HASIL DAN PEMBAHASAN

Transkripsi

1 23 HASIL DAN PEMBAHASAN Kualitas Semen Segar Semen segar dari ketiga jantan yang digunakan mempunyai kualitas baik (Tabel 4). Pemeriksaan makroskopis pada penelitian tahap I dan II yaitu semen berwarna krem dengan konsistensi kental. Kekentalan dan warna menginterprestasikan bahwa konsentrasi spermatozoa tinggi. Hasil tersebut didapatkan dari pemeriksaan mikroskopis bahwa konsentrasi spermatozoa adalah ±657.70x10 6 spermatozoa/ml. Hasil tersebut cenderung sama dibandingkan hasil Dorado et al. (2009, 2010) masing-masing sebesar 3690±80x10 6 spermatozoa/ml dan 3720±100x10 6 spermatozoa/ml, dan lebih tinggi dibandingkan hasil Bezerra et al. (2011) yakni 2400±200x10 6 spermatozoa/ml. Tabel 4 Rataan nilai karakteristik semen segar Karakteristik semen Penelitian tahap Penelitian tahap Rataan I II Makroskopis Volume (ml) 1.14± ± ±0.21 Warna krem krem krem ph 6.73± ± ±0.20 Konsistensi kental kental kental Mikroskopis Gerakan massa Gerakan individu Motilitas (%) 77.78± ± ±2.56 Skor individu 4.78± ± ±0.38 Hidup (%) 85.37± ± ±4.38 Konsentrasi (10 6 /ml) ± ± ± Abnormalitas (%) 6.40± ± ±2.88 Membran plasma utuh (%) 78.43± ± ± (baik): terlihat gelombang cepat dan banyak. Demikian pula hasil pemeriksaan yang didapatkan dari motilitas spermatozoa yaitu 77.78±2.56%, persentase spermatozoa hidup 85.13±4.38% dan persentase membran plasma utuh 77.72±3.52%. Hasil pemeriksaan motilitas spermatozoa yang didapat lebih rendah dibandingkan dengan hasil Dorado et al. (2010) yakni 94.06±0.71% dan Bezerra et al. (2011) yakni 95.00±2.00%. Namun demikian hasil tersebut masih memenuhi syarat untuk pengolahan semen selanjutnya. Dinyatakan oleh Ax et al. (2000) bahwa persentase progresif motilitas spermatozoa normal agar dapat diolah lebih lanjut berkisar antara 70% - 90%. Hasil pemeriksaan spermatozoa hidup yang di identifikasikan dengan warna transparan pada bagian kepala spermatozoa (Gambar 6) didapatkan 85.13±4.38%, hasil tersebut relatif sama dibandingkan dengan hasil penelitian Tambing et al. (2001) dan Rizal et al. (2008), yakni 82.54% dan 83.89%. Persentase spermatozoa hidup lebih tinggi dari pada

2 24 spermatozoa motil karena dari jumlah spermatozoa yang hidup belum tentu semuanya motil progresif (Kostaman dan Sutama 2006). Kualitas spermatozoa juga dapat diukur dengan mengetahui keutuhan dari membran plasma yang berfungsi untuk melihat fungsi spermatozoa masih hidup atau tidak. Hasil pemeriksaan membran plasma utuh (MPU) yang didapatkan 77.72±3.52%, hasil tersebut lebih rendah dibandingkan dengan hasil Tambing et al. (2003) dan Souhoka et al. (2009) masing-masing 82.40±5.08% dan 84.00±1.00%. Secara fisiologis terdapat hubungan antara membran plasma utuh dengan motilitas dan daya hidup spermatozoa. Apabila terjadi kerusakan pada membran plasma dapat menyebabkan hilangnya enzim-enzim yang diperlukan dalam proses metabolisme sehingga tidak dihasilkan energi sehingga motilitas menjadi rendah, serta daya hidup juga akan rendah (Rizal et al. 2003). Beberapa hal yang dapat mempengaruhi perbedaan kualitas spermatozoa secara keseluruhan antara lain faktor individu, pakan, lingkungan, teknik dan frekuensi koleksi semen, serta kondisi media pengencer diantaranya ph dan tekanan osmotik. a b Gambar 6 Spermatozoa hidup dan mati dengan pewarnaan eosin-nigrosin (a) spermatozoa hidup dan (b) spermatozoa mati Ditinjau dari abnormalitas spermatozoa hasil penelitian yang didapat yakni 7.51±2.88%. Abnormalitas yang didapatkan lebih rendah dibandingan dengan hasil Bezerra et al. (2011) dan Dorado et al. (2010) masing-masing yakni 23.90±1.70% dan 13.30±1.05%. Ax et al. (2000) menyatakan bahwa abnormalitas spermatozoa tidak lebih dari 10%. Pengukuran abnormalitas spermatozoa penting dilakukan sebab abnormalitas yang tinggi akan mengganggu fertilitas jantan secara umum, hal tersebut diungkapkan oleh Garner dan Hafez (2000) yang menyatakan bahwa abnormalitas spermatozoa akan mempengaruhi fertilitas jika jumlahnya melebihi 20% dari total spermatozoa. Abnormalitas yang didapat kebanyakan adalah abnormalitas primer dengan rataan 1.09±0.57% dan abnormalitas sekunder 6.42±1.85%. Beberapa abnormalitas primer yang terlihat pada penelitian adalah double head, detached head, abaxial, microcephalus, macrocephalus, narrow, dan pear shaped (Lampiran 7). Sedangkan abnormalitas sekunder yang terlihat adalah teratoid forms, bowed midpiece, coiled

3 25 principal piece, proximal droplet, bent principal piece, pseudodroplet dan distal droplet (Lampiran 8). Abnormalitas primer merupakan ketidaknormalan morfologi spermatozoa yang terjadi ketika spermatozoa masih di dalam tubuli seminiferi (spermatogenesis). Kelompok abnormalitas ini lebih berbahaya karena sebagian bersifat genetik sebagai contoh knobbed acrosome defect yang dapat menurunkan fertilitas sehingga mempengaruhi keberhasilan inseminasi buatan. Semen dengan persentase abnormalitas cukup tinggi cenderung memiliki fertilitas yang rendah karena berkaitan dengan kemampuan mengawali fertilisasi atau memelihara perkembangan embrio. Abnormalitas sekunder merupakan ketidaknormalan morfologi spermatozoa yang terjadi selama spermatozoa melewati saluran reproduksi. Sedangkan abnormalitas tersier merupakan ketidaknormalan morfologi spermatozoa yang terjadi karena perlakuan atau penanganan pada saat penampungan. Preservasi Semen Cair Menggunakan Pengencer Tris-kuning telur dan Trissoya dengan Suplementasi Trehalosa dan Rafinosa Secara umum motilitas spermatozoa lebih lama bertahan dalam pengencer triskuning telur dibandingkan dengan tris-soya. Spermatozoa dapat bertahan sampai kira-kira 50% selama jam dalam pengencer tris-kuning telur, sedangkan pengencer tris-soya hanya bertahan selama jam baik dengan suplementasi rafinosa maupun trehalosa (P<0.05). Hal ini diduga karena pada suhu rendah (5 C) spermatozoa akan mengalami kerusakan akibat terjadinya kejutan dingin (cold shock), dan lesitin pada tris-kuning telur lebih mampu menjaga spermatozoa akibat cold shock daripada lesitin yang terkandung di dalam ekstrak kacang kedelai. Selain itu, dengan menurunkan suhu penyimpanan 5 C, metabolisme akan dihambat sehingga dapat mempertahankan hidup spermatozoa lebih lama dibandingkan dengan penyimpanan pada suhu ruang. Kandungan low density lipoprotein (LDL) dengan komposisi 79% lipid dan 21% protein, dengan komponen lipid utama berupa kolestrol (Botham dan Mayes 2009) yang ada di dalam tris-kuning telur, serta struktur lipoprotein (Lampiran 9) yang memiliki kemiripan dengan struktur membran plasma sehingga LDL yang ada didalam tris-kuning telur dapat melindungi membran sel spermatozoa sehingga lebih mampu menjaga stabilitas membran plasma dibandingkan dengan tris-soya dengan komposisi terbanyak berupa protein, sehingga kerusakan spermatozoa dapat diminimalisasi dengan baik. Meskipun demikian, hal ini membuktikan bahwa pengencer tris-soya memberikan harapan untuk dapat digunakan sebagai pengencer berbasis lesitin nabati untuk semen cair kambing. Suplementasi trehalosa ternyata dapat memperbaiki daya tahan spermatozoa dalam pengencer tris-kuning telur (52.82±3.21%) sampai 84 jam dibandingkan dengan rafinosa dengan persentase yang hampir sama (52.78±4.41%) bertahan sampai 72 jam. Sebaliknya pada pengencer tris-soya, suplementasi rafinosa memperpanjang daya tahan spermatozoa, yaitu 52.78±4.41% sampai 60 jam lebih lama dibandingkan dengan trehalosa (53.33±3.54%) sampai 48 jam (Tabel 5). Hal ini diduga karena dengan ditambahkannya trehalosa ke dalam tris-kuning telur menjadikan kombinasi perlakuan tersebut lebih optimal dalam mempertahankan stabilitas membran plasma sel. Trehalosa adalah salah satu sakarida yang memiliki struktur yang paling stabil dan berperan dalam menstabilkan membran sel (Higashiyama 2002) sehingga bersama-sama tris-kuning telur menunjukkan

4 26 kemampuan yang optimal dalam melindungi sel. Dijelaskan lebih lanjut bahwa trehalosa merupakan gula nonpereduksi dan berfungsi sebagai antioksidan sehingga tris-kuning telur yang disuplementasikan dengan trehalosa tidak mudah teroksidasi dan membran sel spermatozoa tidak mudah rusak. Trehalosa adalah gula yang tidak toksik dan bersifat krioprotektan dengan cara menggantikan atau berasosiasi dengan bound water, dan trehalosa dapat melindungi membran sel dengan cara mengikat air ke protein dan ke ujung polar dari fosfolifid pada membran sel lebih kuat dibandingkan dengan bound water tanpa tambahan trehalosa (bound water saja) (Best c1990). Menurut Viswanath dan Shannon (2000) krioprotektan golongan karbohidrat memiliki kemampuan menggantikan molekul air secara normal dalam kelompok polar hydrated. Sifat-sifat senyawa karbohidrat tersebut akan membantu stabilitas membran plasma sel spermatozoa selama masa transisi melewati zona suhu yang kritis, serta mengubah sifat mekanik pengencer melalui peningkatan viskositas. Aisen et al. (2000) menyatakan golongan karbohidrat disakarida berperan menggantikan posisi air pada permukaan membran plasma sel yang langsung berhubungan dengan pengencer. Selanjutnya dikatakan bahwa disakarida dapat berinteraksi langsung dengan gugus pusat fosfolipid polar selama proses penyimpanan, dan menurunkan interaksi van der Waals diantara rantai karbon. Dalam pengencer tris-soya, suplementasi rafinosa memperpanjang lama penyimpanan spermatozoa dibandingkan dengan trehalosa. Hal ini diduga karena kandungan rafinosa dalam tris-soya yang digunakan lebih banyak mengandung sumber karbohidrat. Rafinosa terdiri dari tiga sakarida yang mempunyai peranan penting pada penyesuaian pengaruh tekanan osmotik. Aktifitas dan sumber energi sakarida dengan berat molekul yang tinggi sangat baik untuk gerakan spermatozoa. Sebagai sumber aktifitas rafinosa yang terdiri dari D-galaktosa, D-glukosa dan D-Fruktosa juga berfungsi menstabilkan kualitas spermatozoa terhadap pengaruh buruk penyimpanan dan pembekuan dalam N 2 cair (Fernández-Santos et al. 2007). Rafinosa yang merupakan golongan gula pereduksi yang ditambahkan ke dalam trissoya yang komponen utamanya adalah protein menjadikan kombinasi perlakuan tersebut lebih optimal dalam menstabilkan membran sel. Karbohidrat molekul besar dapat menyediakan energi dalam jumlah yang cukup banyak yang diperlukan untuk metabolisme dan fisiologi secara normal, namun tidak dapat melewati membran plasma spematozoa (Naing et al. 2010). Pemeriksaan motilitas spermatozoa ditunjang dengan pemeriksaan membran plasma utuh dan spermatozoa hidup. Pemeriksaan membran plasma utuh penting dilakukan karena kerusakan membran plasma akan berpengaruh terhadap motilitas dan daya hidup spermatozoa. Hasil penyimpanan semen cair pada semua pengencer dalam suhu 5 C didapatkan rataan persentase hidup lebih tinggi 6-9% daripada rataan persentase motilitas spermatozoa. Pada pengencer tris-kuning telur didapatkan rataan persentase hidup (59.24%) lebih tinggi daripada rataan persentase motilitas spermatozoa (52.23%), demikian pula pada tris-soya rataan persentase spermatozoa hidup (60.49%) lebih tinggi daripada rataan persentase motilitas spermatozoa (52.41%) (Tabel 6). Hasil rataan persentase membran plasma utuh pada semua pengencer cenderung sama dengan rataan persentase motilitas spermatozoa yang mencapai kira-kira 50%. Pada pengencer tris-kuning telur didapatkan rataan persentase membran plasma utuh (53.80%), sedangkan pengencer tris-soya (54.14%) (Tabel 6).

