METODOLOGI. Gambar 3 Produk cookies yang diteliti

Transkripsi

1 28 METODOLOGI Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Desember 2010 sampai dengan bulan Januari Pembuatan cookies dilakukan di Laboratorium Percobaan Makanan. Adapun analisis kandungan gizi serta bioavailabilitas kalsium dan zat besi cookies dilakukan di Laboratorium Analisis Zat Gizi Mikro dan Laboratorium Analisis Kimia Pangan Gizi II, Departeman Gizi Masyarakat, Fakultas Ekologi Manusia, Institut Pertanian Bogor di Bogor. Bahan dan Alat Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah dua jenis cookies. Cookies pertama adalah cookies pati garut dengan penambahan daun torbangun (cookies PGT). Cookies kedua adalah cookies pati garut tanpa penambahan daun torbangun atau cookies kontrol (cookies PGK). Bahan yang diperlukan untuk membuat cookies terdiri dari margarin, mentega putih, gula halus, kuning telur, tepung susu skim, tepung pati garut, dan tepung daun torbangun. Tepung daun torbangun hanya ditambahkan pada cookies PGT dan berjumlah 10% dari tepung pati garut yang digunakan. Contoh cookies kontrol maupun PGT yang digunakan pada penelitian ini disajikan pada Gambar 3. Gambar 3 Produk cookies yang diteliti Bahan tambahan dalam penelitian ini berupa berbagai jenis minuman yang akan dikombinasikan dengan cookies. Jenis maupun merk minuman yang digunakan diasumsikan dapat merepresentasikan pola konsumsi masyarakat Indonesia sehingga dipilih berdasarkan Top Brand Award penghargaan tahunan terhadap merek-merek yang tergolong sebagai merek yang top-. Jenis dan merk minuman yang digunakan pada penelitian ini adalah AMDK (Air Minum

2 29 Dalam Kemasan) merek Aqua, susu cair siap minum merek Ultra Milk, teh celup merek Sariwangi, dan kopi bubuk instant merek Indocafe. Minuman yang digunakan pada penelitian ini disajikan pada Gambar 4. Gambar 4 Kemasan minuman yang diteliti Adapun bahan kimia yang diperlukan untuk analisis bioavailabilitas kalsium dan zat besi adalah aquades, air bebas ion, asam sulfat (H 2 SO 4 ), asam nitrat (HNO 3 ), asam klorida (HCL), natrium hidroksida (NaOH), natrium bikarbonat (NaHCO 3 ), kalium hidroksida (KOH), pepsin dari porsin (Merck), pankreatin dari porsin (Merck), ekstrak bile dari porsin (Sigma B-8631), larutan standar kalsium dan zat besi. Alat-alat yang digunakan untuk analisis kimia dan bioavailabilitas adalah cawan porslen, gelas piala, labu erlenmeyer, labu takar, buret, pipet tetes, kertas saring whatman No. 42, ph meter, timbangan analitik, desikator, tanur, bomb calorimeter digital, shake water bath, kantung dialisis (Spectrapor I, MWCO Fisher No C, diameter 32.8 mm, flat width 50 mm, volume per length 8 ml/cm) dan AAS (Atomic Absorption Spectrophotometri). Metode Penelitian Penelitian ini merupakan bagian kedua dari rangkaian penelitian terkait produk cookies PGT. Sebelumnya Anita Lusiya Dewi (2011) telah melakukan penelitian yang berjudul Formulasi cookies berbasis pati garut (Maranta arundinaceae L) dengan penambahan tepung torbangun (Coleus amboinicus Lour) sebagai sumber zat gizi mikro. Rangkaian penelitian ini diakhiri dengan penelitian yang berjudul Pengaruh penyimpanan terhadap mutu dan keamanan pangan cookies berbasis pati garut (Maranta arundinaceae L) dengan penambahan tepung torbangun (Coleus amboinicus Lour) oleh Panji Azhari (2011). Secara umum penelitian ini dilaksanakan dalam dua tahapan, yaitu tahap penelitian pendahuluan dan penelitian lanjutan. Berikut adalah penjelasan rincinya :

