6. MEKANISME KERJA ANTIBAKTERI CAMPURAN METABOLIT Lb. plantarum kik- MAG MINYAK KELAPA TERHADAP BAKTERI PATOGEN PANGAN ABSTRAK

Transkripsi

1 6. MEKANISME KERJA ANTIBAKTERI CAMPURAN METABOLIT Lb. plantarum kik- MAG MINYAK KELAPA TERHADAP BAKTERI PATOGEN PANGAN ABSTRAK Mekanisme antibakteri campuran metabolit Lb. plantarum kik-mag minyak kelapa dipelajari pada dosis MIC yang telah diperoleh pada penelitian tahapan sebelumnya. Dosis 1 dan 2 MIC dapat meningkatkan kebocoran terhadap bakteri Gram positif (L. monocytogenes dan B. cereus) maupun terhadap bakteri Gram negatif (S. Typhimurium). Kebocoran sel yang diukur dengan spektrofotometer menunjukkan peningkatan absorbansi sebesar 0,33 atau dari 0,33 menjadi 0,66 untuk asam nukleat dan 0,46 atau dari 0,41 menjadi 0,87 untuk protein. Kebocoran ion-ion logam ditunjukkan dengan peningkatan sebesar 40,2% untuk ion Ca 2+ dan 22,1% untuk ion K +. Pengamatan kerusakan sel dengan SEM (Scanning Electron Microscopy) terhadap L. monocytogenes dan S. Typhimurium menunjukkan adanya perubahan morfologi sel baik pada konsentrasi 1 MIC maupun pada konsentrasi 2 MIC, dengan perubahan yang paling parah terjadi pada pemberian dosis campuran metabolit Lb. plantarum kik-mag minyak kelapa 2 MIC. PENDAHULUAN Inaktivasi bakteri merupakan hasil interaksi suatu senyawa anti mikroba dengan bagian tertentu dari sel mikroba. Interaksi senyawa antimikroba tersebut dapat menyebabkan sejumlah perubahan atau kerusakan sel bakteri yang akhirnya dapat mempengaruhi fungsi metabolisme sel, bahkan pada kerusakan yang parah dapat menimbulkan kematian sel bakteri. Aktivitas suatu senyawa antimikroba dapat menyebabkan rusaknya permeabilitas membran dan menimbulkan kebocoran pada komponen intraseluler, seperti natrium glutamat, natrium hidrogen fosfat, nukleotida, kalium dan fosfat organik (Nychas dan Tassou 2000). Perubahan atau kerusakan oleh suatu senyawa antimikroba pada sel bakteri umumnya dinyatakan dalam bentuk kebocoran sel, perubahan ukuran dan ketebalan dinding sel, maupun penampakan sitoplasma. Dari kebocoran sel dapat diamati derajat kerusakan dinding dan membran sel. Derajat kerusakan dinding sel diukur dari jumlah ion Ca 2+ yang terdapat pada dinding sel, sedangkan derajat kerusakan membran dapat diukur dari bahan-bahan yang dilepaskan oleh sel yang dapat diserap pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm (Bunduki et al. 1995). Kerusakan sel oleh senyawa antibakteri telah diamati oleh beberapa peneliti

2 82 sebelumnya dengan menggunakan SEM, diantaranya Naufalin (2005) pada ekstrak bunga kecombrang, dan Parhusip (2006) pada ekstrak buah andaliman terhadap berbagai bakteri Gram positif dan Gram negatif. Hasil penelitian tersebut umumnya dilaporkan bahwa kerusakan pada sel diawali dengan rusaknya membran sel yang berlanjut dengan keluarnya material isi sel dan akhirnya sel mengalami kematian. Menurut Park et al. (2003) komponen sel yang bocor keluar sel dapat diukur pada panjang gelombang 260 nm seperti DNA (purin, pirimidin ribonukleotida), sedangkan pada panjang gelombang 280 nm dapat mengukur tirosin dan triptofan. Burth dan Reinders (2003) menyatakan bahwa kerusakan dinding sel akibat interaksi dengan senyawa antimikroba dapat juga diamati dengan menggunakan Scanning electron microscopy (SEM ). Campuran metabolit Lb. plantarum kik-mag minyak kelapa berpotensi menghambat ataupun menginaktifkan mikroba patogen. Hal ini didasarkan pada adanya berberapa komponen di dalam campuran metabolit Lb. plantarum kik- MAG yang bersifat sebagai antimikroba, seperti asam laktat, asam asetat, asam sitrat maupun asam lemak dalam MAG minyak kelapa berupa asam kaprilat, asam kaprat, laurat maupun miristat. Semua komponen tersebut di atas telah terbukti aktivitasnya sebagai senyawa antimikroba berdasarkan hasil penelitian dari Wang et al. (1993), Mappiratu et al. (2002), dan Jenie et al. (2001). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui mekanisme kerja antibakteri campuran metabolit Lb. plantarum kik-mag minyak kelapa terhadap bakteri patogen (L. monocytogenes, B. cereus dan S. Typhimurium) dengan pengukuran protein, asam nukleat dan ion-ion logam dari bakteri uji serta perubahan morfologi sel menggunakan SEM. METODOLOGI Bahan dan Alat Isolat bakteri asam laktat yang digunakan adalah Lb. plantarum kik yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Pangan, sedangkan MAG minyak kelapa diperoleh dari Laboratorium Agroindustri Fakultas Pertanian Universitas Tadulako Palu (Sulawesi Tengah).