5 27 27 Tabel 5 Pengaruh pengencer tris-kuning telur dan tris-soya dengan suplementasi trehalosa dan rafinosa terhadap persentase motilitas spermatozoa, persentase spermatozoa hidup dan persentase membran plasma utuh (MPU) Tris-kuning telur Perlakuan Lama penyimpanan (jam) Persentase motilitas progresif spermatozoa (%) (rataan ± standar deviasi) Kontrol 76.67±2.50aM 72.22±2.64 an 70.00±2.50 an 65.56±3.00 ap 61.67±3.54 aq 57.78±3.63 ar 51.11±4.86 as 47.54±4.11 as Trehalosa 77.22±2.64 am 75.56±3.00 amn 73.33±2.50 an 68.89±3.33 ap 66.11±2.20 ap 62.22±2.64 aq 57.78±3.63 ar 52.82±3.21 as Rafinosa 77.22±2.64 am 73.89±2.20 amn 71.11±3.33 an 66.67±2.50 ap 63.89±3.33 ap 58.89±4.17 aq 52.78±4.41 ar 49.57±4.35 ar Tris-soya Kontrol 76.11±2.20aM 66.11±3.33 en 61.67±3.54 ep 56.11±4.86 eq 51.11±4.86 er 45.00±3.54 es 37.78±5.65 et 33.54±3.48 et Trehalosa 77.22±2.64 am 67.78±2.64 en 63.33±3.54 ep 58.89±3.33 eq 53.33±3.54 er 48.33±3.54 es 41.11±4.86 et 37.49±3.41 ev Rafinosa 76.67±2.50 am 70.56±3.00 aen 66.11±3.33 ep 62.78±2.64 ip 57.22±3.63 eq 52.78±4.41 er 46.11±5.46 es 41.73±3.56 es Tris-kuning telur Persentase spermatozoa hidup (%) (rataan ± standar deviasi) Kontrol 84.67±4.20aM 79.09±2.85 an 75.63±3.56 anp 71.52±3.12 apq 67.22±3.68 aqr 63.04±4.24 ars 57.86±5.98 as 53.63±4.86 at Trehalosa 85.27±4.49 am 80.78±2.65 amn 78.69±2.58 an 75.22±3.23 ap 71.68±2.15 apq 69.17±3.35 aq 64.32±3.63 ar 59.38±3.77 as Rafinosa 85.14±4.36 am 80.35±2.58 amn 76.04±3.23 aen 71.60±2.84 ap 69.29±4.71 apq 66.20±5.07 aq 60.50±5.51 ar 55.62±4.78 as Tris-soya Kontrol 84.86±4.23aM 71.47±4.10 en 67.94±3.66 enp 64.11±4.01 epq 59.42±5.23 eq 53.20±6.02 er 45.11±6.40 es 40.23±4.69 es Trehalosa 84.82±4.14 am 73.89±4.59 en 70.44±4.62 ip 66.03±3.07 ap 61.82±3.64 eq 55.41±4.51 er 46.50±5.44 es 43.27±3.75 es Rafinosa 84.94±4.31 am 78.13±4.03 an 72.63±3.50 ein 68.72±3.16 ap 65.26±3.02 eq 60.23±4.02 ir 53.57±6.42 is 48.40±4.54 es Tris-kuning telur Persentase membran plasma utuh (%) (rataan ± standar deviasi) Kontrol 77.73±3.44aM 75.35±3.15 am 71.42±2.22 an 65.94±3.53 ap 62.19±3.71 apq 59.06±3.74 aq 53.53±4.12 ar 48.33±3.31 as Trehalosa 78.05±3.72 am 75.70±2.55 an 72.72±2.15 an 68.79±2.47 ap 66.09±1.78 aq 63.06±2.18 aq 59.09±2.92 ar 53.55±3.06 as Rafinosa 78.33±3.83 am 76.06±2.70 an 72.35±2.21 ap 67.78±3.40 aq 65.19±3.66 aqr 60.76±4.76 ar 54.33±5.31 as 49.97±3.53 as Tris-soya Kontrol 78.04±3.45aM 69.10±2.07 en 65.02±2.08 enp 60.89±3.57 ep 53.59±3.92 eq 49.21±5.07 er 40.55±6.22 es 34.68±5.41 et Trehalosa 78.09±3.86 am 70.91±3.46 en 65.32±3.69 enp 60.45±2.94 epq 55.25±4.44 eq 49.29±4.05 er 41.95±4.54 es 38.45±3.78 es Rafinosa 78.17±3.91 am 72.96±3.85 aen 68.81±2.52 ip 63.93±2.82 ipq 59.18±4.17 eq 53.59±4.07 ir 47.72±5.99 is 40.26±5.31 et Huruf vokal (a, e, i) berbeda yang mengikuti angka pada kolom yang sama dan huruf konsonan (M, N, P, Q, R, S, T, V) berbeda yang mengikuti angka pada baris yang sama menunjukkan berbeda nyata (P<0.05).