3 30 A. Penelitian Pendahuluan Penelitian pendahuluan bertujuan untuk mempersiapkan bahan utama (cookies) dan bahan tambahan (minuman) yang akan dikombinasikan dan dianalisis lebih lanjut pada penelitian ini. Penelitian pendahuluan meliputi empat tahapan yaitu pembuatan cookies, penetapan standar cara pembuatan dan penyajian minuman, analisis kimia cookies dan minuman, dan perhitungan perbandingan pada berbagai jenis kombinasi. a. Pembuatan cookiesp Proses pembuatan cookies disajikan pada Gambar 5. Margarin, mentega putih, dan gula dicampur sampai terbentuk krim homogen dengan menggunakan mixer Ditambahkan telur dan dikocok dengan kecepatan rendah Ditambahkan pati garut, tepung daun torbangun, dan susu secara bertahap Diaduk sampai terbentuk adonan yang kalis dan mudah dibentuk Adonan cookies dicetak sesuai dengan bentuk yang diinginkan Adonan cookies dioven pada suhu C selama menit Gambar 5 Proses pembuatan cookies (Faridah 2008 modiikasi) b. Penetapan standar cara pembuatan dan penyajian minuman 1) AMDK Tersedia dalam kemasan siap saji (gelas) 240 ml. Kemasan aseptik dibuka dengan menancapkan sedotan pada bagian atas gelas. 2) Susu Tersedia dalam kemasan siap saji (tertra pack) 200 ml. Kemasan aseptik dibuka dengan menancapkan sedotan pada tempat yang telah disediakan. 3) Air teh Proses pembuatan cookies disajikan pada Gambar 6.

4 31 Diambil 1 tea bag dari kemasan kedap udara teh celup merk Sariwangi, dan dimasukkan ke dalam gelas piala 250 ml Ditambahkan 200 ml AMDK merk Aqua yang telah dipanaskan hingga suhu 80 C tea bag digoyang-goyangkan selama 5 menit agar teh terekstaraksi Ditambahkan 2 sendok teh (10 gr) gula pasir curah Diaduk 5 putaran searah jarum jam dengan kecepatan rendah Didiamkan hingga suhu 70 C Gambar 6 Standar cara pembuatan air teh (Winarno 1995 modiikasi) 4) Air kopi Proses pembuatan air kopi disajikan pada Gambar 7. Dibuka kemasan kedap udara kopi bubuk instant merk Indocafe, ditimbang 9,7 g dan dimasukkan ke dalam gelas piala 250 ml Ditambahkan 200 ml AMDK merk Aqua yang telah dipanaskan hingga 80 C Diaduk 5 putaran searah jarum jam dengan kecepatan rendah Diamkan hingga suhu 70 C Gambar 7 Standar cara pembuatan air kopi (Petunjuk penyajian pada kemasan Indocafe coffe mix) c. Analisis kimia cookies dan minuman Analisis kimia yang dilakukan meliputi kadar air (AOAC 1995), kadar abu (AOAC 1995), kadar protein metode Kjehdahl (AOAC 1995), kadar lemak (AOAC 1995), kadar karbohidrat (Winarno 1997), kadar serat kasar (SNI ), kadar kalsium (AAS), kadar zat besi (AAS), kadar zink (AAS), kadar fosfor (metode spektrofotometer), kadar vitamin C (Sulaeman et al. 1995), dan kandungan gross energy (Almatsier 2006).