3 83 Bakteri uji yang digunakan adalah L. monocytogenes (FNCC 0156), Bacillus aureus (FNCC 057) dan S. Typhimurium (FNCC 0734) yang diperoleh dari Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi UGM. Semua media mikrobiologi diperoleh dari Oxoid Ltd. Pengamatan dengan SEM dilakukan di Laboratorium Naval Medicine Research Unit (NAMRU) dan Laboratorium Fisika Biomaterial Universitas Indonesia (UI). Persiapan isolat bakteri uji Sebanyak satu ose bakteri dari stok agar miring diinokulasikan ke dalam medium nutrien broth (NB) dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Sebanyak 1 ml kultur bakteri ditambahkan ke dalam 9 ml media NB dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Kultur bakteri uji sebanyak 10 6 CFU/ml digunakan dalam pengujian kebocoran protein dan asam nukleat, serta perubahan morfologi sel bakteri yang diberi campuran metabolit Lb. plantarum kik-mag minyak kelapa. Produksi metabolit bakteri asam laktat Produksi metabolit Lb. plantarum kik dipersiapkan secara bertahap dengan mengikuti metode Jenie et al. (2000) sebagai berikut: kultur Lb. plantarum kik sebanyak 1 ml diambil dari stok masing-masing dan diinokulasi ke dalam 9 ml MRS Broth, diinkubasi pada suhu 37 o C selama 2 hari. Sebanyak 4% (v/v) kultur tersebut diinokulasikan ke dalam media steril MRSB modifikasi (MRSB di tambah 2% glukosa, 2% ekstrak khamir, 1% tripton) selanjutnya diinkubasi selama 2 hari pada suhu 37 o C. Produk fermentasi dipisahkan dari masa sel dengan cara sentrifus yang berlangsung pada rpm selama 15 menit. Supernatan yang terbentuk dipisahkan dari endapan dengan menyaring menggunakan kertas saring whatman ukuran 0.22 µm, kemudian dicampur dengan MAG minyak kelapa dengan perbandingan 5:3 atas dasar v/v.

4 84 Analisis kebocoran protein dan asam nukleat (Bunduki et al. 1995) Suspensi bakteri uji yang telah ditumbuhkan selama 24 jam dalam media nutrien broth sebanyak 10 ml diambil dan disentrifus dengan kecepatan 3500 rpm selama 20 menit. Filtrat dibuang lalu pelet dalam tabung dicuci dengan buffer fosfat ph 7,0 sebanyak 2 kali, kemudian disuspensikan di dalam 10 ml buffer fosfat ph 7,0. Selanjutnya ditambahkan campuran metabolit Lb. plantarum kik-mag minyak kelapa dengan dosis 1 MIC, 2 MIC dan kontrol, dan diinkubasi dalam inkubator goyang selama 24 jam. Suspensi disentrifus dengan kecepatan 3500 rpm selama 20 menit, lalu disaring dengan tujuan untuk memisahkan supernatan dari sel. Cairan supernatan diambil dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm dengan menggunakan spektrofotometer. Kebocoran ion-ion logam ( Park 1996 ) Untuk analisis kebocoran ion-ion diukur dalam bentuk ion Ca 2+ dan K + yang dilepaskan oleh sel bakteri akibat pemberian metabolit Lb. plantarum kik- MAG minyak kelapa. Analisis kebocoran ion dilakukan pada pelet bakteri yang dipersiapkan seperti pada pengukuran kebocoran protein dan asam nukleat. Kebocoran dinyatakan dengan terukurnya ion-ion logam yang terdapat pada bakteri uji setelah dikontakkan dengan metabolit Lb. plantarum kik-mag minyak kelapa pada berbagai tingkat (1 dan 2 MIC) dibandingkan dengan kontrol. Kebocoran ionion K + dan Ca 2+ dideteksi dengan menggunakan AAS (Atomic Absorption Spectrophotometer). Pelet sel hasil kontak dengan metabolit Lb. plantarum kik- MAG minyak kelapa dicuci dengan air bebas ion steril sebanyak 3 kali. Pelet yang telah bersih ditimbang, diabukan dengan cara pengabuan basah. Pengamatan morfologi sel dengan SEM (Scanning Electron Microscopy ) ( JEOL 1995, Noor 2001). Analisis kerusakan morfologi sel dimaksudkan untuk mempelajari perubahan morfologi dan struktur sel dari L. monocytogenes dan S. Typhimurium akibat pengaruh campuran metabolit Lb. plantarum kik-mag minyak kelapa yang meliputi pola kerusakan morfologi dan struktur bakteri sel, serta kerusakan dinding sel dan membran sitoplasma.