6 28 Tabel 6 Selisih perbedaan persentase spermatozoa hidup dan membran plasma utuh (MPU) dengan motilitas spermatozoa hingga 50% Perlakuan Tris-kuning telur Tris-soya Rataan Kontrol Trehalosa Rafinosa Kontrol Trehalosa Rafinosa Triskuning telur Motilitas spermatozoa dan spermatozoa hidup (%) Trissoya SM Selisih rataan (%) SH Selisih (%) Motilitas spermatozoa dan membran plasma utuh (%) SM MPU Selisih (%) SM (spermatozoa motil); SH (spermatozoa hidup); MPU (membran plasma utuh). Kelangsungan hidup spermatozoa berkaitan dengan membran sperma. Metabolisme berlangsung dengan baik jika membran plasma sel dalam keadaan utuh sehingga fertilitas spermatozoa dapat berlangsung dengan baik. Hal tersebut berperan dalam mengatur lalu lintas masuk dan keluar seluruh substrat dan elektrolit yang dibutuhkan dalam proses metabolisme. Menurut Paulenz et al. (2003) penambahan kuning telur yang berisi fosfolipid dan lesitin ke dalam pengencer, dapat melindungi membran sperma terhadap kejutan dingin. Kerusakan spermatozoa pada saat preservasi yang disebabkan karena efek cold shock akan merubah membran spermatozoa dari konfigurasi normal ke konfigurasi heksagonal yang dapat menyebabkan kerusakan pada membran plasma spermatozoa (Morel 1999). Ketika membran sperma mengalami kerusakan, enzim aspartat aminotransferase (AspAT) yang merupakan enzim utama dalam mitokondria yang memproduksi ATP akan dilepaskan dari sel dan masuk ke seminal plasma. Kehilangan AspAT akan mengganggu produksi ATP dan mengganggu motilitas spermatozoa (Arifiantini dan Purwantara 2010). Membran plasma spermatozoa dalam menunjang fungsi pompa ion yang masuk dan keluar sel sangat dipengaruhi oleh tekanan osmotik pada bahan pengencer. Tekanan osmotik ini sangat penting dalam mempertahankan keutuhan membran plasma, karena itu spermatozoa memerlukan lingkungan yang bersifat isotonik. Dalam pengencer, spermatozoa memiliki toleransi tekanan osmotik 270 sampai 360 mosmol/kg H 2 O (Guthrie 2002). Spermatozoa akan mengalami kebengkakan (swelling) jika dipaparkan pada larutan hipotonik, akibat masuknya cairan dari bagian luar sel ke bagian dalam dan sebaliknya akan mengalami penyusutan apabila berada pada lingkungan hipertonik. Hasil pengukuran tekanan osmotik pengencer tris-kuning telur, tris-kuning telur trehalosa, tris-kuning telur rafinosa, tris-soya, tris-soya trehalosa dan tris-soya rafinosa masing-masing adalah 273; 302; 309; 307; 345; 349 mosmol/kg H 2 O. Semen segar dari ketiga kambing PE jantan yang digunakan pada penelitian berturut-turut adalah 244; 233; 236 mosmol/kg H 2 O dengan rataan tekanan osmotik sebesar mosmol/kg H 2 O. Berdasarkan hasil pengujian tekanan osmotik,

7 pengencer tris-soya lebih hipertonik jika dibandingkan dengan pengencer tris-kuning telur. Pengencer yang hipertonik menandakan bahwa molekul-molekul atau partikelpartikel di luar sel lebih banyak daripada di dalam sel. Akibatnya terjadi pengeluaran air dari dalam sel untuk mengencerkan molekul-molekul di luar sel, sehingga sel akan mengerut. Efek yang ditimbulkan adalah muncul gejala osmotic-shock pada spermatozoa yang menyebabkan kerusakan pada organel-organel intraseluler sehingga dapat menyebabkan penurunan motilitas dan spermatozoa hidup. Kerusakan organel intraseluler menyebabkan metabolisme terganggu dan pada akhirnya terjadi penurunan motilitas dan penurunan spermatozoa hidup (Tambing et al. 2003). Perubahan tekanan osmotik larutan pengencer menjadi hipoosmotik atau hiperosmotik dapat menyebabkan kematian spermatozoa, sehingga karbohidrat yang digunakan sebagai tambahan bahan pengencer sebaiknya yang tidak mudah mengalami perubahan struktur menjadi bentuk ion yang dapat mengubah tekanan osmotik larutan pengencer agar integritas membran plasma sel tidak mudah rusak (Souhoka et al. 2009). Dengan utuhnya membran plasma spermatozoa selama penyimpanan akan memberikan efek yang baik terhadap motilitas dan daya hidup spermatozoa. Darnell et al. (1990) dan Kimball (1998) menyatakan bahwa lapisan luar membran sel dibangun dari kompleks protein-karbohidrat (oligosakarida; polisakarida) yang berikatan dengan lipid (glikolipid) dan dengan protein (glikoprotein) yang disebut dengan selubung sel atau glikokaliks. Hal tersebut menjelaskan mengapa karbohidrat disebut dengan krioprotektan ekstraseluler, karena karbohidrat yang ditambahkan ke dalam pengencer berfungsi melindungi glikokaliks dari kerusakan. Karbohidrat tidak dapat menembus membran plasma sel secara difusi bebas karena tidak larut di dalam lemak dan memiliki berat molekul yang besar, sehingga sebagai senyawa krioprotektan ekstraseluler, karbohidrat melindungi sel dari luar (Souhoka et al. 2009). Trehalosa dan rafinosa yang ditambahkan di dalam pengencer diduga akan berasosiasi dengan karbohidrat yang ada pada selubung sel sehingga membran plasma dapat terlindungi dari kerusakan secara mekanik selama proses pengolahan semen berlangsung, terutama saat penyimpanan pada suhu rendah. Kalaupun karbohidrat yang ada pada membran plasma sel tersebut rusak selama proses preservasi, diharapkan trehalosa dan rafinosa yang ditambahkan dapat menjadi pengganti sehingga struktur selubung sel tetap utuh. Sebagai senyawa krioprotektan ekstraseluler, trehalosa dan rafinosa berperan dalam melindungi membran plasma sel spermatozoa dari proses perusakan akibat pengaruh kejutan dingin selama penyimpanan pada suhu rendah (5 C), dan kejutan dingin tersebut berkaitan dengan perubahan fosfolipid yang menyusun membran plasma sel, perubahan tersebut dapat menyebabkan kebocoran atau rusaknya membran plasma sehingga ion-ion seperti kalsium bebas masuk ke dalam sel. Sehingga pada proses preservasi semen memerlukan zat-zat pelindung di dalam pengencer, seperti fosfolipid dan krioprotektan. 29