5 32 1) Kadar air (AOAC 1995) Sampel sebanyak lima gram dikeringkan selama 15 jam dalam oven C sampai beratnya konstan. Kadar air dihitung dengan rumus : Kadar Air (%) = A B x 100% D Keterangan : A = Berat wadah dan sampel awal B = Berat dan sampel setelah dikeringkan D = Berat sampel 2) Kadar abu metode gravimetri (AOAC 1995) Cawan kosong dipanaskan dalam oven kemudian didinginkan dalam desikator selama 30 menit. Sampel ditimbang kurang lebih 3 g dan diletakkan dalam cawan, kemudian dibakar dalam kompor listrik sampai tidak berasap. Cawan kemudian dimasukkan ke dalam tanur. Pengabuan dilakukan dalam dua tahap, tahap pertama pada pada suhu sekitar C dan tahap kedua pada suhu C, pengabuan dilakukan sekitar 2-3 jam. Cawan kemudian didinginkan dalam desikator, setelah dingin cawan kemudian ditimbang. Persentase dari kadar abu dapat dihitung menggunakan rumus sebagai berikut : Abu (%) = Bobot abu (g) x 100% Bobot sampel (g) 3) Kadar protein metode mikro kjeldahl (AOAC 1995) Kadar protein dalam sampel dianalisis dengan menggunakan metode Kjeldahl yang merupakan analisis kadar total N. Sejumlah sampel 0,3 g dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl dan ditambahkan dengan katalis (selenium mix ± 0.5 g) secukupnya dan 25 ml H 2 SO 4 pekat. Didestruksi pada suhu tinggi hingga larutan berwarna jernih dan tidak berasap. Dinginkan dan masukkan ke labu kjedahl yang lebih besar, kemudian tambahkan 2 3 tetes indikator metil merah metil biru. Tambahkan NaOH 30% sampai berwarna hijau, lalu destilasi dengan larutan penampung 20 ml H 3 BO 3.Tambahkan 2 3 tetes indikator metil merah metil biru. Diamkan hingga larutan penampung berubah warna hijau, setlah itu ujung alat destilasi dibilas. Titrasi dengan larutan HCl standar hingga berwarna keunguan.

6 33 % N = ml contoh x N HCl x fp x 14 x 100% mg contoh % Protein = % N x 6,25 (faktor koreksi) 4) Kadar lemak (AOAC 1995) Labu lemak terlebih dahulu dikeringkan dalam oven pada suhu C, dan didinginkan dalam desikator serta dihitung beratnya. Contoh sebanyak 5 gram dalam bentuk kering dibunngkus dalam kertas saring, kemudian dimasukkan ke dalam alat ekstrasi soxhlet. Alat kondensor diletakkan di atas dan labu lemak secukupnya. Selanjutnya dilakukan refluks selama minimal 6 jam sampai pelarut yang turun kembali ke dalam labu lemak berwarna jernih. Labu lemak yang berisi lemak hasil ekstrasi dikeringkan dalam oven bersuhu C untuk mengeluarkan sisa pelarut hingga mencapai berat yang konstan, kemudian didinginkan dalam desikator. Labu lemak kemudian ditimbang dan berat lemak dapat diketahui. Kadar lemak (% bb) = Berat lemak (gram) x 100% Berat contoh (gram) 5) Kadar karbohidrat (Winarno 1997) Kadar karbohidrat ditentukan by difference yaitu hasil pengurangan dari 100 % dengan kadar air, kadar protein, kadar lemak, dan kadar abu, sehingga kadar karbohidrat tergantung karbohidrat sangat berpengaruh kepada faktor kandungan zat gizi lainnya. Penentuan dengan cara ini kurang akurat dan merupakan pertimbangan kasar sebab karbohidrat dihitung termasuk serat kasar yang tidak menghasilkan energi. Serat kasar adalah fraksi karbohidrat yang sukar dicerna. Karbohidrat (%) = 100% - % kadar (air + protein + lemak + abu) 6) Kadar serat pangan metode enzimatis (AOAC 1995) Sampel diekstrak lemaknya dengan pelarut petroleum eter (hexane) pada suhu kamar selama 15 menit kemudian dikeringkan pada suhu ruang. Sejumlah 1 g sampel bebas lemak (w) dimasukkan ke dalam erlenmeyer, kemudian ditambahkan 25 ml 0.1 M buffer fosfat ph 6 dan dibuat suspensi. Lalu ditambahkan 0.1 ml termamyl, ditutup dengan alufo dan diinkubasi pada suhu 100 o C selama 15 menit, diangkat dan didinginkan, kemudian ditambahkan 20 ml akuades dan ph diatur