5 85 Metode SEM dilakukan dengan cara suspensi sel bakteri uji yang telah diberi perlakuan 0 MIC, 1 MIC dan 2 MIC diinkubasi selama 24 jam pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 37 o C untuk B. cereus dan suhu ruang untuk L. monocytogenes. Setelah itu suspensi sel disentrifus pada 3500 rpm selama 20 menit, supernatan dibuang dan diambil peletnya untuk kemudian dicuci dengan buffer fosfat sebanyak 2 kali. Pelet selanjutnya difiksasi dengan glutaraldehida 2,5% dalam (0,1 M buffer natrium kakodilat ph 7,2), dibiarkan selama 1,5 jam, dicuci dua kali dengan buffer kakodilat 0,05 M ph 7,2 selama 20 menit untuk masing-masing. Selanjutnya difiksasi dengan osmium tetraoksida 1% dalam buffer cacodilat 0,05%, ph 7,2 selama 1 2 menit, lalu dicuci dengan akuabides (DDH 2 O) 3 kali masing-masing selama 2 menit, dikeringkan dengan etanol pada berbagai konsentrasi yang dimulai dari konsentrasi 25, 50, 75 kemudian 100% sebanyak tiga kali masing-masing selama 10 menit. Spesimen diambil dan dilewatkan pada membran 0,2 µm untuk selanjutnya direkatkan pada stub aluminium dan dilapisi dengan emas melalui proses vakum (6-7Pa) selama 20 menit. Selanjutnya sampel diamati di bawah SEM tipe JEOL HASIL DAN PEMBAHASAN Kebocoran protein dan asam nukleat Mekanisme kerja antimikroba dari campuran metabolit Lb. plantarum kik- MAG minyak kelapa dapat diamati melalui analisis kebocoran sel mikroba uji. Untuk itu dilakukan analisis kebocoran asam nukleat melalui pengamatan pada panjang gelombang 260 nm, dan analisis kebocoran protein pada panjang gelombang 280 nm. Hasil pengamatan yang terlihat pada Gambar 6.1a-6.1c (Lampiran 9a-9c) menunjukkan bahwa dengan meningkatnya dosis MIC, nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm maupun pada panjang gelombang 280 nm semakin meningkat pula. Peningkatan nilai absorbansi ini menunjukkan peningkatan jumlah senyawa yang dikeluarkan oleh sel bakteri, yang berarti antibakteri campuran metabolit Lb. plantarum kik-mag minyak kelapa merusak membran sel dalam aktivitasnya sebagai antimikroba. Pada sel L. monocytogenes dan B. cereus, nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm lebih tinggi jika dibandingkan dengan nilai

6 86 absorbansi S. Typhimurium. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm akan semakin meningkat dengan semakin tinggi dosis MIC. Nilai absorbansi (nm) : Dosis MIC 260 nm 280 nm Gambar 6.1a. Pengaruh dosis campuran metabolit Lb. plantarum kik-mag minyak kelapa terhadap kebocoran protein (280 nm) dan asam nukleat (260 nm) dari sel L. monocytogenes Menurut Lin et al. (2000), senyawa-senyawa yang terserap pada panjang gelombang 260 nm adalah RNA dan turunan RNA, yaitu nukleotida. Pada panjang gelombang 280 nm senyawa yang terserap diidentifikasi sebagai protein. Park et al. (2003) menyatakan bahwa senyawa-senyawa yang dapat terdeteksi pada panjang gelombang 260 diantaranya adalah purin, pirimidin dan ribonukleotida, sedangkan pada panjang gelombang 280 nm senyawa yang terserap dapat mendeteksi asam amino, seperti tirosin dan triptofan. Hal ini menunjukkan adanya perbedaan kerusakan sel antara bakteri Gram positif (L. monocytogenes dan B. cereus) dengan bakteri Gram negatif (S. Typhimurium). Menurut Nychas (1995), kebocoran sel adalah fenomena umum yang disebabkan oleh beberapa senyawa antimikroba. Selanjutnya, Bunduki et al. (1995) menemukan adanya perubahan jumlah asam nukleat dan protein dalam medium pada L. monocytogenes yang mengalami kerusakan sublethal panas (56 o C, 20 menit) atau pemberian sanitaiser klorin (100 ppm, 20 menit). Hasil penelitian ini memperlihatkan bahwa kebocoran sel pada bakteri Gram positif seperti L. monocytogenes dan B. cereus maupun bakteri Gram negatif

7 87 S. Typhimurium akibat pemberian campuran metabolit Lb. plantarum kik-mag minyak kelapa, protein yang dilepaskan lebih tinggi dibandingkan dengan asam nukleat yang berarti sel bakteri mengalami kebocoran senyawa protein lebih banyak dari pada asam nukleat. Nilai absorbansi (nm) Dosis MIC 260 nm 280 nm Gambar 6.1b. Pengaruh dosis campuran metabolit Lb. plantarum kik-mag minyak kelapa terhadap kebocoran protein (280 nm) dan asam nukleat (260 nm) dari sel B. cereus nm 280 nm Nilai absorbansi (nm) Dosis MIC Gambar 6.1c. Pengaruh dosis campuran metabolit Lb. plantarum kik-mag minyak kelapa terhadap kebocoran protein (280 nm) dan asam nukleat (260 nm) dari sel S. Typhimurium