8 30 Kriopreservasi Semen Menggunakan Pengencer Tris-kuning telur Trehalosa dan Tris-soya Rafinosa dengan Penambahan Krioprotektan Dimelthilformamida (DMF) dan Gliserol Kualitas semen setelah pengenceran dari berbagai macam perlakuan cenderung sama dengan kualitas semen segar dan tidak terdapat adanya perbedaan antar perlakuan (P>0.05). Pengencer yang digunakan baik tris-kuning telur trehalosa dan tris-soya rafinosa dengan penambahan gliserol dan dimethilformamida (DMF) mampu memberikan perlindungan bagi spermatozoa pada awal penyimpanan. Akan tetapi, kualitas semen setelah pengenceran sampai proses ekuilibrasi (selama 4 jam) mengalami sedikit penurunan yaitu 1.69%-2.24% tetapi tidak terdapat adanya perbedaan antar perlakuan (P>0.05). Penurunan kualitas semen setelah pengenceran sampai proses ekuilibrasi dapat dipahami mengingat terjadinya perubahan dari suhu ruang (28 o C) ke suhu lemari es (5 o C). Lemari es relatif stabil di suhu 5 o C dan kandungan lesitin (phosphatidyl choline) yang ada dalam pengencer tris-kuning telur trehalosa dan tris-soya rafinosa dengan penambahan gliserol dan DMF cukup memberikan perlindungan bagi spermatozoa akibat penurunan suhu karena lesitin (phosphatidyl choline) dapat bersifat membran coating untuk tetap mempertahankan konfigurasi normal phospholipid bilayer yang merupakan susunan utama membran sel spermatozoa. Evaluasi kualitas semen setelah thawing dari hasil pengenceran mengalami penurunan. Pada pengencer tris-kuning telur trehalosa dengan penambahan gliserol dan DMF menurun sebanyak 11.60% dan 15.00% lebih baik dibandingkan dengan tris-soya rafinosa dengan penambahan krioprotektan yang sama dengan penurunan sebanyak 34.45% dan 37.60% (P<0.05) dan terdapat perbedaan antar perlakuan triskuning telur trehalosa dan tris-soya rafinosa baik dengan penambahan gliserol maupun DMF (P<0.05). Hasil evaluasi semen setelah thawing pada pengencer triskuning telur trehalosa dengan penambahan gliserol dan DMF cukup rendah karena penurunan kualitas semen hanya 11.60% dan 15.00% dibandingkan dengan hasil Tambing et al. (2000) yaitu 17.51% sampai 24.81% dan Dorado et al. (2010) yaitu 28.00%. Sedangkan pada pengencer tris-soya dengan penambahan krioprotektan yang sama penurunan kualitas semen tinggi yaitu sebanyak 34.45% dan 37.60%. Pengencer tris-soya rafinosa dengan penambahan gliserol dan DMF pada penelitian ini untuk sementara hanya dapat digunakan untuk pengencer semen cair. Perubahan suhu yang sangat drastis dari suhu setelah pengenceran (28 o C) ke suhu pembekuan dalam N 2 cair (-196 o C) sampai ke suhu setelah thawing (37 o C) yang menyebabkan spermatozoa mengalami kerusakan pada membran sel sehingga motilitas spermatozoa terganggu dan menyebabkan kematian sel spermatozoa yang cukup tinggi. Apabila terjadi kerusakan pada membran plasma dapat menyebabkan hilangnya enzim-enzim yang diperlukan dalam proses metabolisme sehingga tidak dihasilkan energi sehingga motilitas menjadi rendah, serta daya hidup juga akan rendah (Rizal et al. 2003). Kualitas semen beku setelah thawing pada penelitian cukup tinggi. Motilitas spermatozoa pada perlakuan tris-kuning telur trehalosa dengan penambahan gliserol menunjukkan peranan yang lebih baik (65.07±5.38%) dengan nilai recovery rate (83.65%) yang lebih tinggi dibandingkan dengan tris kuning telur trehalosa DMF (61.67±5.55%) dengan nilai recovery rate (79.29%) (P>0.05) (Tabel 7). Dengan demikian gliserol maupun DMF tidak memiliki pengaruh yang berbeda terhadap

9 31 penambahan tris-kuning telur trehalosa, akan tetapi gliserol cenderung lebih baik sekitar 3%. Hal ini diduga karena gliserol yang ditambahkan kedalam tris-kuning telur trehalosa memiliki kemampuan untuk mencegah terbentuknya kristal-kristal es akibat dehidrasi sel yang berlebihan dari dalam sel dan menstabilkan membran plasma sel sehingga dapat melindungi kerusakan fisik maupun fungsional spermatozoa selama proses pembekuan dan memodifikasi struktur kristal es sehingga tidak merusak organel-organel sel. Peranan lain dari gliserol adalah dapat mencegah dehidrasi karena memiliki tiga gugus hidroksil ( OH) yang memiliki daya pengikat air yang kuat dan tiap gugus hidroksil ini dapat mengadakan interaksi dengan gugus karboksil asam lemak (Kimball 1998). Gliserol dalam melindungi membran sel akan mengikat gugus pusat fosfolipid sehingga mengurangi ketidakstabilan membran dan dapat berinteraksi dengan membran untuk mengikat protein dan glikoprotein (Parks dan Graham 1992). Tabel 7 Pengaruh dimethilformamida (DMF) dan gliserol dalam pengencer triskuning telur trehalosa dan tris-soya rafinosa terhadap kualitas spermatozoa Tahapan Pembekuan Tris-kuning telur trehalosa Tris-soya rafinosa Rataan DMF Gliserol DMF Gliserol Triskuning telur trehalosa Trissoya rafinosa Semen Segar SM (%) 77.78±2.64 am 77.78±2.64 am 77.78±2.64 am 77.78±2.64 am SH (%) 84.90±4.37 am 84.90±4.37 am 84.90±4.37 am 84.90±4.37 am MPU (%) 77.01±3.18 am 77.01±3.18 am 77.01±3.18 am 77.01±3.18 am Setelah Pengenceran SM (%) 76.67±2.50 am 76.67±2.50 am 76.67±2.50 am 76.67±2.50 am SH (%) 83.23±4.23 am 84.55±3.28 am 84.62±3.66 am 82.88±3.45 am MPU (%) 75.45±3.20 am 76.12±3.19 am 75.67±3.11 am 75.45±3.19 am Setelah Ekulibrasi SM (%) 74.43±2.50 am 74.55±2.50 am 74.73±2.50 am 74.98±2.64 am SH (%) 80.00±3.25 am 81.04±3.67 am 82.01±3.52 am 81.11±3.19 am MPU (%) 72.66±3.20 am 72.87±3.33 am 73.46±2.66 am 72.50±3.74 am Setelah Thawing SM (%) 61.67±5.55 an 65.07±5.38 an 42.22±8.13 en 39.07±5.38 en SH (%) 65.57±4.16 an 68.98±4.68 an 48.89±7.93 en 45.36±4.81 en MPU (%) 64.58±5.70 an 69.19±3.36 en 41.44±3.99 in 41.32±5.71 in Recovery rate (%) Huruf vokal (a, e, i) berbeda yang mengikuti angka pada baris yang sama dan huruf konsonan (M, N) berbeda yang mengikuti angka pada kolom yang sama menunjukkan berbeda nyata (P<0.05). DMF (dimethilformamida); SM (spermatozoa motil); SH (spermatozoa hidup); MPU (membran plasma utuh).

10 Selain gliserol penambahan kuning telur pada pengencer juga mampu memberikan efek perlindungan pada spermatozoa selama proses pendinginan dan pembekuan. Fraksi protein non dialisis pada kuning telur yang mengakibatkan kuning telur dapat mempunyai sifat proteksi yang sangat baik pada spermatozoa kambing selama pembekuan. Selain itu diduga karena adanya kaitan yang erat antara low-density lipoprotein dengan membran plasma sperma seperti yang ditemukan pada spermatozoa sapi (Molinia et al. 1994). Selain itu, penambahan trehalosa lebih mampu memberikan perlindungan terhadap pengaruh pembekuan (Aisen et al. 2000), meningkatkan integritas membran dan viabilitas sel spermatozoa (Aisen et al. 2002). Crowe dan Crowe (2000) menyatakan bahwa trehalosa bersifat krioprotektan ekstraseluler yang bekerja menstabilkan membran dan melindungi membran selama proses pembekuan, sehingga jika dikombinasikan dengan gliserol menunjukkan kemampuan yang optimal dalam melindungi sel terhadap efek pembekuan. Trehalosa adalah gula yang tidak toksik dan bersifat krioprotektan dengan cara menggantikan atau berasosiasi dengan bound water, dan trehalosa dapat melindungi membran sel dengan cara mengikat air ke protein dan ke ujung polar dari fosfolifid pada membran sel lebih kuat dibandingkan dengan bound water tanpa tambahan trehalosa (bound water saja) (Best c1990). Menurut Watson (2000) selama tahapan pembekuan, sel sperma melewati perubahan drastis dalam lingkungan fisik dan kimia. Suhu turun mendekati titik beku air yang menyebabkan perubahan struktural lipid bilayer mengubah membran plasma. Perubahan ini dapat memicu perubahan dalam permeabilitas membran plasma yang dapat menyebabkan pecahnya sel sperma (Hermansson dan Linde- Forsberg 2006). Hafez (2000) menyatakan bahwa gliserol yang digunakan sebagai krioprotektan berdifusi, menembus dan memasuki spermatozoa dan oleh spermatozoa dipakai untuk metabolisme oksidatif, menggantikan air bebas dan mendesak keluar elektrolit-elektrolit, menurunkan konsentrasi elektrolit intraseluler serta mengurangi daya merusaknya terhadap sel spermatozoa. Efek gliserol adalah mencegah pengumpulan molekul H 2 O dan mencegah kristalisasi es pada daerah titik beku larutan (Mazur 1984). Selain itu, gliserol akan menurunkan konsentrasi natrium di dalam medium di luar sel sehingga kematian sel spermatozoa akibat solution-effect dapat dihindarkan dan pembentukan kristal-kristal es di dalam sel dapat dikurangi. Mekanisme kerjanya adalah dengan jalan mengubah bentuk dan ukuran kristal es yang terbentuk sehingga mengurangi tekanan mekanik dan menurunkan titik beku medium sehingga kristal-kristal es tidak terbentuk. Solution-effect ini akan timbul bila terjadi perubahan yang drastis dari larutan dalam sel yang dibekukan sebagai akibat terbentuknya kristal-kristal es di luar dan dalam sel spermatozoa. Selain itu terjadi penurunan volume air dalam sel, perubahan air menjadi es dan adanya peningkatan konsentrasi larutan di dalam dan di luar sel. Dengan adanya gliserol dalam medium pengencer diharapkan peningkatan konsentrasi elekstrolit yang merugikan dapat dihindarkan (Tambing et al. 2000). Dalam pengencer tris-soya rafinosa, penambahan DMF lebih memperkuat daya kerja tris soya rafinosa dengan persentase motilitas spermatozoa (42.22±8.13%) dengan nilai recovery rate (54.28%) yang lebih tinggi dibandingkan dengan gliserol (39.07±5.38%) dengan nilai recovery rate sebesar 50.23% (P>0.05) (Tabel 7). Dengan demikian DMF maupun gliserol tidak memiliki pengaruh yang berbeda terhadap penambahan tris-soya rafinosa, akan tetapi DMF cenderung lebih baik 32