7 34 menjadi 1.5 dengan menambahkan HCl 4 M. Selanjutnya ditambahkan 100 mg pepsin, ditutup dan diinkubasi pada suhu 40 o C dalam wadah bergoyang selama 60 menit (shaker water bath). Kemudian ditambahkan 20 ml akuades dan ph diatur menjadi 6.8, lalu ditambahkan 100 mg pankreatin, ditutup dan diinkubasi pada suhu 40 o C selama 60 menit dalam wadah bergoyang (shaker water bath), dan terakhir ph diatur dengan HCl menjadi 4.5. Selanjutnya disaring dengan kertas saring Whatman No.40 yang sebelumnya telah diketahui bobot keringnya kemudian dicuci dengan 2 x 10 ml aquades, 2 x 10 ml etanol 95%, dan 2 x 10 ml aseton, lalu dikeringkan pada suhu 105 o C sampai berat tetap (sekitar 12 jam) dan ditimbang setelah didinginkan dalam desikator (D1/B1). Kemudian diabukan dalam tanur 500 o C selama minimal 5 jam dan ditimbang setelah didinginkan dalam desikator (I1/B2). Nilai blanko diperoleh dengan cara yang sama namun tanpa menggunakan sampel. Nilai TDF (% bb) = ([(D1 B1) (I1 B2)]/w) x 100 % Keterangan : D1 = berat sampel setelah dioven I1 = berat sampel setelah ditanur B1 = berat blanko setelah dioven B2 = berat blanko setelah ditanur w = berat sampel *Kehilangan lemak dan komponen lain (air) selama ekstraksi lemak diperhitungkan secara matematis. 7) Analisis kadar kalsium metode Atomic Absorbsion Spectrophotometry (AAS) (Apriyantono et al. 1989) Preparasi sampel untuk kadar kalsium dilakukan dengan menggunakan pengabuan basah. Sampel yang mengandung 5-10 gram padatan ditimbang dan dimasukkan ke dalam labu kjedhal. Lalu ditambahkan larutan 10 ml H 2 SO 4, 10 ml HNO 3 serta beberapa batu didih. Larutan kemudian dipanaskan sampai tidak berwarna gelap dan ditambahkan 10 ml aquades sampai larutan tidak berwarna atau berwarna kuning, lalu panaskan kembali sampai berasap. Larutan dibiarkan sampai dingin kembali dan tambahkan 5 ml aquades, didihkan

8 35 sampai berasap. Larutan disaring dengan kertas whatman 42 kemudian dibaca dengan menggunakan AAS. Kadar Ca = (a b) x V 10 x W Keterangan: a = Konsentrasi Larutan Blanko (mg/ml) b = Konsentrasi Larutan Sampel (mg/ml) v = Volume Ekstrak w = Berat Sampel 8) Analisis kadar besi (fe) dan seng (zn) metode Atomic Absorbsion Spectrophotometry (AAS) (Apriyantono et al. 1989) Preparasi sampel untuk penetapan kadar zat besi dilakukan dengan pengabuan basah. Sampel ditambahkan sebanyak ± 0.2 g dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Kemudian ditambahkan 10 ml H 2 S0 4 dan 10 ml HNO 3, dipanaskan perlahan-lahan sampai larutan tidak berwarna gelap lagi (semua zat organik telah teroksidasi) larutan ditambahkan aquades sehingga menjadi tidak berwarna atau menjadi kuning dan didihkan sampai berasap. Setelah itu didinginkan kemudian diencerkan dalam labu takar 100 ml sampai tanda tera, blanko dipersiapkan seperti proses di atas dan juga larutan standar besi. Sampel dan blanko diukur dan dibuat kurva. Zat Besi (ppm) = (abs sampel abs blanko) x fp x 100% x 1000 ppm mg sampel 9) Analisis kadar fosfor metode spectrophotometry - Persiapan pereaksi Vanadat-Molibdat : 20 gram ammonium molibdat dilarutkan dalam 400 ml aquades hangat kemudian didinginkan. Timbang 1 g vanadat dilarutkan ke dalam 30 ml akuades mendidih. Setelah dingin, tambahkan asam nitrat pekat sambil diaduk. Larutan molibdat dimasukkan ke dalam larutan vanadat, diaduk lalu diencerkan hingga volume 1 liter. - Persiapan larutan fosfat standar : Sebanyak 3,834 g potassium dihidrogen fosfat kering dilarutkan ke dalam akuades dan diencerkan hingga volume 1 liter. Sebanyak 25 ml larutan tersebut dimasukkan ke dalam labu takar 250 ml dan diencerkan sampai tanda tera (1 ml = 02 P 2 O 5 ).