8 88 Davidson dan Branen (1994) menyatakan bahwa senyawa yang terdeteksi pada kebocoran sel Pseudomonas spp. yang diberi BHA (butylated hydroxyanisole) lebih banyak pada panjang gelombang 280 nm dibandingkan pada panjang gelombang 260 nm. Dalam penelitian ini kebocoran sel disebabkan oleh adanya interaksi antara campuran metabolit Lb. plantarum kik-mag minyak kelapa dengan komponen membran luar sel bakteri terutama komponen fosfolipida yang membentuk pori pada membran sel bakteri. Jika pori membran membesar karena adanya perubahan fosfolipida, molekul yang berukuran lebih besar dapat keluar dari membran sel atau sifat semipermeabel membran mengalami perubahan. Gangguan permeabilitas membran pada sel bakteri menyebabkan terjadinya kebocoran protein dan asam nukleat. Kebocoran sel bakteri akibat penggunaan campuran metabolit Lb. plantarum kik-mag minyak kelapa dapat pula diakibatkan oleh rusaknya ikatan hidrofobik komponen penyusun membran sel, seperti protein, fosfolipid serta larutnya komponen-komponen yang berikatan secara hidrofilik dan hidrofobik (Kim et al. 1995). Keadaan ini meningkatkan permeabilitas membran sel, sehingga memudahkan masuknya komponen antimikroba ke dalam sel serta keluarnya substansi sel seperti protein dan asam nukleat yang menyebabkan kerusakan sel (Lin et al. 2000). Kabara (1993) melaporkan bahwa asam laurat dalam MAG minyak kelapa dapat menyebabkan kerusakan membran serta kebocoran protein intraseluler dan asam nukleat, sehingga terjadi penurunan aktivitas enzimatik yang berperan dalam metabolisme. Wang dan Johnson (1993) menyatakan bahwa sifat lipofilik dari MAG minyak kelapa mampu menembus membran sitoplasma dan menghambat aktivitas enzim yang berperan dalam produksi energi dan transport nutrisi. Mappiratu et al. (2002), August (2000) dan Indriyati (2003) menemukan efek penghambatan asam laurat yang lebih besar terhadap bakteri Gram positif dibanding dengan bakteri Gram negatif, akan tetapi menurut Kabara (1994) aktivitas ini dapat ditingkatkan dengan penambahan asam seperti asam sitrat dan asam polifosfat yang berfungsi sebagai pengkelat. Rohani Razavi dan Griffith (1994) melaporkan perbedaan komponen penyusun dinding sel dapat menyebabkan asam laurat efektif terhadap semua bakteri Gram positif, sedangkan Gram negatif

9 89 akan efektif dengan adanya pengkelat seperti EDTA (Etilen Diamin Tetra Asetat). Peningkatan aktivitas monogliserida oleh asam atau EDTA disebabkan oleh kemampuannya dalam mengkelat, sehingga dapat merusak dan membebaskan sejumlah lapisan lipopolisakarida dari dinding sel mikroba dan menyebabkan mikroba bersifat seperti bakteri Gram positif (Kabara 1994). Aktivasi antimikroba dari MAG minyak kelapa selain karena dalam bentuk tidak terdisosiasi dan adanya gugus ester (Davidson dan Branen 1993) juga disebabkan oleh adanya gugus hidroksil (Kabara 1994), gugus hidrosil ini bersifat racun bagi protoplasma sel, karena menembus dan merusak dinding sel serta mendenaturasi protein enzim dalam sitoplasma dengan membentuk ikatan hidrogen pada sisi aktif enzim. Menurut Surono (2004), efek antimikroba dari asam organik terutama dalam bentuk tidak terdisosiasi menyebabkan turunnya ph sitoplasma yang menyebabkan metabolisme sel terganggu. Telaah lebih lanjut tentang nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 dan 280 nm memperlihatkan nilai absorbansi untuk L. monocytogenes dan B. cereus relatif lebih besar (Gambar 6.1a dan 6.1b) dibandingkan dengan bakteri uji S.Typhimurium (Gambar 6.1c), baik pada penggunaan 1 MIC maupun penggunaan 2 MIC. Hal ini menunjukkan bahwa L. monocytogenes dan B. cereus relatif lebih peka terhadap metabolit BAL-MAG dibandingkan dengan S. Typhimurium, dimana nilai absorbansi sebanding dengan konsentrasi, yang berarti semakin tinggi absorbansi semakin banyak asam nukleat maupun protein yang keluar dari sel. Hal ini sejalan dengan hasil penelitian penentuan nilai MIC, dimana nilai MIC bakteri Gram positif sekitar separuh lebih kecil yaitu 1,2% dan 1,4% untuk L. monocytogenes dan B. cereus dibandingkan dengan nilai MIC bakteri Gram negatif S. Typhimurium sebesar 2,5%. Hasil penelitian ini membuktikan bahwa campuran metabolit Lb. plantarum kik-mag mampu merusak protein maupun material genetik dari sel mikroba karena asam nukleat merupakan penyusun utama dari DNA. Diduga proses ini terjadi karena adanya pelekatan antara senyawa antibakteri pada permukaan sel atau senyawa tersebut berdifusi ke dalam sel (Kanazawa et al. 1995).

10 90 Kebocoran Ion-Ion Logam Ion K + merupakan kation utama yang terkandung dalam sitoplasma pada sel yang sedang tumbuh, sedangkan ion Ca 2+ dan Mg 2+ terdapat di bagian sitosol yaitu cairan sitoplasma. Kedua jenis ion ini juga ditemukan pada dinding sel yang turut berperan dalam aktivitas enzim (Ultee 1998). Ion K + memiliki peran dalam mengaktivasi enzim sitoplasma, menjaga tekanan turgor serta mengatur ph sitoplasma. Ion Ca 2+ dan Mg 2+ berfungsi menghubungkan lipopolisakarida (LPS) pada dinding sel bakteri Gram negatif (Nikaido dan Vaara, 1985). Pada bakteri Gram positif ion Ca 2+ dan Mg 2+ berfungsi menghubungkan asam teikoat sebagai penyusun sel (Lay dan Hastowo 1992). Pada penggunaan campuran metabolit Lb. plantarum kik-mag minyak kelapa 1 MIC dan 2 MIC jumlah ion Ca 2+ dan ion K + yang dilepaskan oleh sel L. monocytogenes, B. cereus maupun S. Typhimurium lebih besar dibandingkan dengan kontrol (Gambar 6.2a -6.2c, Lampiran 10a 10c). Hal ini menunjukkan bahwa metabolit Lb. plantarum kik-mag menyebabkan gangguan pada dinding sel dengan melepaskan ion Ca 2+, dan kebocoran pada membran sel dengan melepaskan protein, asam nukleat dan ion K + ke lingkungan. Penelitian ini sejalan dengan temuan Heipieper et al. (1996) terhadap Pseudomonas putida P8 dengan menggunakan senyawa fenol yang telah melepaskan ion K + secara nyata ke lingkungan luar. Lebih lanjut dinyatakan bahwa senyawa fenol mempunyai kemampuan dalam bereaksi dengan komponen fosfolipid dari membran luar sehingga sel mengalami lisis. Lisisnya sel diakibatkan melemahnya aktivitas enzimenzim yang mensintesis dinding sel dan porositas meningkat. Levlinesia (2004) juga menemukan kebocoran ion-ion K + dan Ca 2+ pada sel S. aureus dan P. fluorescens yang dikontakkan dengan ekstrak etil asetat biji atung, dimana pada dosis tinggi jumlah ion-ion yang dilepaskan juga semakin besar. Lebih lanjut dilaporkan bahwa jumlah ion Ca 2+ dan K + yang dilepaskan lebih besar pada bakteri Gram positif (S. aureus) dibanding dengan Gram negatif (P. fluorescens). Dalam penelitian ini jumlah ion K + dan ion Ca 2+ yang terukur pada L. monocytogenes dan B. cereus juga lebih besar dibandingkan dengan S. Typhimurium.

11 91 Menurut Friedman et al. (2004) beberapa senyawa antibakteri dapat merusak integritas dari membran sel bakteri dengan cara merusak ikatan kation divalen Ca 2+ dan Mg 2+ dengan lipopolisakarida pada bakteri Gram negatif, sedang pada bakteri Gram positif kation-kation ini berfungsi menghubungkan asam teikoat sebagai penyusun sel. Ca2+ K+ Kebocoran ion (%) Dosis MIC Gambar 6.2a. Pengaruh dosis campuran metabolit Lb. plantarum kik-mag minyak kelapa terhadap kebocoran ion-ion logam dari sel L. monocytogenes Ca2+ K Kebocoran ion (%) Dosis MIC Gambar 6.2b. Pengaruh dosis campuran metabolit Lb. plantarum kik- MAG minyak kelapa terhadap kebocoran ion-ion logam dari sel B. cereus

12 92 Terlepasnya kation tersebut dari membran luar menyebabkan masuknya senyawa antibakteri ke dalam sel (Stratford 2000). Russel (1984) menyatakan bahwa bentuk kerusakan dari membran sel diperlihatkan dengan keluarnya kandungan dari bahan-bahan yang terserap pada panjang gelombang 260 nm, seperti pentosa, atau asam-asam amino atau ion K +. Ca2+ K+ Kebocoran ion (%) Dosis MIC Gambar 6.2c. Pengaruh dosis campuran metabolit Lb. plantarum kik-mag minyak kelapa terhadap kebocoran ion-ion logam dari sel S. Typhimurium Ultee et al. (2002) dalam penelitiannya terhadap pengaruh senyawa carvacrol (senyawa tidak terdisosiasi) menemukan adanya pelepasan ion K + dari Bacillus cereus. Selanjutnya dijelaskan bahwa ini terjadi karena senyawa carvacrol masuk kedalam membran sitoplasma karena ph di dalam sitoplasma lebih tinggi menyebabkan pelepasan ion H + dan membawa keluar ion K + akibatnya ion H + di dalam membran sitoplasma meningkat yang akan mengasamkan cairan sitoplasma sementara ion K + berkurang akibatnya aktivitas enzim terganggu dan pada gilirannya energi tidak terbentuk akhirnya sel mengalami kematian. Senyawa yang terdapat dalam campuran metabolit Lb. plantarum kik-mag minyak kelapa seperti asam organik diantaranya asam laktat, asetat, sitrat, dan asam-asam lemak jenuh rantai pendek dan menengah diduga kuat penyebab dalam kebocoran sel mikroba yang ditandai dengan keluarnya berbagai komponen seperti protein, asam nukleat, maupun ion-ion logam yang berperan penting dalam metabolisme sel. Hal ini didasarkan pada pernyataan Stratford (2000) bahwa asam-

13 93 asam organik seperti asam sitrat, asam malat, EDTA dan asam laktat maupun asam klorida (Alakomi et al. 2000) dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram negatif dengan mengkelat kation bivalen Ca 2+ dan Mg 2+. Perubahan Morfologi Sel dengan SEM (Scanning electron microscopy) Pengamatan terhadap kerusakan morfologi sel dilakukan terhadap Listeria monocytogenes dan Salmonela Typhimurium setelah dikontakkan dengan senyawa antimikroba metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa dengan dosis 0 MIC, 1 MIC dan 2 MIC. Listeria monocytogenes Sel L. monocytogenes normal berbentuk batang dengan ukuran diameter sel 0,5 0,7 µm dan tidak membentuk spora. Pada Gambar 6.3 terlihat bahwa pada sel bakteri yang diberi perlakuan sebesar 1 MIC (Gambar 6.3b), sel memanjang dan membesar dibanding sel normal (Gambar 6.3a). Bila konsentrasi campuran metabolit Lb. plantarum kik-mag minyak kelapa ditingkatkan menjadi 2 MIC (Gambar 6.3c) terlihat sel mengecil dan berlubang pada bagian dinding sel. Pada sel normal diperoleh ukuran sebesar 1,3 µm (panjang) dengan diameter 0,7 µm, sedangkan perlakuan 1 MIC dan 2 MIC masing-masing diperoleh sebesar 0,6 µm dan 0,4 µm untuk diameter dan 2,6 dan 1 µm untuk panjang sel.. Gambar 6.3a. Bentuk sel normal L. monocytogenes ( X)

14 94 Gambar 6.3b. Pengaruh campuran metabolit Lb. plantarum kik-mag pada dosis 1 MIC terhadap morfologi sel L. monocytogenes (20000X) Gambar 6.3c. Pengaruh campuran metabolit Lb. plantarum kik-mag minyak kelapa pada konsentrasi 2 MIC terhadap morfologi sel L. monocytogenes (20.000X) Hal ini diduga karena asam lemak maupun asam organik yang terdapat pada campuran metabolit Lb. plantarum kik-mag minyak kelapa memudahkan masuknya antibakteri ke dalam sel yang selanjutnya akan berinteraksi dengan fosfolipid pada membran menyebabkan permeabilitas meningkat dan hilangnya

15 95 unsur pokok penyusun sel, sehingga terjadi pembengkakan yang berakibat pada kematian sel. Keadaan ini menyebabkan membran sel tidak dapat menahan tekanan dari dalam sitoplasma akibatnya membran bocor, lalu diikuti dengan mengkerutnya sel yang menyebabkan kematian sel. Fenomena kerusakan serupa ditemukan juga oleh Wang dan Davidson (1992), pemberian monolaurin sebesar 100 µg/ml terjadi perubahan morfologi dari L. monocytogenes berupa pemanjangan bila dibandingkan dengan sel normal, dan ketika konsentrasi monolaurin ditingkatkan 200 µg/ml, maka ukuran sel menjadi mengecil diikuti dengan kerusakan di sekitar dinding sel bakteri. Hal serupa juga ditemukan oleh Ultee et al. (2002) yang mengamatai efek sinergi dari karvakrol (asam lemah) dan cymene (senyawa non polar) terhadap B. Cereus. Menurutnya kerusakan sel bakteri oleh senyawa antibakteri menyebabkan pembengkakan sel akibat adanya akumulasi dari senyawa antibakteri lalu diikuti dengan kebocoran dan kematian sel. Kerusakan sel mikroba oleh senyawa antimikroba dapat berbeda tergantung sifat, struktur, serta komposisi kimia dinding dan membran sel. Kerusakan pada dinding sel atau terhambatnya sintesis dinding sel oleh antimikroba akan mengakibatkan lisis pada sel. Pada lingkungan hipertonik kerusakan dinding sel mengakibatkan terbentuknya protoplast (bakteri Gram positif) atau sferoplast (bakteri Gram negatif). Kondisi ini menyebabkan sel membengkak, membran terdesak ke arah dinding sel dan mengakibatkan sel pecah (Jawetz et al. 1996). Salmonela Typhimurium Salmonela Typhimurium Gram negatif berbentuk batang dan tidak membentuk spora, bersifat motil dengan flagela peritrikat berukuran 0,7 1,5 µm (Jay 1997). Pengaruh metabolit Lb. plantarum kik-mag minyak kelapa dapat dilihat pada Gambar 6.4a-6.4c. Pada sel yang normal terlihat permukaan sel yang mulus, agak bulat memanjang dengan ukuran diameter 1,2 µm dan panjang 2 µm. Pada penambahan metabolit BAL-MAG dengan konsentrasi 1 MIC sel nampak memanjang dari sel normal 3 µm, dengan diameter 1,4 µm dan terlihat mulai akan membelah diri. Seharusnya sel yang membelah akan membagi dua semua bahanbahan sel sehingga menjadi 2 sel yang ukuran dan sifatnya sama dengan sel induk.

16 96 Adanya bentuk seperti yang terlihat pada Gambar 6.4b diperkirakan septa sudah terbentuk dan belum membelah akibat dari aktivitas campuran metabolit Lb. plantarum kik-mag, padahal septa dibutuhkan untuk memperbanyak diri dengan cara membelah. Bila proses pembelahan septa terganggu, maka proses pertumbuhan juga akan terhambat. Kondisi ini menunjukkan bahwa adanya campuran metabolit Lb. plantarum kik-mag minyak kelapa menyebabkan terjadinya gangguan pada proses reproduksi. Gambar 6.4a. Bentuk sel normal S. Typhimurium ( X) Terdapatnya komponen asam organik dan asam lemak terutama asam laktat dan asam laurat dalam campuran metabolit Lb. plantarum kik-mag minyak kelapa yang bekerja secara sinergi menyebabkan kerusakan membran, kebocoran protein intraseluler dan asam nukleat, serta penurunan aktivitas enzim yang berperan dalam pembentukan material genetik dan proses pembelahan sel. Hal ini sejalan dengan pernyataan Kim et al. (1995) bahwa salah satu kemampuan dari senyawa antimikroba untuk merusak sel adalah dengan mengganggu pembentukan asam nukleat (DNA dan RNA) yang akan mempengaruhi transfer informasi genetik dengan menghambat aktivitas enzim RNA polimerase dan DNA polimerase. Mekanisme selanjutnya menginaktivasi atau merusak materi genetik yang berimplikasi pada proses pembelahan sel untuk perkembangbiakan.

17 97 Gambar 6.4b. Pengaruh campuran metabolit BAL-MAG pada dosis 1 MIC terhadap morfologi sel S. Typhimurium (15.000X) Gambar 6.4c. Pengaruh campuran metabolit BAL-MAG pada dosis 2 MIC terhadap morfologi sel Salmonela Typhimurium (15.000X) Pada Gambar 6.4c terlihat bahwa pemberian campuran metabolit Lb. plantarum kik-mag pada dosis 2 MIC dapat menyebabkan kerusakan yang lebih parah. Permukaan sel mengalami kerusakan yang lebih besar (permukaan sel terlihat berlubang) dengan ukuran panjang dan diameter yang berbeda dengan perlakuan pada dosis yang lebih kecil.

18 98 Keadaan ini menunjukkan bahwa campuran metabolit Lb. plantarum kik- MAG minyak kelapa mampu menimbulkan perubahan permeabilitas membran, dan mengakibatkan cairan sitoplasma merembes keluar sehingga terbentuk ruang antar sel yang akan meningkatkan porositas membran akibat melemahnya dinding sel. Dinding sel yang lisis mengakibatkan keluarnya cairan dalam jumlah besar dan menyebabkan sel mengkerut dan mati. KESIMPULAN Campuran metabolit Lb. plantarum kik-mag minyak kelapa pada dosis 1 dan 2 MIC menyebabkan kerusakan pada dinding dan membran sel dari L. monocytogenes, B.cereus dan S. Typhimurium dengan melepaskan protein dan asam nukleat serta ion K + dan ion Ca 2+ ke lingkungan luar. Jumlah protein, asam nukleat dan ion-ion yang dilepaskan dipengaruhi oleh dosis. Pada dosis 1 MIC kebocoran protein dan asam nukleat sebesar 0,33-0,59 dan kebocoran ion K + dan Ca 2+ pada kisaran 22,49-42,3%. Pada dosis 2 MIC terjadi kerusakan yang lebih parah dengan konsentrasi masing-masing untuk protein dan asam nukleat berada pada kisaran 0,48-0,87 dan ion K + dan Ca 2+ pada kisaran 32,8%-76,5%. Disamping itu itu campuran metabolit Lb. plantarum kik-mag minyak kelapa menyebabkan terjadinya perubahan morfologi sel L. monocytogenes dan S. Typhimurium dengan tingkat kerusakan yang bervariasi. Mekanisme kerja dari campuran metabolit Lb.plantarum kik-mag minyak kelapa umumnya diawali dengan mengganggu atau merusak dinding dan membran sel kemudian fungsi materi genetik, hal ini terjadi baik pada bakteri Gram negatif maupun Gram positif. DAFTAR PUSTAKA Alakomi HL, Skytta E, Saarela M, Mattila-Sandholm T Lactic acid permeabilizes Gram-negative bacteria by distrupting the outer membrane. Appl. Environ. Microbiol. 66: August EG Kajian penggunaan lipase amobil dari Aspergillus niger pada pembuatan monoasilgliserol yang bersifat antibakteri dari minyak kelapa. Tesis Program Pascasarjana IPB. Bogor. Bunduki MMC, Flanders KJ, Donelly CW Metabolic and structural sites of damage in heat and sanitizer injured population of Listeria monocytogenes. J. Food Protect 58:

19 99 Burt SA, Reinders RD Antibacterial activity of selected plant essensial oils against Escherichia coli O157:H7. Letters in Appl Microbiol 78: Davidson PM, Parish ME Methods for testing the efficacy of food antimicrobials. Food Technol. 43: Davidson PM, Branen AL Antimicrobial in Food. Merckel Dekker, new York. Friedman M, Henika PR, Levin CE, Mandreil RE Antibacterial activities of plant essential oils and their components against Escherichia coli O157:H7 and Salmonella enteritica in apple juice. 52: J. Agric. and Food Chem. 52 : Gilbert P The revival of micro-organism sublethally injured by chemical inhibitors. Di dalam: Andrew MHE, Russel AD (ed). The Revival of Injured Microbes. Academic Press, London. Heipieper HJ, Meulenbeld G, Qirschot Q, de Bont JAM Effect of environmental factors on the trans/cis ratio of unsaturated fatty acids in P. putida S12. App. and Env. Microbiol. 62 : Indriyati W Kajian aktivitas antimikroba campuran mono dan diasilgliserol hasil pemanfaatan destilat asam lemak minyak kelapa. Tesis Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Jay SJ Modern Food Microbiology 5 th edition. Chapman and Hall. New York. Jawetz E, Melnick J, Adelberg E Medical Microbiology. Appleton & Lange. San Fransisco. JEOL Specimen Preparation Methods for Scanning Electron Microscope. JEOL Application Note. Tokyo. 23p Jenie BSL, Atifah N, Suliantari Peningkatan keamanan dan mutu pindang ikan kembung (Rastellinger sp) dengan aplikasi kombinasi natrium asetat, bakteri asam laktat dan pengemasan vakum Pangan XII (1): J. Ilmu dan Teknol Pangan XII (1): Kabara JJ Antimicrobial agents derived from fatty acids. J. Am. Oil Chem. Soc. 61: Kanazawa A, Ikeda T, Endo T A Novel approach to mode of action of cationic biocides: morphological effect on antibacterial activity. J.Appl Bacteriol. 78: Kim JM, Marshal MR, Wei Cl Antibacterial activity of some essential components against five food borne pathogens. J. Agric. and Food Chem. 43: Lavlinesia Kajian pola dan mekanisme inaktivasi bakteri oleh ekstrak etil asetat biji atung (Parinarium glaberium Hassk). Ringkasan Disertasi Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.. Lin CM, James FP, Cheng IW Antibacterial mechanism of allyl isothiocyanate. J. of Food Protect. 61:

20 100 Mappiratu, Umrah, Ijirana Pemanfaatan sabun hasil samping pengolahan minyak kelapa dalam pembuatan monoasilgliserol menggunakan lipase Aspergillus niger amobil isolat kapang kopra. Laporan Penelitian RUT VIII/2 Fakultas Pertanian, Universitas Tadulako. Naufalin R Kajian sifat antimikroba ekstrak bunga kecombrang (Nicolaia speciosa Horan) terhadap berbagai mikroba patogen dan perusak pangan. Disertasi Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Bogor. Nikaido H, Vaara M Molekuler basis of bacterial outer membrane permeability. Microb. Reviews. 49(1):1-32. Nychas GJE, Tassou CC Traditional preservative oils and spices. Di dalam: Robinson RK, Batt CA, Patel PD (Ed). Encyclopedia of Food Microbiology Volume.2. Academy Press. London. Parhusip A Kajian Mekanisme Antibakteri Ekstrak Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC) Terhadap Bakteri Patogen Pangan. Disertasi Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Park SJ, Park HW, Park J Inactivation kinetics of food poisoning microorganisms by carbon dioxide and high hydrostatic pressure. J. Food. Sci 68(3): Russel AD Potential sites of damage in microorganisms exposed to chemical or physical agent. Di dalam Andrew MHE, Russel AD (ed). The Revival of Injured Microbes. Academic Press. London. Stratford M Traditional preservatives-organic acids. Di dalam: Robinson RK, Batt CA, Patel PD, editors. Encyclopedia of Food Microbiology. Volume 1. Academic Press. London. Surono IS Probiotik susu fermentasi dan kesehatan. YAPMMI (Yayasan pengusaha makanan dan minuman seluruh Indonesia). Ultee A, Goris LGM, Smidt EJ Bacterial activity of carvacrol towards the food-borne pathogen Bacillus cereus. J. App. Microbiol 85: Ultee A, Bennik MH, Moezelaar R The phenolic hydroxyl group of carvacrol is essential for action against the food-borne pathogen Bacillus cereus. J. App. and Environ. Microbiol. Vol 68, No 4: Wang LL, Johnson EA Inhibition of Listeria monocytogenes by fatty acids and monoglycerides. J. App. and Environ. Microbiol. Vol 58, N0 2: Wang LL, Yang BK, Parkin KL, Johnson EA Inhibition of Listeria monocytogenes by monoacylglycerol synthesized from coconut oil and milk fat by lipase-catalyzed glycerolysis. J. Agric. and Food Chem. 41: