KO-INFEKSI INFECTIOUS MYONECROSIS VIRUS (IMNV) DAN Vibrio harveyi PADA UDANG VANAME (Litopenaeus vannamei) ANWAR HASAN

Transkripsi

1 KO-INFEKSI INFECTIOUS MYONECROSIS VIRUS (IMNV) DAN Vibrio harveyi PADA UDANG VANAME (Litopenaeus vannamei) ANWAR HASAN SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011

2 PERNYATAAN MENGENAI SUMBER TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis dengan judul Ko-infeksi Infectious Myonecrosis Virus (IMNV) dan Vibrio harveyi pada Udang Vaname (Litopenaeus vannamei) adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, Desember 2011 Anwar Hasan NIM C

3 ABSTRACT ANWAR HASAN. Co-infection of Infectious Myonecrosis Virus (IMNV) and Vibrio harveyi in Pacific White Shrimp (Litopenaeus vannamei). Under direction of SUKENDA and WIDANARNI. L. vannamei production in Indonesia was growing intensively. In 2006, IMN (infectious myonecrosis) disease was confirmed spread to Indonesia shrimp farm and declined shrimp production. The study was conducted to investigate effect of dose of V. harveyi on co-infection with IMNV in L. vannamei as well as development of viral infection. Shrimps juvenile were oral infected with IMNV infected shrimps 10 % feeding rate during 3 days and co-infected with 10 6, 10 7 and 10 8 cfu/ml V. harveyi. Mortality rate was 0 % in control and single infection of V. harveyi except 10 8 cfu/ml treatment. Mortality pattern demonstrated on coinfection was faster and higher than single IMNV infection in 14 days observation. The density of green colony Vibrio in hepatopancreas of co-infected shrimps collected in 2, 4, 6, 8 and 10 days post infection were higher than V. harveyi single infected (significantly in 10 days post infection). There were no difference of IMN disease development between co-infection and IMNV single infection. It was confirmed by visual gross sign appeared, tissue and lymphoid organ histophatology, organ abnormality, and PCR test. In conclusion, IMN disease caused higher and faster mortality on co-infection with V. harveyi, but not affect to IMN disease development. Keywords: co-infection, L. vannamei, V. harveyi, IMNV, mortality, gross sign

4 RINGKASAN ANWAR HASAN. Ko-infeksi Infectious Myonecrosis Virus (IMNV) dan Vibrio harveyi pada Udang Vaname (Litopenaeus vannamei). Dibimbing oleh SUKENDA dan WIDANARNI. Penyakit IMN (infectious myonecrosis) adalah penyakit terkini yang menyerang udang Litopenaeus vannamei. Saat ini mortalitas udang akibat penyakit IMN bisa mencapai 70% dan udang yang mengalami kematian tidak menampakkan gejala klinis tingkat lanjut, yaitu sebagian abdomen sampai ekor menjadi merah. Konsep ko-infeksi belum banyak dipelajari di bidang akuakultur, padahal banyak kasus patogen tidak hanya menyerang sebagai infeksi tunggal. Penelitian ini dilakukan untuk menginvestigasi dampak ko-infeksi infectious myonecrosis virus (IMNV) dan Vibrio harveyi pada udang L. vannamei, serta mengamati perkembangan gejala klinis penyakit IMN yang terjadi. Penelitian ini dilakukan pada Januari-Mei 2011 di Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Udang uji diperoleh dengan memelihara benih udang vaname SPF (specific pathogen free) sejak PL (post larvae) 10 hingga berukuran minimal 2 gram. Stok virus adalah udang hidup yang diinfeksi virus IMNV, dan digunakan sebagai sumber infeksi setelah menampakkan symptom penyakit IMN dan diverifikasi dengan PCR (polymerase chain reaction). Sedangkan isolat V. harveyi merupakan koleksi Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini dibagi menjadi dua percobaan. Percobaan 1 yaitu mengetahui dampak ko-infeksi IMNV dengan berbagai dosis V. harveyi. Juvenil udang vaname dengan bobot rata-rata 2.71±0.395 g sebanyak 8 ekor tiap wadah perlakuan dipelihara di akuarium dengan volume 10 liter. Udang uji diberi perlakuan infeksi oral dengan udang yang terinfeksi virus IMNV dengan feeding rate 10% selama 3 hari. Perlakuan terdiri dari infeksi tunggal V. harveyi (10 6, 10 7 and 10 8 cfu/ml), ko-infeksi IMNV dengan V. harveyi (10 6, 10 7 and 10 8 cfu/ml), infeksi tunggal IMNV dan kontrol. Pada perlakuan ko-infeksi, sesaat setelah proses infeksi IMNV, udang uji diinfeksi dengan bakteri V. harveyi 10 6, 10 7 and 10 8 cfu/ml dengan metode imersi. Selanjutnya udang uji dipelihara dan diamati selama 14 hari setelah infeksi. Parameter yang diamati pada Percobaan 1 yaitu mortalitas udang uji. Berdasarkan hasil Percobaan 1, dosis tertinggi infeksi tunggal V. harveyi yang tidak mematikan pada infeksi tunggal namun mematikan pada ko-infeksi dengan IMNV digunakan pada Percobaan 2. Pada percobaan 2, dilakukan pengamatan terhadap 4 perlakuan yaitu infeksi tunggal V. harveyi 10 7 cfu/ml, ko-infeksi IMNV V. harveyi 10 7 cfu/ml, infeksi tunggal IMNV dan kontrol. Juvenil udang vaname dengan bobot rata-rata 2.91±0.312 g sebanyak 15 ekor tiap wadah perlakuan dipelihara di akuarium dengan volume 25 liter. Udang uji dipelihara dan diamati selama 14 hari setelah infeksi. Pada Percobaan 2 dilakukan penghitungan densitas bakteri Vibrio, pengamatan gejala klinis, histopatologi dan uji PCR IMNV. Analisis pada percobaan kedua dilakukan berdasarkan perlakuan ko-infeksi antara virus IMNV dengan V. harveyi.

5 Berdasarkan Percobaan 1, tidak diperoleh mortalitas pada perlakuan kontrol dan infeksi tunggal V. harveyi 10 6 dan 10 7 cfu/ml, namun pada infeksi tunggal V. harveyi 10 8 cfu/ml diperoleh mortalitas rata-rata sebesar 13 %. Sedangkan pada perlakuan ko-infeksi virus IMNV dengan berbagai dosis V. harveyi diperlihatkan adanya mortalitas pada semua perlakuan dengan awal mortalitas yang lebih cepat dan nilai yang lebih tinggi dibandingkan infeksi tunggal IMNV selama pengamatan 14 hari. Densitas Vibrio koloni hijau di hepatopankreas udang yang diisolasi pada hari ke-2, 4, 6, 8, dan 10 pasca infeksi dari perlakuan ko-infeksi IMNV dan V. 7 harveyi 10 cfu/ml selalu lebih tinggi dibandingkan dengan infeksi tunggal V. harveyi 10 7 cfu/ml. Bahkan pada hari ke-10 pasca infeksi densitas Vibrio koloni hijau di hepatopankreas pada perlakuan ko-infeksi mencapai 108x10 5 ± 27,06x10 5 cfu/ml, signifikan lebih tinggi (P<0.05) dibandingkan infeksi tunggal 2x10 5 ± 1x10 5 cfu/ml. Sedangkan jumlah total Vibrio di hepatopankreas mencapai 139,67x10 5 ± 5,69x10 5 cfu/ml, sangat signifikan lebih tinggi (P<0.01) dibandingkan infeksi tunggal 53,67x10 5 ± 6.81x10 5 cfu/ml. Tidak ada perbedaan perkembangan gejala klinis penyakit IMN antara perlakuan infeksi tunggal virus IMNV dan ko-infeksi IMNV dengan V. harveyi 10 7 cfu/ml. Dapat dikonfirmasi bahwa gejala klinis berupa perubahan visual transparansi tubuh akibat nekrosis, histopatologi jaringan otot, histopatologi organ limfoid, abnormalitas organ limfoid dan usus serta pengujian dengan polymerase chain reaction (PCR) menunjukkan hasil yang mirip antara infeksi tunggal IMNV dengan ko-infeksi. Gejala klinis awal terlihat pada hari ke-6 pasca infeksi di kedua perlakuan. Sehingga dapat disimpulkan, bahwa penyakit IMN dapat menyebabkan mortalitas yang lebih cepat dan lebih tinggi pada ko-infeksi dengan bakteri patogen V. harveyi, namun tidak berdampak pada perkembangan gejala klinis penyakit IMN. Kata kunci: ko-infeksi, L. vannamei, V. harveyi, IMNV, mortalitas, gejala klinis