9 36 - Pembuatan kurva standar : Larutan fosfat standar diambil sebanyak 0; 0,25; 5; 10; 20; 30; 40 dan 50 ml lalu dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml. Masing-masing ditambahkan 25 ml pereaksi vanadat-molibdat kemudian ditera. Larutan didiamkan selama 10 menit, kemudian diukur absorbansinya dnegan spektrofotometer dengan panjang gelombang 400 nm. - Penetapan sampel : Sampel yang telah dipreparasi dipipet 1 ml dan dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml. tambahkan 25 ml pereaksi vanadat-molibdat pada masing-masing labu takar dan diencerkan sampai tanda tera. Setelah didiamkan sampel diukur panjang absorbannya pada panjang gelombang 400 nm. Konsentrasi fosfor dapat diketahui melalui kurva standar berdasarkan absorbans yang terbaca. Perhitungan: %P 2 O 5 = (100/1000 x fp x konsentrasi fosfor x 100) / mg sampel BA P P (mg/100g) = P 2 O 5 X BM P2O5 10) Analisis vitamin C (Sulaeman et al. 1995) - Pembuatan larutan standar : Timbang 0.02 gram vitamin C murni, tambahkan 2 gram asam oksalat Kristal. Kemudian masukkan ke dalam labu takar 100 ml dan encerkan dengan alat suling sampai tanda tera. Pipet 10 ml dan titrasi dengan larutan dye sampai berwarna merah jambu muda. Tunggu sampai warna tersebut tidak berubah selama 15 detik (jumlah ml larutan dye ini digunakan untuk menentukan ekivalen vitamin C). - Pembuatan larutan contoh : Timbang kurang lebih 10 gram bahan dan setelah ditimbang digerus bersama 10 gram asam oksalat Kristal di dalam mortar dengan menggunakan alat penggerus. Masukkan campuran bahan ke dalam labu ukur 250 ml. isi labu ukur dengan air suling dan kocok, kemudian tambahkan air suling hingga tanda tera. Saring dan tampung filtratnya daam Erlenmeyer bersih dan kering. Pipet 10 ml dan masukkan ke dalam Erlenmeyer 50 ml, kemudian titrasi dengan larutan dye sampai berwarna merah jambu selama 15 detik (lakukan triplo).