11 sekitar 5%. Hal ini dikarenakan kandungan asam amino (Lampiran 1) yang ada didalam Tris-soya rafinosa yang dapat membentuk ikatan hidrogen yang ada pada DMF. Jadi, atom hidrogen yang ada pada DMF berikatan atau mengeliling asam amino yang ada pada tris-soya rafinosa. Oleh karena itu, penambahan DMF lebih memperkuat daya kerja tris-soya rafinosa. Wade (2000) menjelaskan bahwa DMF yang merupakan pelarut yang bersifat polar aprotik (tidak mempunyai atom H untuk ikatan hidrogen) dengan konstanta dielektrik dan moment dipol yang tinggi. Jadi meskipun DMF melarutkan tidak bekerja membentuk ikatan hidrogen dengan anion. DMF dapat melarutkan garam-garam terutama melalui kation larutan melalui daya tarik pada ujung dipol C=O. Ujung positif dari dipol dilindungi di dalam molekul dan dapat melarutkan anion tetapi sangat lemah. Pine et al. (1998) menyelaskan bahwa amida dapat dengan mudah terbentuk dari senyawa yang sesuai yang memiliki gugus amino dan gugus karboksilat. Oleh karena itu amida mudah bereaksi dengan asam karboksilat di dalam reaksi asam-basa sehingga menghasilkan garam amonium. (Fessenden dan Fessenden 2006) menyatakan bahwa hidrolisis suatu amida dalam larutan asam berlangsung dalam suatu cara yang serupa dengan hidrolisis suatu ester. Oksigen karbonil diprotonasi, karbon karbonil diserang oleh H 2 O, proton diserah terimakan, dan suatu amina dibuang. Amina ini kemudian bereaksi dengan H + dan menghasilkan garam amina. Pembentukan garam amina menjelaskan bahwa H + bersifat pereaksi, bukan katalis. Selain itu, hal ini dikarenakan amida memiliki toksisitas yang lebih rendah dan dapat menjaga integritas membran sel. Amida telah diusulkan sebagai alternatif untuk pembekuan semen, terutama untuk semen pejantan yang lebih sensitif terhadap efek racun dari gliserol, karena amida memiliki bobot molekul (73.09) dan viskositas yang lebih rendah dibandingkan dengan gliserol (dengan bobot molekul 92.05), dan untuk permeabilitas membran yang lebih tinggi sehingga dapat mengurangi kemungkinan kerusakan sel yang disebabkan oleh tekanan osmotik. Selain itu penambahan metil (CH3) kedalam molekul amida dapat meningkatkan permeabilitas membran sperma dan meningkatkan efisiensi kriopreservasi (Bezerra et al. 2011). Dasar pemilihan jenis krioprotektan menurut Squires et al. (2004) selain mengandung bahan yang bekerja melindungi sel pada saat pembekuan juga harus memiliki bobot molekul yang kecil agar lebih mudah dan cepat melakukan penetrasi ke dalam sel sehingga mengurangi toksisitas akibat osmolaritas yang tinggi. Rafinosa terdiri dari tiga sakarida yang mempunyai peranan penting pada penyesuaian pengaruh tekanan osmotik. Aktifitas dan sumber energi sakarida dengan berat molekul yang tinggi sangat baik untuk gerakan spermatozoa. Sebagai sumber aktifitas rafinosa yang terdiri dari D-galaktosa, D-glukosa dan D-Fruktosa juga berfungsi menstabilkan kualitas spermatozoa terhadap pengaruh buruk penyimpanan dan pembekuan dalam N 2 cair (Suwarso 1999), sehingga jika dikombinasikan dengan DMF menunjukkan kemampuan yang optimal dalam menjaga integritas membran dan permeabilitas membran yang lebih tinggi dan dapat mengurangi kerusakan sel yang disebabkan oleh tekanan osmotik, serta dapat meningkatkan efisiensi kriopreservasi. Secara umum rataan persentase motilitas spermatozoa dengan penambahan krioprotektan gliserol maupun DMF pada pengencer tris-kuning telur trehalosa lebih unggul (63.37%) dengan rataan recovery rate (81.47%) yang lebih tinggi dibandingkan dengan rataan tris-soya rafinosa (40.65%) dengan rataan recovery rate (52.26%) (P<0.05) (Tabel 7). Hal ini diduga karena di dalam pengencer tris-kuning 33

12 telur trehalosa mempunyai komponen yang lebih baik dibandingkan tris-soya rafinosa yaitu kandungan lesitin dan lipoprotein dari kuning telur yang dapat memberikan perlindungan bagi sel sperma yang lebih baik jika dibandingkan dengan lesitin pada kacang kedelai selama proses pembekuan-thawing. Kandungan lipid dalam pengencer tris kuning telur trehalosa lebih dapat melindungi phospholipid bilayer pada membran sel. Zhang et al. (2009) menyimpulkan bahwa mekanisme yang tepat dimana lesitin kedelai melindungi spermatozoa selama proses pembekuan-thawing masih belum diketahui dengan jelas, dan menyimpulkan bahwa mekanisme lesitin kedelai mirip dengan LDL (low density lipoprotein). Dijelaskan lebih lanjut bahwa fosfolipid dari kuning telur dan lesitin kacang kedelai tidak bisa masuk kedalam membran sperma untuk mengubah fosfolipid pada membran, akan tetapi mungkin menggabungkan dengan membran sperma untuk membentuk lapisan pelindung terhadap pembentukan kristal es ekstraseluler yang mematikan dan melindungi membran sperma dari kerusakan mekanis selama proses pembekuanthawing. Lesitin dari kacang kedelai memiliki kandungan yang mirip dengan lesitin pada kuning telur yang digunakan untuk perlindungan bagi spermatozoa dari efek cold shock pada saat kriopreservasi (Thun et al. 2002; Aires et al. 2003). Menurut Aboagla dan Terada (2004a), kuning telur mengandung lesitin yang mampu melindungi spermatozoa terhadap kejutan dingin. Anti cold shock perlu ditambahkan dalam bahan pengencer agar dapat melindungi spermatozoa pada saat perubahan suhu dari suhu ruang (28 C) pada saat pengolahan ke suhu ekuilibrasi (5 C). Anti cold shock yang umum ditambahkan adalah kuning telur atau ekstrak kacang kedelai yang dapat melindungi membran spermatozoa pada saat pendinginan dan pembekuan. Khasiat utama kuning telur atau ekstrak kacang kedelai adalah kandungan lesitin (phosphatidyl choline) yang dapat bersifat membran coating untuk tetap mempertahankan konfigurasi normal phospholipid bilayer yang merupakan susunan utama membran sel spermatozoa. Cold shock tersebut akan merubah membran spermatozoa dari konfigurasi normal ke konfigurasi hexagonal (Lampiran 10) yang dapat menyebabkan kerusakan pada membran plasma spermatozoa (Morel 1999). Pemeriksaan motilitas spermatozoa diperluas dengan pemeriksaan membran plasma utuh dan spermatozoa hidup. Terdapat hubungan antara pemeriksaan motilitas dan keutuhan membran plasma serta daya hidup spermatozoa. Membran plasma yang rusak akan berpengaruh terhadap motilitas sehingga fertilitas akan terganggu. Hal ini dapat dilihat dari rataan persentase membran plasma utuh setelah thawing cenderung lebih tinggi 3% dibandingkan dengan rataan persentase motilitas spermatozoa yaitu sebesar 66.89% pada tris-kuning telur trehalosa dan 41.38% pada tris soya rafinosa. Sedangkan pemeriksaan spermatozoa hidup selalu didapat lebih tinggi sekitar 4-6% dari persentase spermatozoa motil yaitu 67.28% pada tris-kuning telur trehalosa dan 47.13% pada tris soya rafinosa. Membran plasma spermatozoa sangat dipengaruhi oleh tekanan osmotik pada bahan pengencer. Tekanan osmotik ini sangat penting dalam mempertahankan keutuhan membran plasma. Sel spermatozoa kambing pada saat pembekuan memiliki toleransi osmolaritas pengencer semen beku antara mosmol/kg H 2 O (Purdy 2006a). Semen segar dari ketiga kambing PE jantan yang digunakan pada penelitian berturut-turut adalah 244; 233; 236 mosmol/kg H 2 O dengan rataan tekanan osmotik sebesar mosmol/kg H 2 O. Hasil pengukuran tekanan osmotik 34