6 Hak Cipta milik IPB, Tahun 2011 Hak Cipta dilindungi Undang-undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

7 KO-INFEKSI INFECTIOUS MYONECROSIS VIRUS (IMNV) DAN Vibrio harveyi PADA UDANG VANAME (Litopenaeus vannamei) ANWAR HASAN Tesis Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Ilmu Akuakultur SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011

8 Penguji luar komisi pada ujian tesis: Dr. Ir. Mia Setiawati, M.Si

9 Judul Tesis : Ko-infeksi Infectious Myonecrosis Virus (IMNV) dan Vibrio harveyi pada Udang Vaname (Litopenaeus vannamei) Nama : Anwar Hasan NIM : C Disetujui, Komisi Pembimbing Dr. Ir. Sukenda, M.Sc Ketua Dr. Ir. Widanarni, M.Si Anggota Diketahui, Ketua Program Studi Ilmu Akuakultur Dekan Sekolah Pascasarjana Prof. Dr. Enang Harris, M.S Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc. Agr Tanggal Ujian: 9 November 2011 Tanggal Lulus:

10 PRAKATA Syukur Alhamdulillah kepada Allah SWT atas rahmat dan karunia-nya, penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan tesis ini dengan baik. Tema penelitian yang penulis pilih adalah penyakit pada udang vaname yaitu mengenai perkembangan penyakit viral infectious myonecrosis (IMN) dan dampak koinfeksinya dengan bakteri oportunis. Penulis memilih tema tersebut karena penulis berfikir perlu menambah khasanah literatur mengenai penyakit IMN yang telah mewabah dan menyebabkan penurunan produksi udang di Indonesia, sehingga bisa menjadi salah satu dasar alternatif penanggulangannya. Tema tersebut diterjemahkan dalam judul tesis Ko-infeksi Infectious Myonecrosis Virus (IMNV) dan Vibrio harveyi pada Udang Vaname (Litopenaeus vannamei). Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada komisi pembimbing yaitu Dr. Sukenda (ketua) dan Dr. Widanarni (anggota) yang telah memberikan bimbingan dan arahannya selama penelitian dan penyusunan tesis ini. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Dr. Mia Setiawati selaku penguji luar komisi atas saran dan masukannya untuk kesempurnaan tesis ini. Kepada ketua program studi Ilmu Akuakultur IPB Prof. Dr. Enang Harris beserta jajaran staf pengajar yang telah mengajarkan ilmunya selama penulis menempuh pendidikan pascasarjana. Kepada Dr. Sri-Nhonghang Supornchai (DuPont Thailand), dan Bapak George Hadi Santoso serta Ibu Secuandra Elania (DuPont Indonesia) yang telah memberikan izin kepada penulis untuk melanjutkan studi di Sekolah Pascasarjana IPB. Selanjutnya terima kasih saya persembahkan kepada ayahanda Syofyan Rahim (alm) dan Ibunda Yohana atas didikan dan kasih sayangnya. Keluarga tercinta, Dewi Eka Prasetyati dan ananda Oryza Al Ghiffari serta Syofia Sakura Fajriani. Semoga tesis ini dapat bermanfaat bagi bidang akuakultur. Bogor, Desember 2011 Anwar Hasan

11 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Penengahan Pios (Kalianda), Lampung Selatan pada tanggal 25 Februari 1982 sebagai putra pertama dari lima bersaudara pasangan Bapak Syofyan Rahim (alm) dan Ibu Yohana. Jenjang pendidikan penulis dimulai di SDN 3 Kalianda pada tahun , kemudian melanjutkan ke SLTPN 1 Kalianda tahun Penulis menempuh pendidikan menengah atas di SMUN 1 Kalianda pada tahun Pada tahun 2000, penulis diterima sebagai mahasiswa Jurusan Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor, dan kemudian memperoleh gelar sarjana strata 1 (S1) pada tahun Penulis melanjutkan pendidikan di Sekolah Pascasarjana IPB pada tahun 2009 pada Program Studi Ilmu Akuakultur. Pada tahun 2005, penulis bekerja sebagai Supervisor Produksi di Pinang Gading Shrimp Farm yaitu perusahaan yang bergerak di industri produksi udang vaname. Selanjutnya pada tahun 2008 hingga saat ini penulis bekerja pada PT. DuPont Agricultural Products Indonesia sebagai Technical Assistant Aquaculture untuk wilayah Indonesia.

12 DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL... ABSTRACT... RINGKASAN... LEMBAR PENGESAHAN... PRAKATA... RIWAYAT HIDUP... DAFTAR ISI... DAFTAR TABEL... DAFTAR GAMBAR... i iii iv viii ix x xi xii xiii DAFTAR LAMPIRAN... xiv I. PENDAHULUAN Latar Belakang Perumusan Masalah Tujuan dan Manfaat Hipotesis... 3 II. TINJAUAN PUSTAKA Infectious Myonecrosis Virus Bakteri Vibrio harveyi Ko-infeksi Patogen pada Udang Vaname... 9 III. METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Organisme Uji Stok Virus dan Bakteri Desain Penelitian Percobaan 1. Dampak Ko-Infeksi IMNV dan Berbagai Dosis V. harveyi terhadap Mortalitas Udang Uji Percobaan 2. Penghitungan Jumlah Bakteri Vibrio, Perkembangan Gejala Klinis Penyakit IMN dan Konfirmasi Virus IMNV di Tubuh Udang Uji dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) Pengukuran Parameter Penghitungan Bakteri Vibrio... 14

13 3.5.2 Histopatologi Gejala Klinis Penyakit IMN Mortalitas Udang Analisis Data IV. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Percobaan 1. Dampak Ko-Infeksi IMNV dan Berbagai Dosis V. harveyi terhadap Mortalitas Udang Uji Percobaan 2. Penghitungan Jumlah Bakteri Vibrio, Perkembangan Gejala Klinis Penyakit IMN dan Konfirmasi Virus IMNV di Tubuh Udang Uji dengan PCR Penghitungan jumlah bakteri Vibrio Perkembangan klinis penyakit IMN Pembahasan V. KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN... 39

14 DAFTAR TABEL Halaman 1. Desain percobaan 1, dampak ko-infeksi virus IMNV dan berbagai dosis bakteri V. harveyi terhadap mortalitas udang uji Desain Percobaan 2, penghitungan densitas bakteri Vibrio, pengamatan gejala klinis, histopatologi dan uji PCR IMNV Pengamatan gejala klinis dan histopatologi Parameter pengamatan gejala klinis (symptom) Penyakit IMN Jumlah bakteri Vibrio (rataan±sd) pada hari ke-10 pasca infeksi Observasi gejala klinis dan mortalitas udang uji Perkembangan gejala klinis luar (visual) dan histopatologi. 24

15 DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Virion IMNV. (Tang et al. 2008) Filogeni IMNV, memiliki kemiripan dengan GLV. (Poulos et al. 2006) Gejala klinis penyakit IMN. (Poulos et al. 2006) Histologi jaringan otot udang yang terinfeksi penyakit IMN dengan pewarnaan haematoxylin eosin dari berbagai sumber Histologi organ limfoid udang. (Andrade et al. 2008).., Mortalitas udang uji pasca infeksi dengan IMNV dan berbagai dosis V. harveyi Jumlah bakteri Vibrio koloni hijau berpendar di tubuh udang Jumlah bakteri Vibrio koloni hijau berpendar di air pemeliharaan Jumlah total bakteri Vibrio di tubuh udang Jumlah total bakteri Vibrio di air pemeliharaan Hasil pengujian PCR udang uji menggunakan kit PCR Nugen- IMNV Sampel udang pada hari ke-14 dengan gejala klinis nekrosis level Abnormalitas organ limfoid dan usus dengan observasi visual Histopatologi jaringan otot udang uji Histopatologi organ limfoid udang uji... 28

16 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. Pembuatan media bakteri (SWC dan TCBS) Prosedur pembuatan preparat histologi jaringan Penghitungan mortality rate (MR) pada Percobaan Penghitungan bakteri Vibrio di tubuh udang Penghitungan bakteri Vibrio di air pemeliharaan Hasil analisis uji T (MINITAB 16) jumlah bakteri Vibrio hijau berpendar dan total Vibrio pada perlakuan infeksi tunggal V. harveyi 10 7 cfu/ml dan ko-infeksi IMNV dengan V. harveyi 10 7 cfu/ml Bobot udang uji (gram) pada Percobaan Bobot udang uji (gram) pada Percobaan

17 1 I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Udang vaname (Litopenaeus vannamei) merupakan udang yang dibudidayakan secara global. Lebih dari 90% produksi udang di Amerika Latin adalah udang vaname (Wurmann et al. 2004). Negara produsen udang di Asia juga beralih membudidayakan udang vaname. Budidaya vaname intensif di Asia menggantikan Penaeus monodon dilakukan sejak tahun 2002, dan 2004 mayoritas sudah membudidayakan udang vaname (Flegel 2006). Penyakit sering menjadi masalah utama dalam budidaya udang. Penyakit pada budidaya udang berdampak negatif terhadap ekonomi di beberapa Negara di Asia, Amerika Selatan dan Amerika yang banyak memiliki industri budidaya udang (Liu et al. 2009). Penyakit yang menyerang udang antara lain penyakit viral IHHN (infectious hypodermal and hematopoietic necrosis), YH (yellow head), WSS (white spot syndrome), TS (taura syndrome) dan penyakit bakterial vibriosis. Penyakit IMN (infectious myonecrosis) adalah penyakit terkini yang menyerang udang vaname (Walker dan Winton 2010). Penyakit IMN ditemukan di Brazil tahun 2002 dan menyebabkan dampak kerugian ekonomi yang signifikan (Costa et al. 2009). Wabah IMNV menyebar ke Indonesia dengan gejala klinis mirip dengan wabah di Brazil pada tahun 2006 (Senapin et al. 2007). Karakteristik virus IMNV diidentifikasi sebagai dsrna virus dari famili Totiviridae (Poulos et al. 2006; Tang et al. 2008). IMNV merupakan non-envelop virus dan virion berbentuk icosahedral dengan ukuran 40 nm (Senapin et al. 2007). Gejala klinis penyakit IMN yaitu hilangnya transparansi pada jaringan otot akibat nekrosis. Pada stadia infeksi lanjutan, warna putih pada distal abdomen dan ekor akibat nekrosis akan berubah menjadi merah dan dapat menyebabkan mortalitas mencapai 70% (Tang et al. 2008). Pola kematian udang akibat serangan penyakit IMN saat awal wabah di Indonesia dan Brazil yaitu pada udang 10 gram atau lebih dengan mortalitas 20-50%. Berdasarkan informasi di lapangan, saat ini mortalitas udang bisa mencapai 70% dan udang yang mengalami kematian tidak memiliki gejala klinis penyakit IMN stadia lanjut, yaitu sebagian abdomen sampai ekor menjadi merah.

18 2 Vibriosis adalah penyakit bakterial pada udang penaeid, dan Vibrio spp. merupakan agen penyakit ini. V. harveyi bersifat patogen pada udang windu, bahkan strain V. harveyi yang virulen dengan kepadatan 10 2 cfu/ml dapat mematikan udang windu 100% pada stadia larva (Lavilla-Pitogo et al. 1990), sedangkan pada udang juvenil V. harveyi dapat mematikan udang vaname hingga 80% pada dosis 10 6 cfu/ml saat ko-infeksi dengan virus WSSV dalam waktu 144 jam (Phuoc et al. 2009). Vibrio spp. bisa bertindak sebagai patogen primer ketika kualitas air buruk (Vandenberghe et al. 1998) namun dapat menjadi patogen sekunder karena Vibrio spp. bersifat oportunis (Saulnier et al. 2000). Banyak kasus patogen tidak hanya menyerang udang sebagai infeksi tunggal. Kejadian ko-infeksi yang sudah dilaporkan antara lain ko-infeksi beberapa virus pada udang vaname seperti WSSV-TSV (Tsai et al. 2002), WSSV- IHHNV (Yeh et al. 2009), TSV-IHHNV (Tan et al. 2009), TSV-IHHNV-WSSV (Tan et al. 2009), dan ko-infeksi virus dengan bakteri seperti WSSV-Vibrio campbelli (Phuoc et al. 2009) serta WSSV-V. harveyi (Phuoc et al. 2009). Koinfeksi antar patogen dapat terjadi karena patogen-patogen tersebut merupakan agen penyebab penyakit dengan inang yang sama yaitu udang penaeid. Sifat patogen oportunis Vibrio spp. akan muncul akibat adanya stres lingkungan atau infeksi primer patogen lain. Infeksi primer WSSV dapat menyebabkan udang menjadi lemah dan meningkatkan infeksi bakteri. Pada udang yang terkena wabah penyakit WSS ternyata ditemukan strain V. alginolyticus yang virulen (Manilal et al. 2010). Investigasi Gomez-Gil et al. (1998) menunjukkan bahwa V. alginolyticus, V. vulnificus, V. parahaemolyticus, V. damsela, Vibrio sp. dapat dideteksi pada udang sehat tanpa gejala klinis vibriosis. Flegel et al. (2004) juga menemukan infeksi WSSV tanpa gejala klinis luar dan kerusakan jaringan. Infeksi sekunder Vibrio spp. pun mempercepat kematian udang yang terinfeksi virus (WSSV) tanpa gejala klinis penyakit WSS maupun vibriosis (Phouc et al. 2009). Berdasarkan informasi tersebut, diduga ada peran ko-infeksi virus IMNV dengan patogen lain pada kasus mortalitas udang stadia juvenil di tambak yang terserang penyakit IMN. Saat ini belum ada informasi mengenai ko-infeksi virus IMNV dengan patogen lain baik bakterial maupun viral.

19 3 1.2 Perumusan Masalah Berdasarkan kejadian penyakit IMN pada budidaya udang di Indonesia maka ada dugaan peran ko-infeksi IMNV dan patogen lain, sehingga menyebabkan mortalitas udang di tambak yang terinfeksi penyakit IMN semakin tinggi. Vibrio spp. terutama Vibrio harveyi sebagai bakteri oportunistik memungkinkan untuk berperan lebih besar dalam mortalitas udang karena kondisi udang yang lemah akibat penyakit yang dialami. 1.3 Tujuan dan Manfaat Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui dampak ko-infeksi IMNV dengan bakteri V. harveyi yang dipengaruhi oleh berbagai dosis infeksi V. harveyi dan menganalisa perkembangan gejala klinis penyakit IMN pada infeksi tunggal serta ko-infeksi. Penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan informasi penting mengenai ko-infeksi virus IMNV dengan V. harveyi dan perkembangan klinis penyakit IMN pada udang vaname. 1.4 Hipotesis Hipotesis dari penelitian ini yaitu ko-infeksi virus IMNV dengan bakteri V. harveyi dapat menyebabkan dampak kematian yang lebih tinggi dan lebih cepat dibandingkan dengan infeksi tunggal virus IMNV maupun bakteri V. harveyi.

20 4 II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Infectious Myonecrosis Virus Virus IMNV (infectious myonecrosis virus) adalah agen penyebab penyakit IMN. Virus ini memiliki genom tunggal dsrna yang tidak bersegmen dengan molekul 7560 bp. Partikel IMNV berbentuk icosahedral dengan diameter 40 nm. IMNV memiliki capsid isometrik dengan protein penyusun 901-asam amino (Tang et al. 2008). Tang et al. (2008) juga melaporkan bentuk virion IMNV dengan cryomicrograph dan rekonstruksi 3-dimensinya (Gambar 1). A B Keterangan: (A) Cryomicrograph virion IMNV yang telah dimurnikan dari sampel kepala udang. Tanda panah adalah contoh protrusi pada permukaan virus. (B) Rekonstruksi 3-dimensi virion IMNV dengan resolusi 8.0-Å. Gambar 1. Virion IMNV. (Tang et al. 2008). Analisis filogeni IMNV telah dilakukan berdasarkan RDA-dependent dari gen RNA polimerase (RdRp), hasilnya IMNV memiliki kemiripan dengan Giardia lamblia virus (GLV) (Gambar 2) yang merupakan bagian dari famili Totiviridae (Poulos et al. 2006). Sebagian besar anggota famili Totiviridae memiliki kekurangan dalam mentransmisikan (menyebarkan) virion melalui media ekstraseluler dalam siklus hidupnya (Lightner et al. 2004). Kebanyakan, penyebaran melalui cara vertikal di dalam sel atau horizontal dengan hyphal anastomiasis kecuali GLV dan IMNV. Sebagai tambahan, IMNV juga merupakan satu-satunya virus dari famili Totiviridae yang diketahui menyebabkan penyakit pada inangnya (Tang et al. 2008). Inang virus IMNV adalah krustase terutama menyerang udang-udang penaeid. Pada prinsipnya inang paling utama dari penyakit IMN adalah udang