10 37 Ekivalen vitamin C (E) = mg vitamin C murni mg dye standar Vitamin C/100 gram bahan = 100/A x fp x v E Keterangan : A fp v E = berat bahan = faktor pengenceran = ml larutan dye yang digunakan = ekivalen vitamin C larutan dye A adalah titran. 11) Analisis kandungan gross energy (Almatsier 2006) Penentuan nilai energi makanan melalui perhitungan dapat dilakukan menurut komposisi karbohidrat, lemak, protein, serta nilai energi makanan tersebut. Energi = (4 kkal/g x kadar karbohidrat) + (4 kkal/g x kadar protein) + (9 kkal/g x kadar lemak) d. Perhitungan perbandingan cookies (g) dan minuman (ml) pada berbagai jenis kombinasi Sampel yang dianalisis pada penelitian ini berupa campuran yang merupakan 20 kombinasi antara cookies dan minuman. Pencampuran ini didasarkan pada kondisi kehidupan sehari-hari dimana hampir tidak ada makanan yang dikonsumsi secara tunggal, melainkan bersama dengan jenis makanan atau minuman yang lain. Konsumsi cookies sebagai salah satu jenis makanan kudapan umumnya diiringi dengan konsumsi minuman seperti air putih (AMDK), susu, teh, dan kopi. Oleh karena itu, perlu dihitung perbandingan gram cookies dan ml minuman yang dicampurkan berdasarkan takaran saji masing-masing. Berikut adalah asumsi yang digunakan pada perhitungan perbandingan cookies (g) dan minuman (ml) berbagai jenis kombinasi : Kebutuhan energi rata-rata per hari adalah 2000 Kal, dimana 20% kebutuhan energi (200 Kal) dapat dipenuhi dari 2 x konsumsi snack (cookies). Kebutuhan air rata-rata per hari adalah 2000 ml, dimana kebutuhan air tersebut dapat dipenuhi dari berbagai jenis minuman. Takaran saji atau URT (Ukuran Rumah Tangga) 1 gelas belimbing minuman adalah 200 ml.

11 38 Takaran saji cookies dihitung berdasarkan rumus : Takaran saji cookies (gr) = 20% x 2000 Kal x 100 g Rata-rata kalori per 100 g cookies (Kal) Perbandingan takaran saji pada campuran antara cookies dan minuman adalah 1 : 1 B. Penelitian Lanjutan a. Penetapan bioavailabilitas kalsium dan zat besi secara in vitro metode Dialisis (Roig et al. 1999) - Prinsip analisis : Kalsium dan zat besi sampel dihirolisis dari ikatannya dengan protein menggunakan enzim-enzim pencernaan yang terdapat di lambung dan usus halus. Kalsium bebas yang terdapat dalam larutan sampel akan berdifusi melalui membran semipermeabel ke dalam kantung dialisis yang berisi buffer NaHCO 3. Kalsium dalam dialisat menunjukkan jumlah kalsium yang diserap tubuh. - Preparasi sampel : Semua peralatan gelas dicuci dan direndam alam larutan HNO 3 10% (v/v) selama 24 jam serta dibilas dengan air bebas ion sebelum digunakan. Selanjutnya sampel ditimbang setara dengan 2 g protein dan dicampur bersama 100 ml air bebas ion. Lau ditambahkan HCl 6M hingga sampel memiliki ph 2 (jumlah HCL yang ditambahkan harus dihitung). Sampel kemudian dibagi ke dalam tiga botol gelas berukuran 250 ml. Botol gelas pertama diisi dengan 40 g aliquot sampel untuk penentuan keasaman titrasi. Botol gelas kedua diisi dengan 40 g aliquot sampel untuk penentuan persen mineral besi. Botol gelas ketiga diisi dengan 10 g aliquot sampel untuk penentuan kadar mineral besi total dengan menggunakan AAS - Penetapan sampel : Mula mula ditambahkan 3 g larutan suspensi pepsin dan 20 ml air bebas ion pada masing-masing botol gelas. Masing-masing botol gelas kemudian ditutup dengan plastik yang telah dilubangi untuk mengeluarkan gas lalu diinkubasi dalam penangas air bergoyang pada suhu 37 C dengan kecepatan 5 (120 stroke/menit) selama 2 jam.

