Kota Bogor dan Kabupaten Bogor. Peternakan-peternakan antara lain peternakan kambing Jawarandu di Ciapus, Bogor Selatan, peternakan kambing PE di Cimahpar, Bogor Utara dan peternakan kambing SAPE di Cariu, Kabupaten Bogor. Sampel susu diperoleh dalam kondisi beku dan diangkut dengan menggunakan cool box ke laboratorium. Sampel untuk uji kualitas fisik, kimia dan biologi disimpan pada kondisi dingin, sedangkan untuk pengukuran laktoferin jika tidak langsung diuji bisa dibekukan.

4 20 Pengukuran Kadar Lemak Susu Metode Gerber (BSN, 1998a). Susu kambing diambil menggunakan pipet sebanyak ml ke dalam botol butirometer, ditambahkan H 2 SO % sebanyak 10 ml dan 1 ml amil alkohol. Butirometer tersebut disumbat rapat, kemudian dikocok perlahan sampai larutan homogen. Setelah terbentuk warna ungu tua sampai kecoklatan, tabung butirometer dimasukkan ke dalam sentrifuge dan disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan rpm. Tabung butirometer yang telah disentrifugasi dimasukkan ke dalam penangas air selama 5 menit dengan temperatur 65 ºC. Setelah itu kadar lemak dibaca pada skala butirometer, dilakukan penyesuaian untuk mendapatkan skala nol pada batas antara batas lemak dengan zat lainnya dengan cara mengatur sumbat karet. Uji Titrasi Keasaman Soxhlet Henkel (BSN, 1998a). Sebanyak 50 ml sampel susu kambing diambil menggunakan pipet ke dalam labu Erlenmeyer, ditambah 2 ml larutan fenolftalein. Salah satu dari campuran pada labu Erlenmeyer dititrasi dengan menggunakan larutan NaOH 0.25 N hingga terbentuk warna merah muda yang tidak hilang lagi jika dikocok. Derajat Soxhlet (ºSH) adalah banyaknya ml NaOH 0.25 N yang dipakai dikalikan nilai 2. Pengukuran Kadar Protein Susu (Davide, 1977). Pengujian kadar protein susu dilakukan dengan menggunakan metode Titrasi Formol. Sebanyak 10 ml susu dimasukkan dalam labu Erlenmeyer kemudian ditambahkan beberapa tetes fenolftalein 1% dan 0.4 ml kalium oksalat jenuh. Titrasi dengan larutan NaOH 0,1 N sampai timbul warna merah muda. Sebanyak 2 ml formalin 40% ditambahkan, warna merah akan hilang. Titrasi kembali dengan larutan NaOH 0.1 N sampai warna merah muda terjadi. Banyaknya NaOH 0.1 N yang digunakan dicatat. Titrasi blanko dibuat dengan cara sebanyak 10 ml aquadest ditambah dengan 0.4 ml kalium oksalat jenuh kemudian 2 ml formalin 40% dan beberapa tetes fenolftalein 1% ditambahkan. Titrasi dengan NaOH 0.1 N sampai terbentuk warna merah muda. Banyaknya NaOH 0.1 N yang digunakan kemudian dicatat. Rumus perhitungan kadar protein susu adalah:

5 21 Kadar Protein Susu = (p-q) ml x 1.95 (faktor formol) Pemisahan Lemak dan Kasein. Lemak susu kambing dipisahkan berdasarkan Yoshida et al. (2000) yaitu dengan sentrifugasi g pada suhu 4 C selama 30 menit. Susu skim yang dihasilkan diasamkan hingga ph 4.6 dengan penambahan 2 N HCL dan disentrifugasi g pada suhu 4 C selama 30 menit. Endapan kasein dibuang, whey asam yang dihasilkan dinetralisasi ke ph 6.8 dengan 2 N NaOH dan disentrifugasi kembali pada g pada suhu 4 C selama 30 menit. Diagram alir mengenai pemisahan lemak dan kasein dapat dilihat pada Gambar 5. Endapan yang tersisa dibuang sehingga diperoleh whey netralisasi yang bersih dan disimpan di dalam freezer untuk digunakan pada analisis selanjutnya. Isolasi Protein Whey. Susu yang digunakan dalam isolasi laktoferin diantaranya adalah susu dari berbagai bangsa kambing perah, diantaranya adalah susu kambing Peranakan Etawah (PE), kambing Jawarandu dan kambing SAPE. Whey protein diisolasi dengan Hi Trap Q SP Anion Exchange Column (GE Healthcare) dengan gradien NaCl linier. Buffer yang digunakan adalah Buffer A (ethanolanime 20 mmol/l ph 9.5) dan Buffer B (ethanolanime 20 mmol/l ph NaCl 1 M). Metode Spektrofotometri. Fraksi-fraksi protein yang diperoleh dari proses kromatografi selanjutnya diperiksa dengan spektrofotometer untuk penentuan konsentrasi isolat laktoferin yang terkandung dalam fraksi-fraksi protein tersebut. Fraksi protein sebanyak 2 ml dimasukkan ke dalam wadah yang terbuat dari bahan yang tembus pandang atau cuvette, kemudian diperiksa dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 280 nm. Pengukuran protein pada 280 nm didasarkan atas serapan tirosin dan triptofan (Sudarmadji, 1996). Oleh sebab itu masing-masing jenis protein akan memiliki serapan molar berbeda-beda pada 280 nm, maka kurva kalibrasi harus dibuat untuk masing-masing jenis protein murni (Sudarmadji, 1996). Konsentrasi laktoferin pada fraksi protein hasil

6 22 kromatografi diperoleh dari nilai absorbance pada 280 nm dikali faktor yang diestimasi dari laktoferin sapi standar dari Sigma Aldrich Co. Konsentrasi laktoferin (%) = Nilai Absorbance pada 280 nm x 0.07 Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Metode SDS-PAGE dirunning berdasarkan Kunz et al. (1989) yaitu pada 12.5% gel pemisah dan gel penahan (stacking gel) 3%. Setiap fraksi protein ditambahkan dissociation buffer dengan perbandingan 2:1, kemudian dipanaskan dalam penangas air susu 80 C selama 3 menit. Sampel whey susu yang telah disiapkan sebanyak 10 µl dimasukkan ke dalam sumur di gel penahan dan dirunning di dalam 600 ml reservoir buffer pada 35 ma selama 6 jam. Gel difiksasi di dalam larutan TCA 12% selama 4 jam sambil terus digoyang. Pewarnaan dilakukan selama semalaman di dalam larutan staining Coomassie Blue R-250 sebanyak g ditambahkan kedalam ml larutan metanol: akuades:asam asetat (5:4:1). Gel yang telah diwarnai dibilas dengan larutan destaining yaitu dengan larutan metanol:akuades:asam (5:4:1) sambil terus digoyang sampai terbentuk gel dengan latar belakang pita protein-protein dalam keadaan bersih. Bobot molekul ditentukan dengan membuat kurva protein standar (marker) dari bobot molekul yang diketahui, dimasukkan pada Relative Mobility (R m ) yang diperoleh dan Relative Mobility (R m ) protein yang ingin diketahui bobot molekulnya dimasukkan pada kurva tersebut (Gambar 5). Relative Mobility (R m ) dihitung dengan rumus : Relative Mobility (R m ) = Jarak migrasi protein dari awal resolving gel Jarak antara awal resolving gel dengan tracking dye

7 23 Susu normal (Kambing secara individu) Krim kolostrum dan susu dipisahkan melalui sentrifuge (2 000 g, 30 menit pada suhu 4 C) Skim susu normal Ditambahkan 2 N HCl hingga ph 4.6 pada suhu ruang, presipitasi yang terbentuk (kasein) dipisahkan dengan sentrifugasi ( g, 30 menit pada suhu 4 C) Whey asam Netralisasi Whey Asam (susu normal) Netralisasi hingga ph 6.8 dengan 2N NaOH. Presipitasi yang terbentuk dipisahkan dengan sentrifugasi ( g, 30 menit, 4 C) Hi-Trap Q-SP Anion Exchange Column Dengan gradien NaCl Linier Laktoferin Buffer A: ethanolamine 20 mmol/l Buffer B: ethanolamine 20 mmol/l ph NaCl 1 M Rechromatografi dengan Hi-Trap Q-SP Anion Exchange Column Lyiophilisasi Gambar 5 Diagram Alir Isolasi Laktoferin (Yoshida et al. 1991)