21 5 vaname (L. vannamei), karena infeksi IMNV pada udang ini menyebabkan mortalitas yang tinggi dan menyebabkan kerugian ekonomi yang signifikan (Lightner et al. 2004). Dampak paling parah dari penyakit IMN adalah infeksi pada stadia juvenile 2-3 gram (Coelho et al. 2009) dan udang dewasa hingga 12 gram (Nunes et al. 2004) dengan mortalitas lebih dari 60%. Penyakit IMN bisa menyerang udang vaname yang dibudidayakan pada media air laut ataupun air payau bersalinitas rendah (Lightner et al. 2004). Hasil penelitian menunjukkan IMNV juga dapat menginfeksi udang Penaeus stylirostris dan udang Penaeus monodon namun tidak menimbulkan kematian pada udang (Tang et al. 2005). Gambar 2. Filogeni IMNV, memiliki kemiripan dengan GLV. (Poulos et al. 2006). Organ target penyakit IMN adalah otot dan organ limfoid. Jaringan yang terinfeksi yaitu otot skeletal (abdomen), ekor, haemosit, parenchymal cells organ limfoid, sedikit menyerang otot cardiac (Tang et al. 2005). IMNV merupakan tipe virus sistemik dan tidak bereplikasi pada jaringan enteric seperti hepatopankreas, saluran usus dan caeca. Proses kematian udang memerlukan waktu lebih lama karena penyakit IMN bersifat kronis. Udang yang terserang penyakit IMN bisa bertahan hidup meskipun terjadi kerusakan parah (nekrosis) pada otot abdominalnya (Tang et al. 2005).

22 6 Gejala klinis penyakit IMN dapat dilihat secara visual dengan mengamati transparansi otot udang (Gambar 3). Udang yang terserang penyakit IMN akan kehilangan transparansi pada ototnya karena terlihat berwarna putih. Warna putih tersebut adalah nekrosis pada otot skeletal akibat infeksi virus IMNV (Poulos et al. 2006). Gejala klinis lain penyakit IMN dapat dilihat melalui histologi jaringan otot atau organ limfoid dengan pewarnaan haematoxylin - eosin (Gambar 4 dan 5). Pada histologi jaringan otot dapat dilihat bodi inklusi basophilic tunggal maupun berganda yang terdapat pada sitoplasma dan di dekat nukleus (Tang et al. 2005). Selain itu, pada jaringan otot tersebut sering juga ditemukan gumpalan nekrosis yang multifocal (Andrade et al. 2008). Sedangkan pada histologi organ limfoid dapat ditemukan akumulasi lymphoid organ speroids (LOS) yang merupakan hipertropi sel limfoid (Andrade et al. 2008). A B Keterangan: Nekrosis pada otot udang yang terserang wabah penyakit IMN di tambak (A). Nekrosis pada udang eksperimen, diinjeksi virion IMNV (atas) dan udang normal (bawah) (B). Tanda panah menunjukkan nekrosis. Gambar 3. Gejala klinis penyakit IMN. (Poulos et al. 2006).

23 7 A C B D Keterangan: Andrade et al. (2008) (A). Poulos et al. (2006) (B). Coelho et al. (2009) (C). Tang et al. (2005) (D). Tanda panah menunjukkan N (nukleus), S (single inclusion) dan M (multiple inclusions). Skala bar: 50 µm (A, B, C) dan 20 µm (D). Gambar 4. Histologi jaringan otot udang yang terinfeksi penyakit IMN dengan pewarnaan haematoxylin eosin dari berbagai sumber. A B Keterangan: Pewarnaan haematoxylin - eosin (A). Pengamatan organ limfoid udang dengan in situ hybridization (ISH) (B). Tanda panah menunjukkan probe penanda positif terinfeksi virus IMNV. Skala bar: 50 µm. Gambar 5. Histologi organ limfoid udang. (Andrade et al. 2008).

24 8 2.2 Bakteri Vibrio harveyi Vibrio harveyi tergolong dalam divisi Bacteria, klas Shyzomycetes, ordo Eubacteria, famili Vibrionaceae dan genus Vibrio. Bakteri Vibrio memiliki karakteristik Gram negatif, sel tunggal, berbentuk batang pendek yang bengkok (koma) atau lurus, bersifat motile, ukuran sel 1-4 mikron, berpendar dan mempunyai flagella di salah satu kutubnya (Kreig dan Peter 1984). Sifat biokimia Vibrio ini yaitu oksidase positif, fermentatif terhadap glukosa, DNA genomnya mengandung 51% mol guanin dan sitosin (Logan 1994), tidak membentuk gas pada produksi asam dari glukosa dan dapat menggunakan sukrosa sebagai sumber energi. Bakteri V. harveyi menghasilkan lysine dekarboksilase, nitrat reduktase dan sitokrom oksidase serta enzim amilase, chitinase dan lipase (Lavilla-Pitogo et al. 1990). Protease, phospolipase, haemolysin atau eksotoksin merupakan faktor patogenitas penting V. harveyi (Zhang dan Austin 2000). V. harveyi akan terlihat berpendar jika diamati di ruang gelap dan pendarannya dapat bertahan 2-3 hari pada media Thiosulphate Citrate Bile-Salt Sucrose (TCBS). Kemampuan berpendar merupakan hasil aktivitas enzim luciferase yang dapat berfungsi sebagai katalisator dalam proses oksidasi reduksi. Proses oksidasi melibatkan flavin mononukleotida dan aldehid alifatik rantai panjang sebagai substratnya. Senyawa-senyawa tersebut masing-masing diubah menjadi flavin mononukelotida dan asam lemak disertai dengan pelepasan emisi cahaya dengan panjang gelombang 490 nm (Lavilla-Pitogo et al. 1990). Pada umumnya V. harveyi bersifat patogen oportunistik, yaitu organisme yang dalam keadaan normal ada di lingkungan pemeliharaan dan bersifat saprofitik serta berkembang patogenik jika kondisi lingkungan dan inangnya memburuk. Bakteri ini tumbuh secara optimal pada suhu 30 0 C, salinitas antara ppt dengan ph 7,0 dan bersifat anaerobik fakultatif yaitu bakteri yang dapat hidup baik dengan atau tanpa adanya oksigen (Kreig dan Peter 1984). Habitat utama bakteri V. harveyi adalah air laut di daerah tropis, sedimen pantai, dan saluran pencernaan organisme laut. Bakteri Vibrio merupakan patogen yang menyebabkan penyakit vibriosis (Egidius 1987). Vibriosis yang disebabkan

25 9 oleh V. harveyi adalah penyakit bakterial paling utama pada budidaya udang penaeid. Penyakit vibriosis pada budidaya udang terjadi pada stadia larva sampai dewasa. Penyakit vibriosis yang disebabkan bakteri berpendar bersifat akut dan ganas. Udang windu stadia dewasa yang terserang bakteri Vibrio menyebabkan bercak coklat pada karapasnya. Udang yang terserang bakteri Vibrio sering ditemukan berenang di pinggir tanggul, dengan tanda-tanda kulit rusak dan berwarna coklat, nekrosis, organ limfoid berwarna hitam, bagian ekor dan kaki renangnya berwarna kemerahan, insang berwarna coklat, otot atau daging berwarna kecoklatan, ususnya kosong dan gerakannya lemah serta menyentak (Rukyani 1993). Pada uji tantang 3 strain V. harveyi terhadap Penaeus monodon dan P. vannamei menunjukkan gejala lesi pada kutikula, terutama di apendik dan uropod atau kipas ekor (Intaraprasong et al. 2009). Pada stadia larva, infeksi V. harveyi menyebabkan penyakit kunangkunang, bercak merah pada dasar bak pemeliharaan, perubahan warna tubuh menjadi coklat kehitaman dan terjadi penyusutan hepatopankreas (Roza et al. 1997). Pada dosis tinggi (10 7 cfu/udang) semua udang mati dalam 12 jam setelah diinjeksi V. harveyi, sedangkan lethal doses 50% (LD 50 ) salah satu strain V. harveyi 10 2 cfu/udang (Intaraprasong et al. 2009). Sedangkan pada udang vaname, virulensi V. harveyi tidak setinggi ketika menginfeksi udang windu. Pada udang vaname yang terinfeksi V. harveyi, tingkah laku udang tidak berenang menyentak seperti pada udang windu. Pada infeksi V. harveyi 10 5 cfu/ml, menyebabkan udang windu mengalami moulting 43% sedangkan pada udang vaname moulting hanya 10% (Intaraprasong et al. 2009). Bahkan V. harveyi strain BB120 tidak menimbulkan kematian ketika diinfeksi 10 6 cfu/udang (Phuoc et al. 2009). 2.3 Ko-infeksi Patogen pada Udang Vaname Beberapa penelitian telah menunjukkan adanya ko-infeksi atau infeksi bersama beberapa patogen pada udang vaname. Ko-infeksi tersebut bisa disebabkan oleh 2 atau lebih patogen viral dan patogen bakterial. Dilaporkan hasil penelitian yang dilakukan pada 2006 di Taiwan bahwa 75% udang sampel yang dikoleksi dari tambak yang terserang infeksi berat white spot syndrome virus

26 10 (WSSV) juga terinfeksi virus infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) dengan level infeksi berat, medium dan ringan masing-masing 34%, 25% dan 16% (Yeh et al. 2009). Masih di Taiwan, penelitian Tsai et al. (2002) menunjukkan adanya ko-infeksi virus WSSV dan TSV yang dapat dideteksi menggunakan PCR. Ko-infeksi beberapa virus juga dideteksi dari sampel udang vaname yang diambil dari Provinsi Hainan, China. Sebanyak 59.8% sampel terdeteksi mengalami ko-infeksi virus taura syndrome virus (TSV) dan IHHNV, 42.7% sampel terdeteksi ko-infeksi WSSV dan IHHNV, serta ko-infeksi 3 virus WSSV, IHHNV dan TSV diperoleh dari 42.7% sampel (Tan et al. 2009). Ko-infeksi patogen viral dan bakterial juga berdampak negatif pada udang vaname. Ko-infeksi WSSV dan bakteri Vibrio campbellii 10 4 cfu/udang menyebabkan kematian 100% pada 84 hpi (hours post infection), padahal infeksi tunggal V. campbellii 10 4 cfu/udang tidak menyebabkan kematian dan infeksi tunggal WSSV menyebabkan mortalitas 100% pada 156 hpi (Phuoc et al. 2009). Sedangkan ko-infeksi WSSV dengan V. harveyi strain BB cfu/udang menyebabkan mortalitas 80% dalam 360 hpi, dan infeksi tunggal V. harveyi strain BB120 tidak menyebabkan mortalitas pada dosis injeksi 10 6 cfu/udang (Phuoc et al. 2009). Strain V. alginolyticus yang tidak patogen pada udang bisa menjadi virulen pada udang yang terserang virus WSSV, ini dideteksi dari tambak yang terserang wabah penyakit WSS seperti dilaporkan oleh Manilal et al. (2010). Serangan koinfeksi juga bisa terjadi antar bakteri Vibrio spp., misalnya bakteri V. parahaemolyicus dan V. harveyi yang menyebabkan red disease syndrome (Alapide-Tendencia dan Dureza 1997).

27 11 III. METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilakukan pada Januari sampai Mei 2011 bertempat di Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. 3.2 Organisme Uji Organisme uji adalah udang Litopenaeus vannamei SPF (specific pathogen free) yang diperoleh dari hatchery komersial di Anyer, Banten. Benur (post larvae) dipelihara pada kondisi terkontrol untuk mencegah peluang infeksi IMNV dari lingkungan. Sebagai langkah biosecurity maka air pemeliharaan didisinfeksi menggunakan desinfektan kuat. Desinfeksi ganda dilakukan untuk mengurangi keberadaan patogen di air yang akan digunakan untuk penelitian. Desinfeksi ganda tersebut menggunakan kalsium hipoklorit (kaporit) 10 ppm dan kalium mono-persulfat (KMPS) dengan dosis 2 ppm. 3.3 Stok Virus dan Bakteri Stok virus diperoleh dari udang yang terinfeksi virus IMNV, yakni udang dengan symptom penyakit IMN. Verifikasi dilakukan dengan menguji ke laboratorium PCR (kit komersial Nugen-IMNV). Udang terinfeksi dipelihara sebagai stok virus untuk bahan infeksi oral dalam penelitian ini. Otot udang tersebut dicacah dan segera diinfeksikan secara oral. Jenis bakteri yang digunakan pada penelitian ini adalah Vibrio harveyi. Isolat V. harveyi merupakan koleksi Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Institut Pertanian Bogor. Bakteri dikultur ulang untuk menjaga aktivitas dan kemurniannya.

28 Desain Penelitian Percobaan 1. Dampak Ko-Infeksi IMNV dan Berbagai Dosis V. harveyi terhadap Mortalitas Udang Uji Uji ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh ko-infeksi virus IMNV dengan berbagai dosis V. harveyi terhadap mortalitas udang (Tabel 1). Udang uji dengan bobot rata-rata 2.71±0.395 g sebanyak 8 ekor tiap wadah perlakuan dipelihara pada akuarium dengan volume air 10 liter. Bobot rata-rata tersebut dipilih berdasarkan penelitian ko-infeksi skala laboratorium yang dilakukan oleh Phuoc et al. (2009). Administrasi infeksi IMNV dilakukan secara oral dengan modifikasi feeding rate 10% per hari dari bobot biomassa udang uji. Udang diberi pakan otot udang yang terinfeksi penyakit IMN selama 3 hari, kemudian selanjutnya diberi pakan komersial (Coelho et al., 2009). Bakteri diinfeksikan dengan metode imersi pada hari ke-3 setelah infeksi oral IMNV yang pertama. Pemeliharaan dan pengamatan dilakukan selama 14 hari mengacu pada informasi Tang et al. (2005) bahwa udang vaname yang diinfeksi virus IMNV memerlukan waktu 9-13 hari untuk menyebabkan kematian. Data yang dianalisa adalah tingkat mortalitas udang tiap perlakuan, sehingga diperoleh dosis tertinggi infeksi V. harveyi yang tidak mematikan pada infeksi tunggal namun mematikan pada ko-infeksi dengan IMNV. Dosis tersebut akan digunakan pada Percobaan 2. Tabel 1. Desain percobaan 1, dampak ko-infeksi virus IMNV dan berbagai dosis bakteri V. harveyi terhadap mortalitas udang uji. No. Perlakuan (3 ulangan) Administrasi Infeksi IMNV Infeksi V. harveyi (cfu/ml) Jumlah Udang Uji (ekor) VH VH VH IMNV+VH IMNV+VH IMNV+VH Oral Oral Oral IMNV Kontrol Oral - Keterangan: IMNV (Infectious Myonecrosis Virus), VH (Vibrio harveyi)

29 Percobaan 2. Penghitungan Jumlah Bakteri Vibrio, Perkembangan Gejala Klinis Penyakit IMN dan Konfirmasi Virus IMNV di Tubuh Udang Uji dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) Pada percobaan ini dilakukan penghitungan densitas Vibrio pada perlakuan infeksi tunggal V. harveyi, ko-infeksi dan kontrol (Tabel 2). Udang uji dengan bobot rata-rata 2.91±0.312 g sebanyak 15 ekor tiap wadah perlakuan dipelihara pada akuarium dengan volume air 25 liter. Dosis infeksi diperoleh dari percobaan 1 yaitu V. harveyi 10 7 cfu/ml. Dosis tersebut adalah dosis perlakuan yang menghasilkan respon kematian pada ko-infeksi IMNV dan V. harveyi namun tidak berpengaruh terhadap mortalitas ketika diinfeksi V. harveyi saja. Penghitungan bakteri berdasarkan ciri warna koloni Vibrio di media TCBS. Koloni Vibrio tersebut digolongkan menjadi Vibrio hijau (berpendar) dan Vibrio kuning. Penghitungan dilakukan di tubuh udang dan air. Organ sampel tubuh udang yaitu hepatopankreas. Penghitungan dilakukan pada hari ke 2, 4, 6, 8, dan 10 setelah infeksi bakteri. Tabel 2. Desain Percobaan 2, penghitungan densitas bakteri Vibrio, pengamatan gejala klinis, histopatologi dan uji PCR IMNV. No. Perlakuan Pengujian Infeksi Penghitungan Bakteri b, Gejala VH e IMNV f +VH e f IMNV Kontrol IMNV a (hari) - 2 dan 10 2 dan 10 2 atau 10 Klinis c, Histopatologi d (hari) 0, 2, 4, 6, 8, 10 0, 2, 4, 6, 8, 10-0, 2, 4, 6, 8, 10 Keterangan: Uji PCR (a), sampel air dan hepatopankreas (b), sampel udang uji (c), sampel otot dan organ limfoid (d), dosis berdasarkan Percobaan 1 (e), infeksi oral (f). Pada percobaan ini juga diamati perkembangan gejala klinis penyakit IMN pada perlakuan infeksi IMNV dan ko-infeksi. Pengamatan gejala klinis dilakukan sampai 14 hari setelah infeksi. Penghitungan mortalitas dilakukan pada satu wadah atau satu ulangan untuk masing-masing perlakuan. Pengamatan juga dilakukan untuk mengetahui awal munculnya gejala klinis dan mortalitas serta perkembangan penyakit IMN. Pengamatan perkembangan gejala klinis penyakit IMN yang dilakukan yaitu observasi gejala klinis secara visual dan histopatologi (Tabel 3). Pengamatan histopatologi dilakukan pada beberapa organ tubuh udang

30 14 yaitu jaringan otot dan organ limfoid. Pengambilan sampel untuk pengujian histopatologi dilakukan pada hari ke- 0, 2, 4, 6, 8, dan 10 pasca infeksi. Kemudian dibandingkan infeksi virus pada infeksi tunggal IMNV dengan ko-infeksi IMNV dan V. harveyi. Konfirmasi IMNV dilakukan dengan analisis PCR menggunakan kit komersial Nugen-IMNV (hari ke-2 dan 10 setelah infeksi). Tabel 3. Pengamatan gejala klinis dan histopatologi. No Parameter Waktu Pengamatan Sampel Pengamatan (hari) 1 Gejala Klinis 0, 2, 4, 6, 8, 10 Udang uji 2 Histopatologi 0, 2, 4, 6, 8, 10 Otot dan limfoid 3.5 Pengukuran Parameter Penghitungan Bakteri Vibrio Penghitungan bakteri Vibrio dilakukan dengan metode hitungan cawan menggunakan media spesifik TCBS agar. Penghitungan Vibrio dilakukan pada Percobaan 2. Vibrio hijau berpendar diamati minimal 8 jam setelah kultivasi. Pada penelitian ini pengamatan dilakukan antara jam setelah kultivasi. Untuk sampel dari tubuh udang, sampel hepatopankreas digerus dalam tube ependorf dan ditambahkan phosphat buffer saline (PBS) steril hingga 1 ml. Selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat sampai 4. Untuk sampel air pemeliharaan, sebanyak 1 ml air pemeliharaan dimasukkan ke dalam tube ependorf. Selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat seperti dilakukan pada sampel tubuh udang (hepatopankreas). Inokulasi bakteri juga dilakukan pada pengenceran pertama dan ke-3 atau ke-4. Inokulasi dilakukan dengan mengambil 0.1 ml sampel dari pengenceran tersebut dan disebar pada media TCBS Histopatologi Pengamatan parameter histopatologi dilakukan pada otot skeletal dan limfoid udang uji. Histopatologi dilakukan pada Percobaan 2. Sampel udang dengan atau tanpa gejala klinis diperoleh dari setiap perlakuan. Organ sampel yang diambil, difiksasi dengan larutan fiksatif davidson. Organ yang telah difiksasi minimal 24 jam dipotong sebesar 3-5 mm dan 1x1 cm, kemudian jaringan tersebut dimasukkan dalam etanol bertingkat. Proses selanjutnya jaringan dimasukkan dalam xylene lalu paraffin untuk dilakukan proses blocking. Jaringan

31 15 dipotong dengan mikrotom rotary dengan ketebalan 3 5 µm dan diletakkan pada gelas objek. Setelah proses tersebut, dilakukan pewarnaan dengan menggunakan haematoxylin-eosin. Preparat diamati di bawah mikroskop untuk mengamati perubahan jaringan yang mungkin terjadi. Histopatologi dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui tingkat kerusakan organ akibat infeksi IMNV Gejala Klinis Penyakit IMN Pengamatan gejala klinis dilakukan pada Percobaan 2. Pengamatan gejala klinis dari sampel meliputi beberapa stadia. Gejala-gejala klinis tersebut diamati untuk menentukan waktu awal udang menampakkan gejala klinis IMNV dan melihat perkembangan stadia gejala klinis tersebut. Pengamatan harian dilakukan secara visual pada udang uji. Parameter gejala klinis ditentukan berdasarkan modifikasi dari pengelompokan gejala klinis menurut Costa et al. (2009). Tingkat gejala klinis dapat dilihat pada Tabel 4. Tabel 4. Parameter pengamatan gejala klinis (symptom) Penyakit IMN. Level Stadia Gejala Klinis/ Symptom Simbol Tingkat Infeksi 1 Terinfeksi tanpa symptom + Ringan 2 Sedikit warna put ih lebam di ++ Menengah dalam jaringan di beberapa segmen abdomen 3 Sebagian besar jaringan +++ Berat abdomen berwarna putih lebam 4 Bagian abdomen dari arah ekor berwarna merah (jaringan mati) ++++ Berat Mortalitas Udang Mortalitas udang diukur pada Percobaan 1 dan 2. Perhitungan mortalitas udang menggunakan persamaan sebagai berikut: Nt MR = x100% No Keterangan : MR = Mortalitas udang uji Nt = Jumlah udang mati pada waktu t No = Jumlah udang pada awal pemeliharaan

32 Analisis Data Analisis statistik untuk mengetahui perbedaan densitas bakteri Vibrio hijau dan total Vibrio di tubuh udang antar perlakuan dievaluasi dengan t-test analysis menggunakan software MINITAB (versi 16 untuk windows). Hasil pengamatan lain seperti mortalitas udang dan gejala klinis penyakit dianalisa secara deskriptif.

33 17 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil Percobaan 1. Dampak Ko-Infeksi IMNV dan Berbagai Dosis V. harveyi terhadap Mortalitas Udang Uji Pada penelitian ini, udang uji yang diinfeksi tunggal dengan V. harveyi 10 6 dan 10 7 cfu/ml tidak mengalami mortalitas. Pada dosis infeksi yang lebih tinggi (V. harveyi 10 8 cfu/ml) diperoleh hasil bahwa infeksi tunggal V. harveyi menyebabkan awal mortalitas pada pengamatan hari ke-6 setelah infeksi sebesar 13%. Namun setelah hari ke-6 tidak ditemukan adanya mortalitas udang tambahan hingga akhir pengamatan pada hari ke-14 pasca infeksi (Gambar 6). Hasil pengamatan infeksi tunggal IMNV pada Percobaan 1 menunjukkan bahwa mortalitas mulai terjadi pada hari ke-9 pasca infeksi sebesar 4.2% dan mortalitas kumulatif pada akhir pengamatan (hari ke-14) sebesar 38%. Hasil akhir pengamatan mortalitas tersebut identik dengan hasil perlakuan ko-infeksi IMNV dan V. harveyi dosis 10 6 cfu/ml. 60 Mortalitas (%) Waktu Pengamatan (Hari) V. harveyi 6 Log cfu/ml V. harveyi 7 Log cfu/ml V. harveyi 8 Log cfu/ml IMNV IMNV-V. harveyi 6 Log cfu/ml IMNV-V. harveyi 7 Log cfu/ml IMNV-V. harveyi 8 Log cfu/ml Kontrol Gambar 6. Mortalitas udang uji pasca infeksi dengan IMNV dan berbagai dosis V. harveyi. Mortalitas udang yang lebih tinggi dan lebih cepat diperoleh dari pengamatan perlakuan ko-infeksi IMNV dengan V. harveyi pada dosis 10 7 dan 10 8 cfu/ml. Pada ko-infeksi IMNV dan V. harveyi 10 7 cfu/ml, mortalitas mulai terdeteksi pada pengamatan hari ke-7 pasca infeksi sebesar 8.3%, sedangkan

34 18 untuk dosis V. harveyi 10 8 cfu/ml mortalitas awal terjadi pada pengamatan hari ke-3 pasca infeksi sebesar 4.2%. Hasil akhir pengamatan pada hari ke-14 menunjukkan bahwa ko-infeksi IMNV dan dosis V. harveyi 10 7 cfu/ml menyebabkan mortalitas kumulatif mencapai 46% sedangkan pada dosis 10 8 cfu/ml mortalitas kumulatif mencapai 54% Percobaan 2. Penghitungan Jumlah Bakteri Vibrio, Perkembangan Gejala Klinis Penyakit IMN dan Konfirmasi Virus IMNV di Tubuh Udang Uji dengan PCR Penghitungan jumlah bakteri Vibrio Penghitungan jumlah bakteri Vibrio dilakukan di tubuh udang uji dan air pemeliharaannya. Penghitungan dilakukan pada 3 perlakuan yaitu infeksi tunggal V. harveyi 10 7 cfu/ml, ko-infeksi IMNV dengan V. harveyi 10 7 cfu/ml dan kontrol. Sampel penghitungan bakteri di tubuh udang diperoleh dari organ hepatopankreas. Jumlah bakteri Vibrio koloni hijau berpendar pada tubuh udang awal adalah 0 cfu/udang. Setelah infeksi bakteri dilakukan, bakteri Vibrio koloni hijau berpendar dapat ditemukan atau diisolasi dari organ sampel pada perlakuan ko-infeksi dan infeksi tunggal V. harveyi 10 7 cfu/ml (Gambar 7). Jumlah Bakteri (Log cfu/udang) Waktu Pengamatan (Hari) V. harveyi (7 Log cfu/ml) IMNV + V. harveyi (7 Log cfu/ml) Kontrol Gambar 7. Jumlah bakteri Vibrio koloni hijau berpendar di tubuh udang. Bakteri Vibrio koloni hijau berpendar ditemukan pada setiap pengambilan sampel pada perlakuan ko-infeksi namun untuk infeksi tunggal V. harveyi mulai ditemukan pada hari ke-8 pasca infeksi. Pada perlakuan ko-infeksi, bakteri Vibrio koloni hijau berpendar pada hari ke-2 yaitu 4.65 Log cfu/udang (4.5 x 10 4

35 19 cfu/udang). Koloni bakteri Vibrio hijau berpendar cenderung bertambah tinggi pada pengambilan sampel berikutnya, dan koloni bakteri tersebut paling tinggi ditemukan pada hari ke-10 pasca infeksi yaitu 7.03 Log cfu/udang (1.08 x 10 7 cfu/udang). Vibrio koloni hijau berpendar hanya ditemukan 2 kali pada perlakuan infeksi tunggal V. harveyi 10 7 cfu/ml dan tidak ditemukan pada perlakuan kontrol. Bakteri Vibrio koloni hijau berpendar pada perlakuan infeksi tunggal V. harveyi 10 7 cfu/ml diisolasi dari hari ke-8 (3.30 Log cfu/udang atau 2 x 10 3 cfu/udang) dan hari ke-10 (5.30 Log cfu/udang atau 2 x 10 5 cfu/udang) pasca infeksi. Penghitungan bakteri Vibrio koloni hijau berpendar juga dilakukan di air pemeliharaan. Jumlah bakteri Vibrio koloni hijau berpendar pada perlakuan koinfeksi IMNV dan V. harveyi 10 7 cfu/ml yang diperoleh dari 5 waktu pengambilan sampel selalu lebih tinggi dari 6 Log cfu/ml atau 10 6 cfu/ml (Gambar 8). Jumlah terkecil yang ditemukan yaitu pada hari ke-2 sebesar 6.37 Log cfu/ml (2.33 x 10 6 cfu/ml), dan terbesar pada hari ke-6 sebesar 7 Log cfu/ml (1.01 x 10 7 cfu/ml). Untuk perlakuan infeksi tunggal V. harveyi 10 7 cfu/ml, jumlah Vibrio koloni hijau berpendar yang ditemukan cenderung mengalami penurunan. Pada dua pengamatan pertama yaitu hari ke-2 dan 4 pasca infeksi, jumlah Vibrio hijau berpendar yang ditemukan di atas 6 Log cfu/ml (10 6 cfu/ml). Namun pada pengamatan selanjutnya (hari ke- 4, 6 dan 10 pasca infeksi) bakteri Vibrio koloni hijau berpendar yang ditemukan antara 5 Log cfu/ml sampai 6 Log cfu/ml ( cfu/ml). Sedangkan pada kontrol, koloni Vibrio hijau berpendar tidak ditemukan. Jumlah Bakteri (Log cfu/ml) Waktu Pengamatan (Hari) V. harveyi (7 Log cfu/ml) IMNV + V. harveyi (7 Log cfu/ml) Kontrol Gambar 8. Jumlah bakteri Vibrio koloni hijau berpendar di air pemeliharaan.

36 20 Selain terhadap bakteri Vibrio hijau berpendar, penghitungan juga dilakukan terhadap total bakteri Vibrio di tubuh udang dan air pemeliharaan. Pada perlakuan infeksi tunggal V. harveyi 10 7 cfu/ml maupun ko-infeksi, bakteri Vibrio selalu ditemukan pada setiap pengambilan sampel. Pada kedua perlakuan tersebut densitas terendah Vibrio diperoleh pada pengamatan hari ke-2 dan tertinggi pada hari ke-8 pasca infeksi (Gambar 9). Sedangkan pada kontrol, densitas Vibrio terendah pada pengamatan hari ke-2 dan tertinggi pada hari ke-6 pasca infeksi. Jumlah Bakteri (Log cfu/udang) Waktu Pengamatan (Hari) 6.08 V. harveyi (7 Log cfu/ml) IMNV + V. harveyi (7 Log cfu/ml) Kontrol Gambar 9. Jumlah total bakteri Vibrio di tubuh udang. Pada perhitungan total bakteri Vibrio di air pemeliharaan, bakteri Vibrio selalu ditemukan pada setiap pengambilan sampel di ke-3 perlakuan. Berdasarkan 5 kali pengambilan sampel (hari ke-2, 4, 6, 8 dan 10 pasca infeksi) terjadi kecenderungan peningkatan total Vibrio selama pengamatan (Gambar 10). Jumlah Bakteri (Log cfu/ml) Waktu Pengamatan (Hari) 6.99 V. harveyi (7 Log cfu/ml) IMNV + V. harveyi (7 Log cfu/ml) Kontrol Gambar 10. Jumlah total bakteri Vibrio di air pemeliharaan.

37 21 Analisis statistik dengan uji T dilakukan untuk membandingkan jumlah bakteri Vibrio yang ditemukan di tubuh udang pada hari ke-10 pasca infeksi. Pada perlakuan infeksi tunggal Vibrio harveyi jumlah Vibrio hijau berpendar yang diisolasi pada hari ke-10 pasca infeksi yaitu 2x10 5 ± 1x10 5 cfu/ml. Nilai tersebut berbeda signifikan (P<0.05) jika dibandingkan dengan jumlah Vibrio hijau berpendar di tubuh udang pada perlakuan ko-infeksi yaitu sebesar 108x10 5 ± 27,06x10 5 cfu/ml (Tabel 5). Perbedaan sangat signifikan diperoleh pada analisis jumlah total bakteri Vibrio yang diisolasi pada perlakuan infeksi tunggal dan koinfeksi (P<0.01). Pada infeksi tunggal diperoleh densitas total Vibrio 53,67x10 5 ± 6.81x10 5 cfu/ml sedangkan pada ko-infeksi 139,67x10 5 ± 5,69x10 5 cfu/ml. Tabel 5. Jumlah bakteri Vibrio (rataan±sd) pada hari ke-10 pasca infeksi. Perlakuan Vibrio Hijau Berpendar Total Vibrio (cfu/udang)* (cfu/udang)** Infeksi tunggal V. harveyi 2x10 5 ± 1x10 5 a 53,67x10 ± 6.81x10 5 a Ko-infeksi 108x10 5 ± 27,06x10 5 b 139,67x10 5 ± 5,69x10 5 b Keterangan: hp=hepatopankreas. )*=berbeda nyata antara 2 perlakuan (P<0.05). )**=berbeda nyata antara 2 perlakuan (P<0.01) Perkembangan klinis penyakit IMN Perkembangan klinis penyakit IMN diamati pada perlakuan infeksi tunggal IMNV, ko-infeksi IMNV dengan V. harveyi 10 7 cfu/ml dan kontrol untuk mengetahui awal munculnya gejala klinis, mortalitas awal dan total mortalitas pada akhir pengamatan (Tabel 6). Tabel 6. Observasi gejala klinis dan mortalitas udang uji. Perlakuan Gejala Klinis Mortalitas Mortalitas Konfirmasi PCR # (Hari) (Hari) kumulatif Hari Hari (%) ke-2 ke-10 IMNV sampel: 2 sampel: Ko-infeksi 6 4)* 10)** semua (-) 40 2 sampel: semua (-) (+) dan (-) 2 sampel: semua (+) Kontrol Tidak ada Tidak ada 0 1 sampel: (-) 1 sampel: (-) Keterangan: )* mortalitas akibat infeksi V. harveyi; )**kematian awal akibat infeksi virus IMNV; )# nekrosis/ lebam putih pada otot Hasil pengamatan yang dilakukan menunjukkan bahwa pada perlakuan infeksi tunggal IMNV maupun ko-infeksi, gejala klinis visual berupa warna putih

38 22 lebam pada jaringan otot pertama kali terlihat pada hari ke-6 pasca infeksi. Namun untuk perlakuan kontrol, tidak ditemukan adanya gejala klinis selama dilakukannya pengamatan. Mortalitas yang diamati adalah mortalitas awal dan mortalitas kumulatif setelah 14 hari pengamatan. Mortalitas awal perlakuan infeksi tunggal IMNV didapat pada hari ke-10 pasca infeksi dan mortalitas kumulatif sebesar %. Sedangkan pada perlakuan ko-infeksi IMNV dan V. harveyi 10 7 cfu/ml mortalitas dengan gejala klinis penyakit IMN diperoleh pada hari ke-10 pasca infeksi. Sebelumnya pada perlakuan ko-infeksi ditemukan juga mortalitas pada hari ke-4 pasca infeksi, namun mortalitas tersebut belum ditemukan gejala klinis penyakit IMN sehingga diduga kematian udang lebih disebabkan oleh infeksi V. harveyi. Mortalitas kumulatif (hari ke-14 pasca infeksi) pada perlakuan ko-infeksi adalah 40 %. Pada perlakuan kontrol tidak ditemukan mortalitas maupun gejala klinis penyakit IMN pada udang uji. Pengamatan akhir perlakuan kontrol di hari ke-14, menunjukkan nilai mortalitas kumulatif sebesar 0 %. Konfirmasi keberadaan virus IMNV di tubuh udang uji dilakukan dengan mengirimkan sampel ke laboratorium PCR. Pengujian PCR dilakukan pada 3 perlakuan yaitu infeksi tunggal IMNV, ko-infeksi IMNV dengan Vibrio harveyi 10 7 cfu/ml dan kontrol. Pengujian dilakukan pada pengamatan hari ke-2 dan 10 pasca infeksi. Hasil uji PCR menggunakan kit komersial Nugen-IMNV menunjukkan bahwa pada sampel hari ke-2 setelah infeksi, ke-3 perlakuan menunjukkan IMNV negatif (Tabel 6 dan Gambar 11). Berarti udang uji tidak atau belum terinfeksi oleh virus IMNV atau terinfeksi namun densitas virus masih rendah sehingga tidak bisa dideteksi oleh kit PCR Nugen-IMNV. Pengujian yang dilakukan pada hari ke-10 pasca infeksi, perlakuan infeksi tunggal menunjukkan hasil 1 sampel positif terinfeksi IMNV dan 1 sampel lainnya negatif. Perlakuan ko-infeksi IMNV dan V. harveyi 10 7 cfu/ml menunjukkan bahwa 2 sampel yang diuji positif terinfeksi virus IMNV. Sedangkan perlakuan kontrol menunjukkan hasil negatif terinfeksi virus IMNV. Observasi perkembangan gejala klinis dilakukan setiap 2 hari setelah infeksi terhadap parameter seperti gejala klinis visual lebam putih atau nekrosis,

39 23 histopatologi organ limfoid dan jaringan otot, serta gejala-gejala klinis lain yang diperoleh selama observasi (Tabel 7). A 1250 bp 700 bp 400 bp 300 bp 527 bp 314 bp M C- C B 1250 bp 700 bp 400 bp 300 bp 527 bp 314 bp M C- C Keterangan: Sampel hari ke-2 (A) dan 10 (B) pasca infeksi. Marker (M), kontrol positif (C+), kontrol negatif (C-), perlakuan infeksi tunggal IMNV (1), perlakuan ko-infeksi IMNV dan V. harveyi 10 7 cfu/ml (2) dan kontrol (3). Adanya pita pada 314 bp menunjukkan sampel positif terinfeksi IMNV. Gambar 11. Hasil pengujian PCR udang uji menggunakan kit PCR Nugen-IMNV. Seperti disebutkan pada Tabel 6, gejala klinis awal berupa munculnya nekrosis dengan bentuk visual berwarna putih (tidak transparan) pada otot muncul pertama kali pada hari ke-6 pasca infeksi. Gejala klinis tersebut muncul bersamaan baik pada perlakuan infeksi tunggal IMNV maupun ko-infeksi IMNV dan V. harveyi. Gejala klinis tersebut termasuk level 2 berdasarkan Costa et al. (2009), yaitu terdapat sedikit nekrosis pada abdomen udang. Pada ke-2 perlakuan sampai hari ke-10 setelah infeksi IMNV gejala klinis visual tersebut tetap pada level 2. Namun pada hari ke-12 dan 14 pasca infeksi, pada ko-infeksi ditemukan udang pada level 3 yaitu hampir seluruh otot mengalami nekrosis (Gambar 12).

40 24 Tabel 7. Perkembangan gejala klinis luar (visual) dan histopatologi. No Gejala Klinis Infeksi Tunggal IMNV (Hari) Ko-infeksi IMNV dan V. harveyi (Hari) Gejala klinis luar (visual) Histopatologi otot n n n n BI NA NA n n n BI BI NA NA 3 Gejala klinis organ limfoid (visual) - ukuran n n n n n n n n n n n n n n - warna n n n n n Mrh Mrh n n n n n n Mrh 4 Histologi organ limfoid n n n Ab Ab NA NA n n n Ab Ab NA NA 5 Pengamatan visual organ lain (usus) n n n n n n n n n n n n n Ab Keterangan: ++ (sedikit nekrosis/ lebam putih pada otot); +++ (nekrosis/ lebam putih tampak jelas di otot udang); BI (badan inklusi); Mrh (merah); Ab (abnormal); n (normal); NA (not available/ tidak diamati). A B C Keterangan: Sampel udang infeksi tunggal (A); sampel udang ko-infeksi (B); dan udang normal (C). Gambar 12. Sampel udang pada hari ke-14 dengan gejala klinis nekrosis level 3.

41 25 Pada pengamatan gejala klinis berupa abnormalitas secara visual diperoleh juga abnormalitas pada organ limfoid dan organ usus (Tabel 7 dan Gambar 13). Abnormalitas pada organ limfoid berupa perbedaan warna visual organ limfoid dengan udang normal. Organ limfoid tersebut berwarna kemerahan dan terjadi pada kedua perlakuan. Abnormalitas juga terjadi pada organ usus namun hanya ditemukan pada ko-infeksi. Masing-masing abnormalitas tersebut tidak ditemukan di awal pengamatan setelah infeksi. Abnormalitas warna organ limfoid dan usus ditemukan pada pengamatan hari ke-12 dan 14 pasca infeksi. A B C Keterangan: Warna organ limfoid pada udang normal (A); warna organ limfoid pada udang perlakuan infeksi tunggal IMNV (B); abnormalitas bentuk usus dan warna organ limfoid udang perlakuan ko-infeksi (C). Tanda panah menunjukkan organ limfoid dan usus. Gambar 13. Abnormalitas organ limfoid dan usus dengan observasi visual.

42 26 Pengamatan perkembangan klinis juga dilakukan dengan pengamatan histopatologi jaringan otot dan organ limfoid udang uji. Pengamatan histologi hanya dilakukan sampai hari ke-10. Abnormalitas sel ditandai dengan ditemukannya badan inklusi (Gambar 14). Badan inklusi pada jaringan otot pada perlakuan ko-infeksi mulai ditemukan pada hari ke-8 pasca infeksi. Sedangkan pada perlakuan infeksi tunggal IMNV, badan inklusi ditemukan pada hari ke-10 pasca infeksi. Abnormalitas organ limfoid melalui pengamatan histopatologi diperoleh juga pada hari ke-8, namun limfoid organ speroid dapat dilihat pada sampel yang diambil pada hari ke-10 pasca infeksi. Abnormalitas tersebut terlihat dari bentuk sel yang abnormal pada histologi organ limfoid. (Gambar 15).

43 27 A B C Keterangan: Infeksi tunggal IMNV (A); ko-infeksi (B); dan kontrol (C). Tanda panah menunjukkan badan inklusi. (Skala bar: 50 µm). Gambar 14. Histopatologi jaringan otot udang uji.

44 28 A B C Keterangan: Infeksi tunggal IMNV (A); ko-infeksi (B); dan kontrol (C). (Skala bar: 50 µm). Gambar 15. Histopatologi organ limfoid udang uji.