12 39 Botol gelas pertama ditambahkan 5 g campuran pankreatin bile lalu dititrasi dengan KOH 0,4N sampai diperoleh ph 7.5. Jumlah KOH yang ditambahkan ekuivalen dengan jumlah NaHCO 3. Selanjutnya sejumlah NaHCO 3 dengan konsentrasi yang diperoleh dari hasil titrasi sampel dengan KOH diencerkan dengan air bebas ion pada labu ukur 100 ml sampai tanda tera, lalu diambil 25 ml untuk dimasukkan ke dalam kantung dialisis Botol gelas kedua yang diisi dengan 40 g aliquot sampel untuk penentuan persen mineral disiapkan. Kantung dialisis dimasukkan ke dalam botol gelas kedua sedemikian rupa sehingga kantung dialisis terendam sempurna. Botol gelas kedua lalu ditutup dengan plastik dan diinkubasi selama 30 menit. Selanjutnya ditambahkan 5 g campuran pankreatin bile pada botol gelas kedua dan inkubasi dilanjutkan selama 2 jam. Setelah inkubasi cukup, kantung dialisis diangkat dan dibilas dengan dicelupkan ke dalam air bebabs ion. Salah satu ujung kantung dialisis dibuka dan isinya (dialisat) dituang ke dalam gelas ukur untuk dihitung volumenya. Kandungan (%) kalsium dan zat besi yang tersedia dapat diukur menggunakan AAS. Botol gelas ketiga yang diisi dengan 10 g aliquot sampel untuk penentuan kadar kalsium dan zat besi tersedia / total dengan menggunakan AAS ditambahkan 5 ml HNO 3 pekat dan H 2 SO 4 pekat dan dipanaskan hingga larutantiak berwarna gelap lagi. Lau ditambahkan 2-3 ml H2O2 30% sampai larutan tidak berwarna (jernih) dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml serta diencerkan hingga tanda tera. Larutan lalu disaring dengan kertas whatman No.42 dan kadar zat besi tersedia diukur dengan AAS pada ƛ = 213,9 nm. Perhitungan : 1) Berat sampel setara 2 g protein = (2/protein sampel) x 100 2) % Kalsium = 100 x fp x absorban sampel absorban blanko 1000 mg sampel x 100% 3) Kebutuhan NaHCO3 (g) = N NaOH x NaOH (ml ) 1000 x 40 x x T1 (g) T2 (g) 4) Bioavailabilitas Kalsium % = mg kalsium dialisat mg kalsium sampel yang dianalisis x 100% 5) Total Ca tersedia (mg/100g) = Ca sampel (mg/100 g) x (% Bioavailabilitas)

13 40 Rancangan Percobaan Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian ini adalah rancangan acak lengkap (RAL) dengan dua kali ulangan. Model yang digunakan adalah sebagai berikut : Y ij = µ + τ I + ε ij Keterangan : Y ij = Nilai pengamatan respon karena pengaruh jenis kombinasi cookies + minuman ke-i pada ulangan ke-j terhadap total kalsium dan zat besi, bioavailabilitas kalsium dan zat besi serta total kalsium dan zat besi tersedia. µ = Nilai rata-rata pengamatan τ I = Pengaruh jenis kombinasi cookies + minuman ke-i ε ij = Kesalahan penelitian karena pengaruh jenis kombinasi cookies + minuman ke-i pada ulangan ke-j (j = 1,2) Pengolahan dan Analisis Data Perhitungan zat gizi kombinasi cookies dan berbagai jenis minuman dilakukan secara manual. Analisis sidik ragam dan uji lanjut dilakukan pada data total kalsium dan zat besi, bioavailabilitas kalsium dan zat besi serta total kalsium dan zat besi tersedia pada berbagai jenis kombinasi cookies dan minuman. Analisis sidik ragam yang digunakan adalah one way ANOVA dengan uji lanjut Duncan. Selain kedua analisis tersebut, dilakukan juga uji korelasi antara jenis kombinasi, total kalsium dan zat besi, bioavailabilitas kalsium dan zat besi serta total kalsium dan zat besi tersedia menggunakan uji korelasi Pearson.