13 pada pengencer tris-kuning telur trehalosa DMF, tris-kuning telur trehalosa gliserol, tris-soya rafinosa DMF, dan tris-soya rafinosa gliserol berturut-turut adalah 860; 700; 1210; 1220 mosmol/kg H 2 O. Berdasarkan hasil tersebut pengencer yang menunjukkan tekanan osmotik yang mendekati kisaran tersebut adalah tris-kuning telur trehalosa. Hal tersebut membuktikan bahwa tekanan osmotik suatu pengencer memegang peranan penting dalam mempengaruhi membran plasma spermatozoa yang berkorelasi positif terhadap motilitas dan daya hidup spermatozoa. Apabila membran plasma spermatozoa sudah mengalami kerusakan, maka metabolisme spermatozoa akan terganggu sehingga spermatozoa akan terganggu motilitasnya dan dapat menyebabkan kematian. Hal ini menunjukkan kualitas membran plasma dapat tetap dipertahankan meskipun motilitas menurun. Pegg (2002) menyatakan stres osmotik pada saat thawing disebabkan oleh efek dari krioprotektan yang berlebihan, sehingga menyebabkan sel membengkak dan pecah. Hal tersebut kemungkinan disebabkan oleh tekanan osmotik larutan pengencer yang terlalu tinggi sehingga air dari dalam sel akan tertarik keluar yang menyebabkan dehidrasi (Best c1990). Best (c1990) menyatakan bahwa air dalam sel terdiri atas bulk water yang mengisi 90% dari sel serta bound water yang mengisi hanya 10% dari sel. Bulk water adalah air yang bisa membeku dan akan keluar akibat perubahan tekanan osmotik. Sedangkan boundwater adalah molekul air yang kali lebih kental dibandingkan dengan bulk water, yang ikatan hidrogennya terikat sangat erat pada permukaan yang bersifat hidrofilik dari makromolekul (protein, asam nukleat atau ujung polar dari kelompok phospholipids). Saat terjadi proses pembekuan, bagian luar sel akan mengalami pembekuan terlebih dahulu yang akan menarik air dari dalam sel keluar. Kriopreservasi menyebabkan kerusakan permanen pada organel sperma, dan perubahan fluiditas membran dan aktifitas enzimatik, terkait dengan penurunan motilitas, viabilitas dan fertilitas spermatozoa (Sariözkan et al. 2009). Kerusakan spermatozoa selama proses kriopreservasi terkait dengan tiga komponen utama, yakni stres osmotik, pembentukan kristal es, dan komposisi lipid membran (secara langsung berhubungan dengan perubahan fluiditas membran sperma (fase transisi)) dan kemampuan untuk pertukaran panas, ion dan air melalui membran plasma (Watson 2000). Perbedaan suhu dan osmolaritas antara media pembekuan dan sperma menyediakan variasi yang besar pada volume air dalam sel yang mengarah ke mekanisme stres pada membran sel. Fase transisi yang terjadi selama proses pembekuan mengubah struktur membran dan dapat menghilangkan protein penting sehingga mengurangi efisiensi kriopreservasi. Reorganisasi membran lipid sperma dapat menggangu interaksi antara lipid-lipid atau lipid-protein yang diperlukan untuk fungsi membran secara sempurna (Watson 2000). Selain itu, media pembekuan dapat menyebabkan pecahnya membran karena dapat menyebabkan stres osmotik, perubahan membran, dan perubahan dalam mikrotubulus ekor sperma. Purdy (2006a) menyatakan bahwa walaupun gliserol agak beracun bagi spermatozoa dan dapat menyebabkan kerusakan osmotik, gliserol adalah krioprotektan yang paling banyak digunakan untuk pembekuan semen. Penggunaan dimethylformamide (DMF) tidak lebih unggul daripada gliserol jika digunakan sebagai krioprotektan untuk semen kambing (Bezerra et al. 2011). Alvarenga et al. (2005) menyatakan bahwa DMF lebih unggul dalam mempertahankan semen beku kuda. Dari hasil penelitian ini menunjukkan bahwa DMF yang dikombinasikan 35

14 36 dengan pengencer dasar tris untuk pembekuan semen kambing memiliki hasil yang mirip dengan gliserol. Dengan demikian DMF dapat digunakan sebagai krioprotektan alternatif untuk pembekuan semen kambing. SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Pengencer tris-soya dapat digunakan sebagai pengencer semen cair kambing dan suplementasi rafinosa mempertahankan daya hidup spermatozoa dalam tris-soya sampai 60 jam, sedangkan suplementasi trehalosa mempertahankan daya hidup spermatozoa dalam tris-kuning telur sampai 84 jam. Pengencer tris-kuning telur trehalosa dengan penambahan gliserol menunjukkan peranan yang lebih baik dalam melindungi kualitas spermatozoa pada saat pembekuan dibandingkan dengan pengencer tris-soya rafinosa dengan penambahan DMF. Pemeriksaan motilitas spermatozoa dapat menggambarkan pemeriksaan membran plasma utuh dan spermatozoa hidup. Saran Penelitian ini merupakan penelitian pertama untuk mengevaluasi efek dari lesitin kacang kedelai untuk preservasi dan kriopreservasi semen kambing PE, sehingga diperlukan penelitian lebih lanjut untuk mendapatkan informasi tentang lesitin kacang kedelai. Untuk membuat semen cair kambing dapat digunakan pengencer tris-kuning telur dengan suplementasi trehalosa 50 mm dan tris-soya dengan suplementasi rafinosa 50 mm. Perlu dilakukan IB pada kambing betina menggunakan semen cair hasil penelitian ini untuk mengetahui fertilitas spermatozoa yang sebenarnya. DAFTAR PUSTAKA Aboagla EME, Terada T Trehalose-enhanced fluidity of the goat sperm membrane and its protection during freezing. BOR Papers in Press Published. pp Aboalga EME, Terada T. 2004a. Effect of egg yolk during the freezing step preservative on the viability of goat spermatozoa. Theriogenology. 62: Aboagla EME, Terada T. 2004b. Effects of supplementation of trehalose extender containing egg yolk with sodium dodecyl sulfate on the freezability of goat spermatozoa. Theriogenology. 62: