KAJIAN EFEK SINERGI ANTIMIKROBA METABOLIT BAKTERI ASAM LAKTAT DAN MONOASILGLISEROL MINYAK KELAPA TERHADAP MIKROBA PATOGEN PANGAN ASRIANI

Transkripsi

1 KAJIAN EFEK SINERGI ANTIMIKROBA METABOLIT BAKTERI ASAM LAKTAT DAN MONOASILGLISEROL MINYAK KELAPA TERHADAP MIKROBA PATOGEN PANGAN ASRIANI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2006

2 SURAT PERNYATAAN Saya menyatakan dengan sebenarbenarnya bahwa segala pernyataan dalam disertasi saya yang berjudul KAJIAN EFEK SINERGI ANTIMIKROBA METABOLIT BAKTERI ASAM LAKTAT DAN MONOASILGLISEROL MINYAK KELAPA TERHADAP MIKROBA PATOGEN PANGAN adalah karya saya sendiri dengan pembimbingan komisi pembimbing dan belum pernah diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal dari atau dikutip dari karya yang diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka. Bogor, November 2006 Asriani NRP F

3 ABSTRACT ASRIANI, Antimicrobial Synergistic Effect of Metabolite of Lactic Acid Bacteria and Monoacylglycerol of Coconut Oil Mixture on Food Pathogen Microbes. Under the Supervision of: BETTY SRI LAKSMI JENIE, SEDARNAWATI YASNI, and IDWAN SUDIRMAN. Synergistic effect of two or more kinds of antimicrobial substances usually expressed higher activity than the cumulative given by both or more antimicrobial substances. The organic acid and monolaurin have been reported to show synergism as antimicrobials in food. The lactic acid bacteria (BAL) are known as organic acid producer, mainly lactic acid, while the monoacylglycerol (MAG) of coconut oil known having antimicrobial properties due to its short and medium chains of fatty acids, especially lauric acid. Study on the synergic effect of antimicrobial activity of BAL metabolites and MAG of coconut oil mixture had been conducted using six strains of BAL i.e. Lactobacillus brevis, Lb. acidophilus, Lb. plantarum pi28a, Lb. plantarum sa28k, Lb. plantarum kik and Lb. coryneformis. The aims of the studies were: (1) to obtain BAL which have the highest synergic antimicrobial effect with MAG; (2) to obtain the optimum ratio of BAL and MAG and its MIC (minimum inhibitory concentration) for the test bacteria; (3) to analyze the mechanism of action of BALMAG mixture on bacterial cells; (4) to evaluate the stability of the combined BALMAG in different ph and heating temperatures and times. The isolates of BAL which have effect synergic with MAG and the optimum ratio of BAL and MAG were conducted by using well diffusion method, while the MIC (minimum inhibitory concentration) for the test bacteria conducted by using contact method. The action mechanism of BALMAG on protein and nucleic acid leakages were observed by using Spectrophotometer, K + and Ca 2+ leakages with Atomic Absorbtion Spectrophotometer, and the morphology of cells were observed by using SEM (Scanning Electron Microscope). The evaluation of stability of the combined BALMAG of coconut oil were conducted on ph 4, 5, 6, and 7, on room temperature of 80, 100, and 121 o C as long as 10, 20, and 30 minutes by using well diffusion. The application on food system (tofu) were conducted by soaking in 2 and 4 MIC concentrations. Among the BAL studies, Lb. plantarum kik showed the highest synergic effect with MAG against Listeria monocytogenes. The optimum ratio of BAL metabolites MAG mixture were found at 5:3. Combination of Lb. plantarum kik MAG could inhibit the growth of all bacteria tasted with the highest activity showed against Listeria monocytogenes was 30,66 mm in diameter of inhibition zone; and the lowest activity against Escherichia coli was mm. The MIC values found out were 1,2%, 1,4%, 2,5% and 3% for Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Salmonella Typhimurium and Escherichia coli, respectively. The reduction of Aspergillus flavus growth expressed as mycelium weight resulted by the mixture of Lb. plantarum kik metabolitemag was higher (0,862,75 mg/ml) than the individual substance (0,351,54 mg/ml) at the concentration 520 %.

4 The metabolite of Lb. plantarum kik MAG of coconut oil at the concentration of 1 MIC caused less cell leakage than 2 MIC, which resulted in higher protein than nucleic acid leakages. Similar results were also obtained for ions leakage, where the leakage of Ca 2+ was higher than K +. The effect of the mixture on the cell morphology of L. monocytogenes and Salmonella Typhimurium observed Under SEM (Scanning Electron Microscopo) caused some degree of cell damage according to the concentration applied. In general, the higher the concentration applied, the more were the cell damage occurred. Stability of the mixture Lb. plantarum kik metabolitemag was affected by different ph and heating temperature and time. At ph 47, the antibacterial activity of the mixture and individual MAG were quite stabil, except for the individual Lb. plantarum kik did not show antibacterial activity at ph 7. The mixture still showed bacterial activity after heating at 75 and 100 o C for 10, 20, and 30 minutes, whereas at 121 o C, bacterial activity only showed on heating for 10 minutes, either for individual substances or the mixture. Application of the metabolite of Lb. plantarum kik metabolitemag on soybean curd as food system model at the concentration of 4 MIC could extend the shelf life long as 6 days at room temperature. Key words: Antimicrobial synergistic effect, lactic acid bacteria (LAB), monoacylglycerol (MAG), food pathogen microbes.

5 ABSTRAK ASRIANI. Kajian Efek Sinergi Antimikroba Campuran Metabolit Bakteri Asam Laktat dan Monoasilgliserol Minyak Kelapa Terhadap Mikroba Patogen Pangan. Dibawah bimbingan BETTY SRI LAKSMI JENIE, SEDARNAWATI YASNI dan IDWAN SUDIRMAN. Efek sinergi suatu senyawa antimikroba didefinisikan sebagai efek yang dihasilkan oleh campuran dari dua jenis atau lebih antimikroba yang akan memberikan pengaruh yang lebih besar dari jumlah efek kumulatif campuran kedua antimikroba tersebut. Asam organik dan monolaurin telah dilaporkan memiliki sifat sinergi dalam penggunaannya sebagai bahan antimikroba dalam bahan pangan. Bakteri asam laktat merupakan salah satu jenis bakteri yang dikenal sebagai penghasil asam organik terutama asam laktat, sedangkan monoasilgliserol dari minyak kelapa diketahui memiliki sifat antibakteri dan antikapang karena mengandung asamasam lemak rantai pendek dan menengah terutama asam laurat. Kajian efek sinergi antimikroba campuran metabolit BAL dan MAG minyak kelapa telah dilakukan dengan menggunakan enam isolat BAL, yaitu: Lb. brevis, Lb. acidophilus, Lb. plantarum pi28a, Lb. plantarum sa28k, Lb. plantarum kik dan Lb. coryneformis. Tujuan penelitian ini adalah: (1) untuk memperoleh BAL yang memiliki efek sinergi tertinggi dengan MAG minyak kelapa; (2) untuk memperoleh rasio optimal dari campuran metabolit BALMAG minyak kelapa dan MIC untuk uji bakteri; (3) untuk menguji stabilitas campuran metabolit BALMAG minyak kelapa terhadap perbedaan ph, pemanasan dan waktu, serta aplikasinya pada sistem pangan tahu. Isolat bakteri asam laktat yang diseleksi adalah Lb. brevis, Lb. acidophilus, Lb. plantarum pi28a, Lb. plantarum sa28k, Lb. coryneformis dan Lb. plantarum kik. Pengujian aktivitas antibakteri dari campuran metabolit BALMAG minyak kelapa dilakukan terhadap 4 jenis bakteri yaitu Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Salmonella Typhimurium, dan Escherichia coli serta Aspergillus flavus. Seleksi BAL yang bersinergi dengan MAG minyak kelapa dan penentuan rasio metabolit BALMAG dilakukan dengan menggunakan metode difusi sumur, sedangkan penentuan nilai MIC dilakukan dengan metode kontak. Pengamatan terhadap mekanisme kerja dari campuran metabolit BALMAG minyak kelapa terhadap kebocoran protein dan asam nukleat dengan spektrofotometer, kebocoran ion Ca 2+ dan ion K + dengan AAS (Atomic Absorption Spektrofotometer), serta morfologi sel dengan SEM (Scanning Electron Microscope). Pengujian stabilitas campuran metabolit BALMAG minyak kelapa dilakukan pada ph 4, 5, 6, dan 7 serta suhu 80, 100 dan 121 o C selama 10, 20 dan 30 menit dengan metode difusi sumur. Aplikasi terhadap sistem pangan tahu dilakukan dengan perendaman pada konsentrasi 2 dan 4 MIC. Hasil penelitian menunjukkan bahwa dari ke enam isolat BAL yang diteliti ditemukan satu isolat BAL yang bersinergi kuat dengan MAG minyak kelapa, yaitu Lb. plantarum kik dengan rasio campuran metabolit BALMAG minyak kelapa 5:3. Campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa mampu menghambat pertumbuhan semua bakteri yang diuji dengan aktivitas tertinggi diperoleh pada Listeria

6 monocytogenes dengan diameter penghambatan 30,66 mm; dan aktivitas terendah diperoleh pada E. coli. dengan diameter penghambatan 20,20 mm. Konsentrasi MIC untuk masingmasing bakteri uji ditemukan sebesar 1,2%, 1,4%, 2,5% dan 3% berturutturut untuk L. monocytogenes, B. cereus, S. Typhimurium dan E. coli. Campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa juga menunjukkan sinergi aktivitas antikapang yang cukup baik dengan mereduksi berat miselia Aspergillus flavus sebesar (0,862,75 mg/ml) dari pada penggunaan secara tunggal (0,351,54 mg/ml) pada konsentrasi 520%. Semakin tinggi konsentrasi campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa maka kebocoran sel makin parah, dimana kebocoran protein lebih tinggi dari pada asam nukleat. Demikian halnya dengan kebocoran ion Ca 2+ lebih besar dari pada ion K +. Pengamatan dengan SEM menunjukkan metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa menyebabkan perubahan morfologi sel Listeria monocytogenes dan Salmonella Typhimurium pada tingkat kerusakan yang bervariasi, seperti terjadinya pembengkakan sel diikuti dengan pengkerutan pada sel L. monocytogenes dan terhambatnya gangguan pada pembentukan septa dan terbentuknya lubang pada permukaan sel S.Typhimurium Stabilitas dari campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa dipengaruhi oleh ph, dan pemanasan. Aktivitas antibakteri pada ph 47 cukup stabil kecuali pada penggunaan tunggal dari metabolit Lb. plantarum kik, yaitu pada ph 7 tidak menunjukkan aktivitas antibakteri. Campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa masih menunjukkan aktivitas antibakteri pada pemanasan 75 dan 100 o C selama 10, 20 dan 30 menit, sedangkan pada suhu 121 o C aktivitas antibakteri hanya diperlihatkan selama pemanasan 10 menit baik terhadap penggunaan tunggal dari metabolit Lb. plantarum kik dan MAG minyak kelapa maupun campurannya. Aplikasi metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa pada tahu sebagai model sistem pangan dengan konsentrasi 2 MIC mampu bertahan selama 4 hari dibandingkan kontrol (1 hari), sedangkan pada konsentrasi 4 MIC dapat bertahan selama 6 hari pada suhu ruang dengan sifat organoleptik (warna, bau dan tekstur) yang masih diterima oleh panelis. Kata kunci : Efek sinergi antimikroba, bakteri asam laktat (BAL), monoasilgliserol (MAG), mikroba patogen pangan.

7 DAFTAR ISI PRAKATA... DAFTAR TABEL. DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN. 1 PENDAHULUAN Latar Belakang... Tujuan Penelitian... Manfaat Penelitian.. Hipotesis 2 TINJAUAN PUSTAKA Bakteri Asam Laktat... Metabolit Hasil Produksi Bakteri Asam Laktat.... Monoasilgliserol.. Sifat Antimikroba Monoasilgliserol Minyak Kelapa.. Mikroba Patogen pada Bahan Pangan... Mekanisme Kerja Senyawa Antimikroba... Daftar Pustaka... 3 METODOLOGI UMUM Tempat dan Waktu.... Bahan dan Alat Metodologi Penelitian Daftar Pustaka. 4 EFEK SINERGI ANTIBAKTERI BEBERAPA CAMPURAN METABOLIT BAL DENGAN MAG MINYAK KELAPA DALAM MENGHAMBAT PERTUMBUHAN Listeria monocytogenes Abstrak... Pendahuluan... Metodologi... Hasil dan Pembahasan.... Kesimpulan.... Halaman ix xv xvi xix

8 Daftar Pustaka AKTIVITAS ANTIMIKROBA CAMPURAN METABOLIT Lb.plantarum kikmag MINYAK KELAPA TERHADAP MIKROBA PATOGEN PANGAN Abstrak... Pendahuluan... Metodologi... Hasil dan Pembahasan Kesimpulan..... Daftar Pustaka MEKANISME KERJA ANTIBAKTERI CAMPURAN METABOLIT Lb. plantarum kikmag MINYAK KELAPA TERHADAP BAKTERI PATOGEN PANGAN Abstrak Pendahuluan... Metodologi.. Hasil dan Pembahasan Kesimpulan... Daftar Pustaka... 7 STABILITAS AKTIVITAS ANTIMIKROBA METABOLIT Lb. plantarum kikmag MINYAK KELAPA SERTA APLIKASINYA PADA PRODUK TAHU Abstrak... Pendahuluan Metodologi.. Hasil dan Pembahasan Kesimpulan Daftar Pustaka. 8 PEMBAHASAN UMUM... 9 KESIMPULAN DAN SARAN UMUM... DAFTAR PUSTAKA... LAMPIRAN

9 DAFTAR TABEL Halaman Aktivitas antibakteri dari monolaurin dan bahan pengawet pangan lainnya.. Aktivitas antikapang dari monolaurin dan bahan pengawet pangan lain Komposisi asam lemak beberapa jenis minyak nabati... Penurunan massa sel (%) kapang dan khamir pada beberapa jenis antimikroba pada konsentrasi 1%... Kandungan asamasam organik (%) berbagai metabolit isolat BAL hasil pengujian dengan HPLC... Diameter penghambatan dari beberapa metabolit BAL pada ph Supernatan dan ph supernatan yang dinetralkan... Kandungan asamasam lemak pada MAG minyak kelapa serta campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa

10 Hal am an a 6.1b DAFTAR GAMBAR Mekanisme asam lemah (organik) dalam menginaktivasi bakteri (Garbutt 1997)... Struktur dinding sel bakteri Gram positif dan Gram negatif (Kightley R, 2006)... Bagan alir pelaksanaan penelitian... Diameter penghambatan MAG minyak kelapa dalam berbagai konsentrasi alkohol... Diameter penghambatan penggunaan tunggal metabolit (1) coryneformis; (2) sa28k; (3) MAG; (4) pi28a; (5) kik; (6) acidophilus; (7) brevis terhadap L. monocytogenes... Diameter penghambatan penggunaan campuran metabolit (1) kik+mag; (2) pi28a+mag; (3) coryneformis + MAG; (4) acidophilus + MAG; (5) sa28k + MAG; (6) brevis + MAG terhadap L. monocytogenes... Aktivitas antibakteri MAG minyak kelapa dan metabolit BAL serta Campuran metabolit BALMAG minyak kelapa terhadap L. monocytogenes... Aktivitas antibakteri campuran metabolit Lb.plantarum kik MAG minyak kelapa pada berbagai rasio terhadap L.monocytogenes Aktivitas antibakteri campuran metabolit Lb.plantarum kikmag terhadap beberapa bakteri patogen... Diameter penghambatan campuran metabolit Lb.plantarum kik MAG terhadap (A) L.monocytogenes; (B) B.cereus; (C) E.coli dan (D) S.Typhimurium... Nilai MIC metabolit Lb.plantarum kikmag minyak kelapa terhadap beberapa bakteri patogen... Berat kering miselia kapang Aspergillus flavus (mg/ml) yang diberi metabolit Lb. plantarum kik,mag dan campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa... Pengaruh dosis campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa terhadap kebocoran protein (280 nm) dan asam nukleat (260 nm) dari sel L. monocytogenes... Pengaruh dosis campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa terhadap kebocoran protein (280 nm) dan asam nukleat (260 nm) dari sel B. cereus... Pengaruh dosis campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa terhadap kebocoran protein (280 nm) dan asam nukleat (260 nm) dari sel S. Typhimurium

11 6.1c 6.2a 6.2b 6.2c 6.3a 6.3b 6.3c 6.4a 6.4b 6.4c 7.1a 7.1b 7.1c 7.2a 7.2b 7.2c 7.3 Pengaruh dosis campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa terhadap kebocoran ionion logam dari sel L. monocytogenes... Pengaruh dosis campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa terhadap kebocoran ionion logam dari sel B. cereus... Pengaruh dosis campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa terhadap kebocoran ionion logam dari sel S. Typhimurium... Bentuk sel normal L. monocytogenes ( X)... Pengaruh campuran metabolit Lb. plantarum kik MAG pada dosis 1 MIC terhadap morfologi sel L. monocytogenes (20000X).. Pengaruh campuran metabolit Lb. plantarum kikmag Minyak kelapa pada konsentrasi 2 MIC terhadap morfologi sel L. monocytogenes (20.000X)... Bentuk sel normal S. Typhimurium ( X)... Pengaruh campuran metabolit BALMAG pada dosis 1 MIC terhadap morfologi sel S. Typhimurium (15.000X)... Pengaruh campuran metabolit BALMAG pada dosis 2 MIC terhadap morfologi sel Salmonela Typhimurium (15.000X)... Pengaruh ph terhadap aktivitas antibakteri campuran metabolit Lb. Plantarum kikmag minyak kelapa... Pengaruh ph terhadap aktivitas antibakteri metabolit Lb. plantarum kik... Pengaruh ph terhadap aktivitas antibakteri MAG minyak kelapa... Pengaruh suhu dan lama pemanasan terhadap aktivitas antibakteri campuran metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa... Pengaruh suhu ( o C) dan lama pemanasan terhadap aktivitas antibakteri metabolit Lb. plantarum kik... Pengaruh suhu dan lama pemanasan terhadap aktivitas antibakteri MAG minyak kelapa... Pengaruh konsentrasi campuran metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa pada berbagai MIC terhadap penurunan total mikroba (log CFU/g) pada tahu yang disimpan sampai hari ke6... Pengaruh konsentrasi campuran metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa pada berbagai MIC terhadap skor panelis terhadap warna tahu yang disimpan sampai hari ke6... Pengaruh konsentrasi campuran metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa pada berbagai MIC terhadap skor

12 7.4a penerimaan panelis bau tahu yang di simpan sampai hari ke b Pengaruh konsentrasi campuran metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa pada berbagai MIC terhadap skor penerimaan panelis tekstur tahu yang di simpan sampai hari ke c

13 1. PENDAHULUAN Formatted: Line spacing: 1,5 lines Latar belakang Kesadaran masyarakat terhadap kesehatan semakin meningkat sementara masyarakat dihadapkan pada tuntutan kebutuhan pangan yang praktis, mudah diolah, siap saji dan tahan lama tanpa bahan pengawet sintetik, serta tetap bermutu dan aman dikonsumsi. Oleh karena itu diperlukan penerapan teknologi rintangan (hurdle) dengan menggunakan bahan pengawet alami. Bakteri asam laktat (BAL) telah diketahui menghasilkan senyawa antimikroba berupa asam organik (asam laktat, asam asetat, asam format) diasetil, hidrogen peroksida, karbon dioksida dan bakteriosin. Berbagai jenis BAL yang bersifat antimikroba telah berhasil diisolasi dari berbagai jenis makanan Indonesia diantaranya Lie (1996); Idawati (1996); Solihati (1996) dan Jenie et al. (2000). Potensi BAL sebagai bahan pengawet pangan nabati maupun hewani telah diteliti oleh beberapa peneliti. Jenie et al. ( 2000) melaporkan bahwa penggunaan BAL pada ikan peda kering mampu mereduksi pertumbuhan Staphylococcus aureus dan Bacillus cereus sebesar tiga unit log (log cycle). Smith et al. (2005) melaporkan kemampuan dari bakteri asam laktat dalam mereduksi E. coli O157:H7 sebesar 2,5 unit log dan Salmonella 3 unit log pada daging sapi selama penyimpanan 12 hari pada suhu penyimpanan 5 o C. Selanjutnya dijelaskan bahwa efek penghambatan dari BAL disebabkan adanya produksi asam organik, hidrogen peroksida maupun bakteriosin yang semuanya diketahui memiliki efek antimikroba. BAL selain diketahui memiliki sifat antibakteri yang cukup luas juga memiliki sifat antikapang. Sifat antikapang BAL tersebut oleh beberapa peneliti dilaporkan terdapat dalam suspensi BAL, sedangkan dalam supernatan pada konsentrasi tertentu sifat antikapang tersebut tidak terlihat. Hal ini dilaporkan oleh Gourama dan Bullerman (1995) bahwa suspensi sel BAL (L. acidophilus, L. bulgaricus dan L. plantarum) mampu menghambat pertumbuhan kapang dan produksi aflatoksin Aspergillus flavus, sedangkan supernatan bebas selnya tidak mampu menghambat pertumbuhan kapang, tetapi mampu menghambat produksi aflatoksin. Akan tetapi hasil penelitian Cabo et al. (2002) tidak menemukan adanya

14 2 efek penghambatan dari L. acidopihilus; Lactobacillus delbrueki subsp. Lactis dan Lactococcus lactis subsp. lactis terhadap kapang P. commune dan P. roqueforti. Dengan demikian potensi BAL sebagai antikapang umumnya lebih rendah dari sifat antibakterinya. Hal lain yang juga masih menjadi kendala di dalam penggunaan asam organik dari BAL ini adalah rasanya yang asam sehingga akan membatasi aplikasinya pada bahanbahan pangan. Salah satu upaya untuk mengatasi hal ini, adalah dengan mengkombinasikan metabolit BAL sebagai sumber asam organik dengan antimikroba lain yang juga bersifat sebagai antimikroba alami (antibakteri dan antikapang) seperti monoasilglisero l (MAG) dari minyak kelapa. Dengan cara ini diharapkan tidak hanya rasa asam dari metabolit BAL tersebut dapat direduksi tetapi juga aktivitas antimikrobanya menjadi efektif, dan peluang penggunaan antimikroba alami menjadi luas. Selain itu, penggunaan MAG minyak kelapa dan metabolit BAL sebagai senyawa antimikroba akan menguntungkan karena akan diperoleh senyawa antimikroba yang relatif aman serta mudah diperoleh, dan secara organoleptik dapat diterima. Monoasilgliserol (MAG) minyak kelapa yang pada awalnya hanya dikenal sebagai bahan pengemulsi pangan ternyata dapat berperan sebagai bahan pengawet pangan dan sifat ini tidak dimiliki oleh MAG dari minyak nabati lain (Wang et al. 1993). Perbedaan ini terutama oleh adanya asam lemak jenuh rantai pendek dan menengah, sedangkan minyak nabati lain didominasi oleh asam lemak tidak jenuh dan asam lemak jenuh rantai panjang. Jenis MAG minyak kelapa yang telah ditemukan bersifat antimikroba khususnya untuk bakteri dan kapang adalah monolaurin, monokaprilin, monokaprat, monomeristin dan monoasilgliserol. Outara et al. (1998) melaporkan bahwa penggunaan monolaurin menunjukkan penghambatan yang besar terhadap L. curvatus, B. thermosphacta dan L. sake (Gram positif), sedangkan terhadap bakteri P. flourescens, E. coli dan S. Typhimurium (Gram negatif), tidak menunjukkan penghambatan sampai dengan konsentrasi 2500 µg/ml. Hal yang sama juga ditemukan oleh Lee et al. (2002) menggunakan gliserol laurat diperoleh penghambatan yang tinggi terhadap B. cereus dan S. aureus, sedangkan terhadap E. coli O:157:O7 dan S. enteritidis tidak menunjukkan aktivitas penghambatan sampai pada pemberian konsentrasi 1000 ppm. Kabara (1993) melaporkan bahwa monokaprilin dan monolaurin memiliki Formatted: English (U.S.) Formatted: Swedish(Sweden) Formatted: Font color: Auto, Swedish (Sweden) Formatted: Swedish(Sweden)

15 3 kemampuan yang lebih besar dalam menghambat pertumbuhan bakteri, kapang dan khamir dibanding dengan asam sorbat yang merupakan asam organik dan banyak digunakan sebagai pengawet pangan. Monolaurin dalam bahan pangan diduga kuat memiliki efek sinergi dengan asamasam organik seperti asam atau garam laktat, asam atau garam sitrat maupun asam atau garam sorbat. Hal ini didasarkan pada penelitian Oh dan Marshall (1994) yang menemukan penurunan jumlah sel L. monocytogenes sebesar 0,5 unit log yang diberi monolaurin sebesar 0,72 mm dan 1 unit log pada pemberian 1,44 mm asam laktat. Bila monolaurin dan asam laktat dicampur mampu menurunkan sebesar 2 unit log pada produk udang yang disimpan pada suhu refrigerator 4 o C selama penyimpanan 20 hari. Efek sinergi dari asam organik dengan monolaurin dijelaskan oleh Blaszyk et al. (1998) disebabkan oleh kemampuan dari asam organik (asam lemah) dalam merusak atau mengganggu kestabilan dinding sel dan diperkuat oleh monolaurin yang mampu mempengaruhi struktur membran sel, kondisi ini yang menyebabkan sel lisis dan akhirnya mempercepat kematian sel mikroba. Selanjutnya dijelaskan Davidson dan Branen (1994) bahwa asam organik dan monolaurin secara bersamasama merusak membran dengan memperbesar pori membran, hal ini akan meningkatkan efektivitas dari monolaurin dalam mengganggu aktivitas enzimenzim terutama yang berperan dalam respirasi akibatnya ATP tidak terbentuk dan pada gilirannya sel mengalami lisis yang diikuti dengan kematian sel. Efek sinergi antimikroba monolaurin dengan asam organik telah dilaporkan oleh peneliti sebelumnya, namun belum ditemukan publikasi yang melaporkan efek sinergi dari asamasam organik maupun minyak atsiri dengan MAG minyak kelapa. Campuran metabolit BAL dan MAG minyak kelapa diharapkan dapat melengkapi sifat antimikroba, baik monolaurin sebagai komponen utama dari MAG minyak kelapa yang diketahui memiliki aktivitas tinggi terhadap bakteri Gram positif dan kapang sedangkan asam organik dari supernatan metabolit BAL terhadap Gram negatif serta rasa asam yang menjadi faktor pembatas dalam penggunaannya sebagai bahan pengawet pangan.

16 4 Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk : 1. Menyeleksi beberapa isolat bakteri asam laktat yang mempunyai kemampuan bersinergi dengan monoasilgliserol minyak kelapa dan penentuan rasio metabolit BALMAG minyak kelapa yang maksimum dalam menghambat pertumbuhan bakteri patogen (L. monocytogenes). 2. Mempelajari aktivitas campuran metabolit BALMAG minyak kelapa terhadap berbagai mikroba patogen dan penentuan nilai MIC (Minimum Inhibition Concentration) terhadap bakteri L. monocytogenes, B. cereus, E. coli dan S. Typhimurium. 3. Mengkaji mekanisme kerja antibakteri campuran metabolit BALMAG melalui pengamatan kebocoran sel bakteri dan perubahan morfologi sel menggunakan SEM (Scanning Electron Microscope). 4. Menentukan stabilitas antibakteri campuran metabolit BALMAG terhadap ph, pemanasan dan sistem pangan. Manfaat Penelitian Secara umum manfaat penelitian ini adalah dalam rangka pengembangan ilmu pangan terutama dalam bidang mikrobiologi pangan, dan secara khusus penelitian ini dilaksanakan untuk memperoleh informasi ilmiah tentang efek sinergi dari metabolit beberapa bakteri asam laktat dengan monoasilgliserol minyak kelapa dan aktivitasnya terhadap mikroba patogen guna meningkatan keamanan pangan serta me mperoleh bahan pengawet alami sebagai pengganti bahan antimikroba sintetik yang diketahui dapat menimbulkan berbagai masalah terutama di bidang kesehatan.

17 5 Hipotesis 1. Campuran metabolit BAL MAG minyak kelapa akan memberikan efek sinergi dalam mengh ambat pertumbuhan bakteri uji. 2. Efek sinergi campuran metabolit BAL dengan MAG minyak kelapa akan meningkat dengan meningkatnya rasio campuran metabolit BALMAG dan mencapai maksimum atau mendekati maksimum pada rasio campuran metabolit BALMAG minyak ke lapa yang sesuai. 3. Aktivitas antimikroba campuran metabolit BALMAG minyak kelapa berbeda untuk setiap jenis mikroba. 4. Campuran metabolit BALMAG minyak kelapa menyebabkan kebocoran protein dan asam nukleat serta menimbulkan perubahan morfologi pada sel bakteri patogen. 5. Stabilitas antibakteri campuran metabolit BALMAG dipengaruhi oleh ph, pemanasan dan sistem pangan. Formatted: Swedish(Sweden)

18 2. TINJAUAN PUSTAKA Bakteri Asam Laktat Bakteri asam laktat (BAL) erat kaitannya dengan proses fermentasi pangan, dan saat ini telah berkembang dalam industri fermentasi pangan. Stiles dan Holzapel (1997) menyatakan bahwa bakteri asam laktat (BAL) memiliki sifat Gram positif, tidak membentuk spora dan dapat berbentuk koki, kokobasili atau batang. Pada umumnya bakteri asam laktat bersifat katalase negatif, non motil atau sedikit motil, mikroaerofilik sampai anaerob, toleran terhadap asam, kemoorganotrofik dan membutuhkan suhu mesofilik (Salminen dan Von Wright 2004 ). Lebih lanjut dinyatakan oleh Jay (1996) bakteri asam laktat bersifat mesofilik dan termofilik, beberapa dapat tumbuh pada suhu 5 o C dan tertinggi 45 o C, dapat bertahan pada ph 3,2 dan pada ph yang lebih tinggi 9,6, beberapa hanya dapat tumbuh pada kisaran ph yang sempit (ph 4,0 4,5). Bakteri ini termasuk mikroorganisme GRAS (Generally Recognized as Safe) atau golongan mikroorganisme yang aman ditambahkan dalam makanan karena sifatnya tidak toksik dan tidak menghasilkan toksin, yang dikenal dengan sebutan food grade microorganism, yaitu mikroorganisme yang tidak beresiko terhadap kesehatan (Alakomi et al. 2000). Peran utama bakteri asam laktat adalah sebagai kultur starter produkproduk yang melibatkan proses fermentasi untuk memperoleh produk akhir dengan tingkat konsistensi yang tinggi. Selain menghasilkan produk akhir yang konsisten, bakteri asam laktat ternyata juga memiliki efek mengawetkan pada produk fermentasi yang diinginkan. Untuk tujuan pengawetan, dibutuhkan produksi massa sel yang tinggi, tahan selama pembekuan dan pengeringan, serta stabil selama penyimpanan. Disamping itu kultur harus mampu tumbuh pesat, tidak rentan terhadap phage, toleran terhadap garam dan stabil secara genetika (Jenie et al. 1996b). Pada dasarnya penggunaan bakteri asam laktat dalam makanan ditujukan untuk memperpanjang masa simpan, meningkatkan kualitas dan menghambat pertumbuhan mikroorganisme patogen dan pembusuk. Efek mengawetkan dan daya hambat dari bakteri asam laktat berkaitan dengan substansi antimikrobanya. Menurut Leverentz et al. (2006) bakteri asam laktat merupakan salah satu mikroorganisme yang dapat digunakan dalam mengontrol pertumbuhan bakteri

19 7 patogen dalam bahan pangan karena mampu menurunkan ph dan menghasilkan bakteriosin. Jenie et al. (2001) melaporkan bahwa bakteri asam laktat memiliki aktivitas antimikroba dengan memproduksi metabolit berupa produksi asam organik (asam laktat, asam format, dan asam asetat), diasetil, hidrogen peroksida, karbondioksida, bakteriosin dan juga komponenkomponen antimikroba yang bersifat antagonistik dengan spektrum yang luas terhadap mikroorganisme. Disamping itu Pitt et al. (2000) menyatakan bahwa selama proses fermentasi, bakteri asam laktat akan menghasilkan metabolitmetabolit yang menimbulkan perubahan rasa dan bentuk makanan serta menghambat pertumbuhan bakteri patogen dan pembusuk. Pembentukan asam pada produk metabolisme BAL akan menurunkan nilai ph, dan mengakibatkan mikroba patogen dan perusak yang umumnya tidak tahan suasana asam akan terhambat. Akumulasi produk akhir asam mengakibatkan turunnya ph dan akan menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif maupun bakteri Gram negatif. Kultur bakteri asam laktat dapat diisolasi dari berbagai produkproduk bahan pangan seperti pada produk sayuran (pikel, sauerkraut, sawi asin), produk fermentasi ikan (peda, bekasam, kecap ikan, silase, terasi dan sebagainya ), produkproduk daging, dan produk susu (yoghurt, susu asam keju ). Berdasarkan cara kerjanya terhadap glukosa, BAL dibagi menjadi dua golongan, yaitu homofermentatif yang mampu memfermentasi glukosa menjadi asam laktat sebagai produk utamanya, dan pada kelompok heterofermentatif yang mampu memfermentasi glukosa menjadi asam laktat dan senyawa lain, seperti asam asetat, CO 2, diasetil, bakteriosin dan etanol (Jay 1998). Metabolit Hasil Produksi Bakteri Asam Laktat Senyawa antimikroba merupakan senyawa kimia atau biologi yang dapat menghambat pertumbuhan dan aktivitas mikroba, dan senyawa tersebut sering digolongkan sebagai bahan pengawet. Bakteri asam laktat menghasilkan beberapa senyawa antimikroba. Senyawa antimikroba ini ada yang bersifat bakterisidal (membunuh bakteri), bakteriostatik (menghambat pertumbuhan bakteri), fungisidal (membunuh kapang dan khamir) dan fungistatik (menghambat pertumbuhan kapang dan khamir).

20 8 Komponen senyawa antimikroba yang terdapat dalam BAL disamping berfungsi sebagai antibakteri juga berfungsi sebagai antimikotik. Menurut Gourama dan Bullerman (1995) sifat antimikotik ini disebabkan oleh adanya senyawa polipeptida dan metabolit dari bakteri asam laktat dengan berat molekul rendah yang dapat menghambat pertumbuhan kapang serta dapat pula menghambat sintesis aflatoksin. Jenis kapang yang dapat dihambat adalah Aspergillus parasiticus, A. fumigatus, Rhizopus sp dan lain lain. Stilles et al. (2002) dalam Magnusson (2003) menemukan adanya efek penghambatan dari Lactobacillus sanfrancisco CBI yang menghasilkan metabolit yang mengandung asam propionat, asam butirat dan valerat terhadap beberapa jenis kapang diantaranya Penicillium spp, Aspergillus spp, Fusarium spp, dan Monilla spp. Cabo et al. (2002) melaporkan temuannya bahwa bakteri asam laktat dari L. plantarum dan L. casei subsp. casei sangat efektif dalam menghambat P. commune dan P. roqueforti dan kurang efektif terhadap Aspergillus parasiticus, Aspergillus flavus dan Fusarium avenaceum tetapi dapat mengendalikan produksi aflatoksin dari Aspergillus flavus. Efektivitas antimikroba dalam mengawetkan bahan makanan adalah dengan cara mengendalikan pertumbuhan mikroorganisme atau secara langsung memusnahkan seluruh atau sebagian mikroorganisme (Brannen dan Davidson 1993). Frazier et al. (1987) mengemukakan bahwa kemampuan suatu senyawa antimikroba di dalam menghambat atau membunuh mikroba sangat ditentukan oleh (1) konsentrasi senyawa antimikroba, (2) jenis, jumlah, umur dan latar belakang kehidupan mikroorganisme, (3) Suhu dan waktu kontak, serta (4) sifat fisik dan kimia media (ph, kadar air, jenis dan jumlah zat terlarut). Asam Organik Produk Metabolit BAL Asamasam organik yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat mengakibatkan akumulasi produk akhir asam dan penurunan ph yang akan menghambat pertumbuhan bakteri baik Gram positif maupun bakteri Gram negatif. Aktivitas asamasam lipofilik seperti asam laktat dan asetat dalam bentuk tidak terdisosiasi dapat menembus sel mikroba, dan pada ph intraseluler yang lebih tinggi, berdisosiasi menghasilkan ionion hidrogen dan mengganggu fungsi metabolit esensial seperti translokasi substrat dan fosforilasi oksidatif, dengan demikian mereduksi ph intraseluler (Cabo et al. 2002). Hal yang sama juga

21 9 dinyatakan oleh Jenie et al. (1996a) bahwa efek penghambatan dari asam organik terutama berasal dari jumlah asam yang tidak terdisosiasi. Asam lipofilik seperti asam laktat dan asam asetat dalam bentuk tidak terdisosiasi dapat menembus sel mikroba. Stratford (2000) menyatakan asam lemah dapat menurunkan ph sitoplasma, mempengaruhi struktur membran dan fluiditasnya serta mengkelat ionion dinding sel bakteri. Penurunan ph sitoplasma akan mempengaruhi protein struktural sel, enzimenzim, asam nukleat dan fosfolipid membran (Davidson dan Branen 1994). Mekanisme asam lemah (asam organik) dalam menginaktivasi sel bakteri dapat dilihat pada Gambar 2.1. Hanya molekul asam lemah yang tidak bermuatan (HA) dapat masuk melalui membran plasma. Anion (A ) dan proton (H + ) akan terbentuk di dalam sel, selanjutnya proton yang berlebih di dalam sitoplasma akan dikeluarkan oleh enzim ATPase yang terdapat pada membran (Garbutt 1997). ph internal berubah, protein sel dan DNA terganggu RCOOH kondisi internal RCOOH + H + RCOO + H + (Bentuk tidak terurai masuk) RCOO + H + sel membran tidak dapat (ditembus dalam bentuk terurai) Gambar 2.1. Mekanisme asam lemah (organik) dalam menginaktivasi bakteri (Garbutt 1997) Beberapa penelitian telah melaporkan efek penghambatan dari berbagai asam organik terhadap mikroba patogen atau perusak, diantaranya adalah Bloom et al. (1997) yang menyatakan bahwa penggunaan asam organik berupa 2,5% asam laktat dan 0,25% asam asetat pada penyimpanan suhu rendah mampu memperpanjang masa simpan dari daging babi panggang hingga 5 minggu. Penelitian lain juga telah dilaporkan oleh Castilo et al. (2001) yang menggunakan

22 10 larutan asam laktat pada konsentrasi 4% (volume 500 ml) dengan cara menyemprotkan pada karkas sapi ternyata efektif dalam mereduksi mikroba patogen, yakni koliform dan E. coli. Pitt et al. (2000) melaporkan hasil temuannya yang menggunakan berbagai jenis asam organik produksi bakteri asam laktat pada susu pasteurisasi yang mampu menghambat pertumbuhan Listeria monocytogenes. Monoasilgliserol Monoasilgliserol merupakan suatu emulsifier yang bersifat non ionik dan tidak terlalu berpengaruh (tidak sensitif) terhadap suasana asam. Sifat emulsifier pada monoasilgliserol disebabkan oleh monoasilgliserol memiliki dua gugus bersifat polar dan satu gugus bersifat non polar atau mengandung gugus hidrofilik dan hidrofobik (Igoe dan Hui 1996). Dalam industri pangan monoasilgliserol digunakan sebagai surfaktan, emulsifier pada pengolahan margarin, mentega kacang, puding, roti, biskuit dan kuekue kering yang mengandung lemak. Twillman dan White (1988) melaporkan bahwa monoasilgliserol dapat memperbaiki tekstur adonan roti dan juga memperpanjang masa simpan tortila jagung. Monoasilgliserol dalam adonan akan bereaksi dengan amilopektin membentuk senyawa kompleks yang berperan memperbaiki tekstur roti serta memperpanjang masa simpan dari roti (Hasenhuetti dan Hartel 1997). Monoasilgliserol terbentuk dari reaksi antara asam lemak dengan gliserol atau gliserol dengan triasilgliserol (minyak/lemak), sedangkan mono dan diasilgliserol terbentuk dari reaksi antara gliserol dengan triasilgliserol (minyak). Reaksi tersebut dikenal dengan nama reaksi gliserolisis. Reaksi ini dapat berlangsung dengan adanya katalis alkali (gliserolisis cara kimia) maupun dengan biokatalis lipase (gliserolisis cara enzimatik). Gliserolisis cara enzimatik mempunyai beberapa kelebihan dibandingkan dengan gliserolisis cara kimia. Kelebihan tersebut antara lain reaksi berlangsung pada suhu relatif rendah, hasil samping yang rendah dan produk reaksi dikelompokkan sebagai produk alami dalam arti aman untuk dikonsumsi (Siswohutomo et al. 2002). Rendemen monoasilgliserol yang terbentuk tergantung pada jenis minyak, sumber lipase, perbandingan antara minyak dan gliserol, atau ph substrat. Penggunaan lipase dengan jumlah yang sama pada pembuatan monoasilgliserol dari minyak kelapa dan lemak susu menghasilkan rendemen yang berbeda, rendemen monoasilgliserol dari minyak kelapa diatas 70 persen sedangkan dari

23 11 lemak susu tidak lebih dari 60 persen (August 2000). Hasil penelitian Mappiratu (1999) menemukan produksi monoasilgliserol minyak kelapa untuk produksi antimikroba mencapai maksimum pada kisaran rasio gliserol : minyak : dedak : heksana sebesar 0,3 : 0,75 : 2,5 :10 (b/b/b/v), dengan suhu reaksi 37 o C, ph 7, waktu reaksi 72 jam. Sifat Antimikroba Monoasilgliserol Minyak Kelapa Monoasilgliserol (MAG) minyak kelapa mempunyai peluang yang cukup tinggi untuk digunakan sebagai bahan pengawet pangan, sebab monoasilgliserol minyak kelapa mempunyai sifat antimikroba yang tidak dimiliki oleh MAG dari minyak nabati lain. Beberapa peneliti melaporkan bahwa MAG tertentu mempunyai kemampuan dalam menghambat pertumbuhan bakteri gram positif, yeast, virus, fungi dan sel tumor. Menurut Blaszyk et al. (1998) monolaurin sangat efektif terhadap bakteri Gram positif dan jamur, tetapi tidak efektif terhadap bakteri Gram negatif. Hal ini diperkuat dengan hasil penelitian Ouattara (1997) tentang pengaruh monolaurin terhadap bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Hasil penelitiannya menunjukkan bahwa efek penghambatan hanya terjadi pada bakteri Gram positif. Hasil penelitian Mappiratu (1999) menunjukkan diameter zona penghambatan monoasilgliserol terhadap bakteri Gram positif lebih tinggi dari pada bakteri Gram negatif, dan terhadap khamir dan kapang zona penghambatannya lebih rendah. Beuchat (1980) melakukan suatu pengujian dengan membandingkan aktivitas antibakteri dari monolaurin dengan natrium benzoat dan asam sorbat menggunakan Vibrio parahaemoliticus sebagai bakteri penguji. Hasil pengujian menunjukkan bahwa monolaurin lebih aktif dibandingkan dengan natrium benzoat dan asam sorbat. Fenomena ini sejalan dengan pernyataan Branen dan Davidson (1993) bahwa ester monoasilgliserol dalam bentuk monolaurin dan monokaprin memiliki daya antibakteri yang kuat terhadap B. cereus, S. aureus dan B. subtilis dengan nilai MIC sekitar µg/ml. Jika dibandingkan dengan asam sorbat, daya antibakteri tersebut lebih tinggi dengan nilai MIC pada asam sorbat sebesar 4000 µg/ml. Secara rinci nilai MIC untuk bakteri uji tertera pada Tabel 2.1, sedangkan untuk nilai MIC kapang dan khamir tertera pada Tabel 2.2.

24 12 Tabel 2.1. Aktivitas antibakteri monolaurin dan bahan pengawet pangan lainya Antibakteri Konsentrasi minimum yang menghambat bakteri (µg/ml) Bacillus cereus Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Sukrosa dikaprilin Monokaprin (MC 10) Monolaurin (MC 12) Butilphidroksi benzoat Asam sorbat Sumber : Branen dan Davidson (1993). Tabel 2.2. Aktivitas antikapang monolaurin dan bahan pengawet pangan lain Antibakteri Konsentrasi minimum yang menghambat kapang dan khamir (µg/ml) Aspergillus niger Candida utilis Saccharomyces Cerevisiae Monokaprin (MC 10) Monolaurin (MC 12) Butilphidroksi benzoat Asam sorbat Asam dehidroasetat Sumber : Branen dan Davidson ( 1993). Monolaurin dapat menghambat produksi aflatoksin dari A. flavus dan A. parasiticus pada perbandingan konsentrasi asam sorbat 1000 ppm, dan monolaurin 750 ppm (Chipley et al. 1981). Hal ini menunjukkan bahwa monolaurin lebih efektif dibandingkan dengan asam sorbat. Asam sorbat merupakan jenis bahan pengawet yang umumnya digunakan sebagai antibakteri dan antikapang. Menurut Oh dan Marshall (1994) monolaurin termasuk komponen utama monoasilgliserol minyak kelapa dan mempunyai aktivitas antimikroba dengan spektrum luas mencakup bakteri Gram positif, khamir dan kapang serta sebagian Gram negatif. Monolaurin merupakan antimikroba yang aman dan dianggap paling

25 13 efektif diantara turunan asam lemak. Asam lemak monoasilgliserol minyak kelapa termasuk jenis asam lemak jenuh rantai pendek dan menengah (C8C14). Asam lemak rantai pendek dan menengah dari monoasilgliserol tersebut berperan sebagai antimikroba (Wang et al. 1993). Tabel 2.3. Komposisi asam lemak beberapa jenis minyak nabati Jenis minyak Persen mol asam lemak bebas beratom karbon 8:1 10:0 12:0 14:0 16:0 18:0 18;1 18;2 18:3 Kelapa 7,6 7,3 48,2 16,6 8,0 3,8 5,0 2,5 Sawit 0, ,8 3,8 37,6 10,0 Kacang kedele 0,1 46,8 3,8 37,6 10,0 8,3 Biji kapas 0,1 10,5 3,2 22,3 54,5 Jagung 11,5 2,2 26,6 58,7 0,8 Kacang tanah 11,0 2,3 51,0 30,9 Zaitun 16,9 1,7 59,1 22,8 8,2 Biji lobak 4,3 1,7 59,1 22,8 8,2 Dedak padi 0,49 13,8 43,6 23,6 1,2 Sumber : Salunke et al. (1992) Selain itu, monolaurin dan monokaprin juga dilaporkan mempunyai aktivitas antimikroba yang banyak digunakan dalam produksi makanan dan kosmetika (August 2000). Nair et al. (2005) melaporkan temuannya terhadap penggunaan monokaprilin pada jus apel yang disimpan pada suhu 4 dan 23 o C selama 14 dan 21 hari efektif membunuh bakteri E. coli O157:H7. Lebih lanjut dinyatakan bahwa penyimpanan pada suhu 23 o C lebih efektif dibanding dengan suhu 4 o C, baik pada penyimpanan 14 hari maupun pada penyimpanan 21 hari. Mekanisme aktivitas antibakterial monoasilgliserol minyak kelapa belum diketahui dengan pasti, namun monoasilgliserol yang bersifat lipofilik ini memungkinkan untuk menembus membran plasma dan menghambat aktivitas enzim yang terlibat dalam produksi energi dan transport nutrien. Monolaurin menyebabkan kerusakan yang ekstensif pada membran dengan cara merusak protein ekstraseluler, asam nukleat dan menurunkan aktivitas enzim tertentu. Mekanisme kerja dari monogliserida dan asam lemak telah diteliti oleh Davidson

26 14 dan Branen (1994). Pengaruh dari asam lemak dan monogliserida terhadap sistim oksidasi NADH 2 memiliki kesamaan. Aktivitas sistem ini menurun 50% dengan menggunakan 0,64 nmol asam lemak atau 0,14 nmol monogliserol per gram protein. Pengaruh dari kedua kelompok lipid ini terhadap respirasi seluler dan penelitian mengenai efek penghambatan monogliserida terhadap beberapa sistem enzim menunjukkan bahwa monogliserida hanya bekerja pada sisi oksigen pada gugus flavin dari NADH 2 dehidrogenase, sedangkan asam lemak merupakan penghambatan kurang spesifik yang bekerja pada beberapa sisi. Antimikroba monolaurin mempunyai efek sinergi dengan bahan pengawet pangan lain, seperti asam sitrat, asam atau garam laktat dan asam atau garam sorbat. Davidson dan Branen (1994) melaporkan bahwa penggunaan campuran monolaurin dengan kalsium laktat meningkatkan waktu simpan kamaboko (pasta ikan) dari 6 hari menjadi 20 hari. Catsara et al. (1987) melaporkan bahwa penggunaan laurilak (campuran monolaurin dengan asam laktat ) sebanyak 500 ppm dalam daging sapi giling dapat mereduksi total koloni Salmonella typhymurium dari 2,47 x 10 5 CFU/gram menjadi kurang dari 10 2 CFU/gram. Selanjutnya Unda et al. (1991) melaporkan bahwa monolaurin dan natrium laktat sangat efektif menghambat pertumbuhan bakteri anerobik pada suhu tinggi, dan menurutnya kombinasi laktat dan monolaurin sangat potensial mengontrol Clostridia dan Listeria pada produk daging sapi dalam mikrowave. Hal yang sama dilaporkan oleh Blaszyk et al. (1998) yang menggunakan monolaurin dan asam sitrat maupun garam sitrat, campuran monolaurin dan asam/garam sitrat tersebut ternyata mampu menghambat pertumbuhan dari L. monocytogenes dan E. coli pada daging. Selain itu menurut Liskar dan Poster (1982) monolaurin lebih efektif menghambat pertumbuhan kapang dan khamir bila dicampur dengan asam sorbat. Penurunan massa sel (%) kapang dan khamir pada beberapa jenis antimikroba disajikan pada Tabel 2.4.

27 15 Tabel 2.4. Penurunan massa sel (%) kapang dan khamir pada beberapa jenis antimikroba pada konsentrasi 1 %. Kapang dan khamir Pythium elongatum Phytophthora citrophthora Muco circinelloides Rhizopus stolonifer Aspergillus flavus Aspergillus ochraccus Aspergillus niger Penicillium digitetum Laurisidin plus F Laurisidin Asam sorbat Lauribik Asam propionat 100,0 10,0 100,0 100,0 100,0 100,0 41,2 100,0 100,0 100,0 100,0 30,5 94,3 100,0 78,7 100,0 10,1 100,0 100,0 100,0 100,0 28,6 83,5 100,0 79,9 100,0 21,1 73,5 100,0 84,1 100,0 40,3 100,0 100,0 97,6 100,0 39,3 100,0 100,0 100,0 P. patulum 100,0 18,9 75,2 100,0 65,7 Fusarium graminearum 100,0 20,1 100,0 100,0 100,0 S. cerevisiae 100,0 26,5 100,0 100,0 23,2 Candida albicans Rhodotorola mucilanginosa Sporobolomuces sp Sclerotium rolfsii Rhizoctonia solani Sumber : Liskar dan Poster (1982). 100,0 17,5 100,0 100,0 11,7 100,0 98,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 63,3 100,0 100,0 100,0 100,0 54,9 98,2 100,0 100,0 Temuantemuan tersebut di atas menunjukkan bahwa monolaurin bersifat sinergi dengan asamasam organik. Efek sinergi dari campuran monolaurin dan asam sitrat (asam organik) dijelaskan oleh Blaszyk et al. (1998) karena berbagai mekanisme yang bervariasi, seperti monolaurin dapat mempengaruhi struktur

28 16 membran sel sedangkan asam sitrat (asam organik) bersifat merusak atau mengganggu kestabilan zat pelindung dari dinding sel, yaitu lipopolisakarida (LPS). Mikroba Patogen pada Bahan Pangan Aspek mikrobiologis pada bahan pangan memiliki peranan yang cukup penting karena bahan pangan dapat merupakan salah satu sumber timbulnya suatu penyakit. Gangguan terhadap kesehatan yang diakibatkan oleh makanan khususnya gangguan pada saluran pencernaan yang berkaitan dengan konsumsi pangan diklasifikasikan sebagai penyakit yang disebabkan melalui rantai makanan (Food borne desease). Penyakit yang disebabkan oleh bakteri yang masuk ke dalam tubuh melalui makanan diklasifikasikan ke dalam dua kelompok: (a) infeksi yang disebabkan oleh pertumbuhan patogen dari patogen yang terbawa oleh makanan; dan (b) infeksi yang disebabkan oleh pertumbuhan bakteri patogen dengan makanan sebagai media kultur untuk pertumbuhannya hingga mencapai jumlah yang memadai untuk menimbulkan infeksi bagi yang mengkonsumsi makanan tersebut, misalnya infeksi Salmonella spp, Listeria monocytogenes dan E. coli (Frazier et al ). Penerapan suatu senyawa antimikroba pada bahan pangan memerlukan pengujian terlebih dahulu, karena aktivitas suatu bahan antimikroba berbedabeda dan sangat dipengaruhi oleh komponen yang ada pada senyawa tersebut, serta jenis mikroba ujinya. Mikrobamikroba tersebut dapat digolongkan ke dalam bakteri dan kapang yang bersifat patogen, yang akan dihambat pertumbuhannya dengan senyawa antimikroba dari metabolit BALMAG. Mikroba pembentuk spora Bacillus cereus merupakan salah satu kelompok pembentuk spora yang penyebarannya sangat luas dan dapat menyebabkan infeksi baik pada manusia maupun pada hewan. Bakteri ini berbentuk batang, bersifat aerob sampai aerob fakultatif, katalase positip dan kebanyakan bersifat gram positif. Suhu pertumbuhan minimum 45 o C, pertumbuhan maksimum pada suhu 4850 o C dengan suhu optimal 3045 o C, dan tumbuh pada ph antara 4,99,3 (Granum dan BairdParker 2000). Bahan pangan yang terkontaminasi B. cereus selain menimbulkan kerusakan pada bahan pangan juga dapat bersifat patogen pada manusia, yaitu dapat

29 17 menyebabkan septikemia dan meningitis dengan waktu inkubasi 0,55 jam (Ryu et al. 2005). Berdasarkan sifat patogenik, bakteri dibagi ke dalam tiga kelompok (Ryu et al. 2005), yaitu: (1) galur penyebab diare (memproduksi toksin piogenik) dengan gejala mualmual, keram perut, diare dan kadangkadang muntah setelah inkubasi selama 86 jam; (2) galur penyebab muntah (memproduksi toksin emetik) dengan gejala mualmual dan muntah setelah inkubasi 16 jam (ratarata 25 jam) dan (3) tidak memproduksi enterotoksin. Keberadaan bakteri di dalam tubuh manusia perlu diwaspadai, karena masyarakat Indonesia seringkali menyimpan makanan matang tanpa perlakuan khusus atau memasak tanpa pemanasan suhu yang tinggi. Hal ini dapat menimbulkan kerusakan terhadap makanan tersebut terutama karena tercemar oleh B. cereus. Bakteri Gram Negatif Escherechia coli merupakan bakteri patogen Gram negatif, oksidase negatif berbentuk batang dengan ukuran 1,11,5 µm x 26 µm, dan bersifat motil karena adanya flagella. Bakteri ini banyak menimbulkan gangguan kesehatan pada manusia dan merupakan flora normal yang terdapat pada saluran pencernaan manusia dan hewan, dan umumnya ditemukan pada daging giling dan produk olahan sejenisnya. Suhu pertumbuhan berada dalam kisaran yang luas, mulai dari 145 o C, sehingga kemungkinan pangan tercemar oleh bakteri ini sangat besar jika penanganannya kurang memadai. Berdasarkan gejala dan karakteristik penyakit yang ditimbulkan, E. coli dikelompokkan menjadi lima kelompok, yaitu Enteroaggregative E. coli (EaggEC), Enterohemorrhagic E. coli (EHEC), Enteroinvasive E. coli (EIEC), Enteropathogenic E. coli (EPEC), dan Enterotoxigenic E. coli (ETEC). E. coli sangat sensitif terhadap panas dan dapat diaktifkan pada suhu pasteurisasi atau selama pemasakan makanan (Supardi dan Sukamto 1999). Kontaminasi bakteri ini pada makanan biasanya berasal dari kontaminasi air yang digunakan. Dosis yang dapat menimbulkan gejala infeksi E. coli pada makanan berkisar antara sel. Bahan makanan yang sering terkontaminasi oleh E. coli antara lain daging babi, daging ayam, ikan, telur dan olahannya serta makanan hasil laut lainnya.

30 18 Salmonella sp juga merupakan kelompok bakteri Gram negatif dan merupakan bakteri patogen yang tidak diperkenankan ada dalam produk produk pangan. Bakteri ini dapat tumbuh pada kisaran suhu 545 o C, dengan suhu optimum 37 o C, meskipun dapat tumbuh pada suhu di bawah 10 o C, dengan ph optimum 6,5 7,5. Salmonella memiliki ketahanan panas yang tinggi pada ph 5,5 dan a w rendah (Portilo 2000). Salmonella dibagi menjadi 3 spesies yaitu S. Typhi, S. enterica dan S. enteritidis. Salmonella Typhimurium merupakan spesies Salmonella enterica serovar Typhimurium (D, Aost 2000). Bakteri ini dapat menimbulkan infeksi, dan jika tertelan masuk ke dalam tubuh akan menimbulkan gejala yang disebut salmonellosis. Infeksi ini berakibat fatal, terutama jika menyerang bayi. Oleh sebab itu infeksi Salmonella pada makanan mendapat perhatian yang serius, karena bakteri ini seringkali menimbulkan penyakit terutama di negaranegara industri. Bakteri Gram Positif Listeria monocytogenes merupakan bakteri patogen pada manusia dan seringkali ditemukan pada bahan pangan segar meskipun disimpan pada suhu rendah, seperti buah melon dan beberapa jenis buah lainnya maupun sayuran ditemukan telah terkontaminasi dengan L. monocytogenes selama penyimpanan pada suhu rendah (Leverentz et al. 2006). Bakteri ini berbentuk batang, berukuran panjang 0,52,0 µm, diameter 0,40,5 µm, mempunyai flagella (motil positif) yang bersifat anerobik fakultatif, dan memproduksi asam dan dekstrosa atau maltosa (tanpa gas). Kisaran suhu pertumbuhan L. monocytogenes antara 145 o C dengan suhu optimum o C, namun dapat pula tumbuh pada suhu 2,544 o C dan bersifat fermentatif (Fardiaz 1989). Keberadaan bakteri ini dalam bahan pangan perlu menjadi perhatian penting terutama dalam industri pengolahan pangan termasuk produkproduk olahan daging dan unggas (Ming et al. 1997). Berdasarkan laporan hasil penelitian diketahui bahwa bakteri ini dapat tumbuh pada suhu 0 o C, dan dapat hidup pada suhu 37 o C selama 15 hari pada substrat yang mengandung NaCL 10,5% atau 10 hari pada substrat NaCl 13% atau 5 hari pada substrat NaCl 20% pada suhu 4 o C. Oleh karena itu jumlah bakteri ini dalam bahan pangan harus dikendalikan dan tidak diperkenankan berada pada bahan pangan lebih dari satu sel per gram bahan. L. monocytogenes dapat direduksi pertumbuhannya sebesar 1,5 unit log dengan penggunaan campuran asam laktat dan monolaurin (Oh dan Marshall 1994).

31 19 Kapang Aspergillus flavus A. flavus merupakan salah satu jenis kapang yang mudah ditemukan di manamana, baik di udara, air maupun di tanah, dan tumbuh pada bahan pangan maupun pakan, seperti pada jagung, beras dan kacang tanah (Moreau dan Moss 1997). A. flavus tumbuh pada kelembaban relatif 8285% dengan suhu minimum 1012 o C, suhu maksimum 4348 o C dan suhu optimum pertumbuhan sekitar 33 o C. Pertumbuhan A. flavus mencakup kisaran ph yang sangat luas, yaitu dari 2,111,2, dengan ph optimum pertumbuhan 3,410 dan aktivitas air (a w ) sekitar 0,780,84 (Pitt dan Hocking 1996). Pertumbuhan optimum A. flavus pada kadar air 1530%. A. flavus merupakan penghasil utama aflatoksin, yang merupakan mikotoksin terpenting dalam penyimpanan makanan. Aflatoksin merupakan kelompok metabolit sekunder yang terbentuk setelah fase logaritmik pertumbuhan kapang A. flavus pada suhu antara 7,540 o C dengan suhu optimum 2428 o C. Menurut Jay (1996), pembentukan aflatoksin pada kacang tanah terjadi pada a w optimum 0,930,98, RH 83% atau lebih tinggi pada suhu 30 o C dan ph 5,57,0. Toksin ini bersifat akut dan kronis terhadap hewan dan manusia. Sebagai contoh, dari tahun tidak kurang dari sampel jagung, kacang tanah, kedelai, gandum dan rempahrempah di Asia Tenggara dilaporkan telah banyak terkontaminasi Aspergillus flavus (Pitt dan Hocking 1996). Mekanisme Kerja Senyawa Antimikroba Kemampuan suatu senyawa antimikroba dalam menghambat pertumbuhan mikroba merupakan suatu kriteria yang penting dalam pemilihan suatu senyawa antimikroba yang berfungsi sebagai bahan pengawet. Semakin kuat efek penghambatannya semakin efektif digunakan. Suatu senyawa dikatakan bersifat antimikroba karena dapat menimbulkan kerusakan pada sel mikroba yang akhirnya akan menimbulkan kematian. Kerusakan yang ditimbulkan ini ada yang bersifat mikrosidal (kerusakan tetap) atau mikrostatik (kerusakan yang dapat kembali). Sifat kerusakan tergantung pada konsentrasi komponen dan kultur yang digunakan (Bloomfield 1991). Mekanisme kerusakan sel akibat senyawa antimikroba secara umum telah diketahui, tetapi mekanisme dari gabungan asamasam organik dan

32 20 monoasilgliserol belum diketahui secara pasti. Namun dapat diasumsikan bahwa baik asam organik maupun monoasilgliserol dapat menimbulkan kerusakan terhadap mikroba dengan mekanisme yang hampir sama dengan mekanisme antimikroba secara umum. Secara umum mekanisme kerja dari suatu senyawa antimikroba dapat dilakukan melalui mekanisme yang berbeda, yaitu: (1) mengganggu atau merusak komponen penyusun dinding sel, (2) bereaksi dengan membran sel yang menyebabkan peningkatan permeabilitas seluler, (3) inaktivasi enzimenzim esensial dan (4) destruksi atau inaktivasi fungsi dari materi genetik (Brannen dan Davidson 1993). Terjadinya penghambatan senyawa antimikroba terhadap selsel mikroba disebabkan oleh adanya pelekatan senyawa antimikroba pada permukaan sel mikroba atau adanya difusi dari senyawa antimikroba tersebut ke dalam sel (Fardiaz et al. 1989). Gangguan pada Komponen Penyusun Dinding Sel Unit dasar dari dinding sel bakteri disusun oleh peptidoglikan yang secara mekanis memberikan ketegaran pada sel bakteri, disamping sebagai dasar membran sitoplasma. Peptidoglikan tersebut terdiri dari turunan gula, yaitu asam N asetilglukosamin dan Nasetilmuramat serta asam amino Lalanin, Dalanin, D glutamat, dan lisin. Struktur dinding sel bakteri Gram positif mengandung 90% peptidoglikan serta lapisan tipis asam teikoat dan asam teikuronat yang bermuatan negatif, struktur sel pada bakteri Gram negatif memiliki komponen dinding sel 5 10% peptidoglikan, selebihnya terdiri dari protein, lipoprotein dan lipopolisakarida. Dinding sel bakteri Gram negatif lebih kompleks dibandingkan Gram positif (Gambar 2.4). Perbedaan utama terletak pada lapisan membran luar, yang meliputi lipopolisakarida (Madigan et al. 2003). Kehadiran membran ini menyebabkan dinding sel bakteri Gram negatif kaya kandungan lipida (1122%). Membran tersebut tidak hanya terdiri dari fosfolipida saja seperti pada membran plasma tetapi juga mengandung lipida lainnya, seperti polisakarida dan protein. Lipida dan polisakarida ini berhubungan erat dan membentuk struktur khas yang disebut lipopolisakarida (LPS).

33 21 Lipopolisakarida ini terikat satu sama lain dengan kation divalent Ca 2+ dan Mg 2+ (Murray et al. 1998). a) Bakteri Gram positif b) Bakteri Gram negatif Gambar 2.2. Struktur dinding sel bakteri Gram positif dan Gram negatif (Russel Kightley, 2006) Membran luar bakteri Gram negatif mempunyai peranan sebagai barrier masuknya senyawasenyawa yang tidak dibutuhkan sel, diantaranya bakteriosin, enzim dan senyawa yang bersifat hidrofobik (Alakomi et al. 2000). Dalam upaya untuk mencapai sasaran, senyawa antimikroba dapat menembus LPS dari dinding sel tersebut. Molekulmolekul yang bersifat hidrofilik lebih mudah melewati LPS dibandingkan dengan yang bersifat hidrofobik. Bakteri Gram positif, tidak mempunyai LPS, sehingga fungsi penghalangnya tidak ada dan molekul senyawa antimikroba yang bersifat hidrofilik dan hidrofobik dapat melewatinya (Best 1999). Bakteri Gram negatif mempunyai sisi hidrofilik, yaitu karboksil, asam amino dan hidroksil. Asamasam organik seperti asam sitrat, asam malat, asam tartrat dan asam laktat dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram negatif dengan mengkelat kation divalen Ca 2+ dan Mg 2+. Ketika kedua kation tersebut terlepas dari membran luar maka senyawa antimikroba akan lebih mudah masuk ke dalam sel (Stratford 2000).

34 22 Penghambatan senyawa antimikroba merupakan kemampuan suatu senyawa antimikroba untuk mempengaruhi dinding sel mikroba (Ultee et al. 2000). Menurut Kabara (1993) asamasam lemak terutama asam laurat dapat menghambat enzim yang terlibat pada produksi energi dan pembentukan komponen struktural sehingga pembentukan dinding sel bakteri terganggu. Mekanisme kerusakan dinding sel dapat disebabkan oleh adanya akumulasi komponen lipofilik yang terdapat pada dinding sel atau membran sel, sehingga menyebabkan perubahan komposisi penyusun dinding sel. Terjadinya akumulasi senyawa antibakteri dipengaruhi oleh bentuk tak terdisosiasi. Pada ph rendah asam organik maupun asam lemak yang terdapat dalam metabolit BALMAG minyak kelapa kebanyakan berbentuk tidak terdisosiasi, dan adanya gugus hidrofobik sehingga dapat mengikat daerah hidrofobik membran protein serta melarut baik pada fase lipid dari membran bakteri. Umumnya senyawa antimikroba yang menghambat sintesis peptidoglikan karena kemampuan dari senyawa tersebut dalam menghambat enzimenzim yang berperan dalam pembentukan peptidoglikan, seperti karboksipeptidase, endopeptidase dan transpeptidase. Jika aktivitas enzimenzim tersebut dihambat oleh senyawa antibakteri maka sifat enzim autolitik sebagai regulator hilang dan enzim tidak mampu mengendalikan aktivitasnya sehingga dinding sel tersebut akan mengalami degradasi (Murray et al. 1998). Bereaksi dengan membran sel Senyawa antimikroba dapat mengganggu dan mempengaruhi integritas membran sitoplasma, yang dapat mengakibatkan kebocoran materi intraseluler, seperti asam lemak pada monoasilgliserol yang dapat mengakibatkan gangguan pada permeabilitas membran, yang ditandai dengan terjadinya peningkatan permeabilitas membran sebagai akibat adanya perubahan komposisi fosfolipid. Kondisi ini menyebabkan monoasilgliserol lebih mudah menembus membran sel dan akhirnya terjadi kebocoran sel, yang diikuti dengan keluarnya materi intraseluler. Sel bakteri dikelilingi oleh struktur kaku yang disebut dinding sel, yang melindungi membran sitoplasma, baik osmotik maupun mekanik. Setiap zat yang mampu merusak dinding sel atau mencegah sintesisnya, akan menyebabkan

35 23 terbentuknya selsel yang peka terhadap osmotik. Adanya tekanan osmotik dalam sel bakteri akan menyebabkan terjadinya lisis, yang merupakan dasar efek bakterisidal pada bakteri yang peka (Setiabudy 2000). Kebocoran membran sitoplasma dapat pula terjadi karena asamasam organik. Asam organik yang tidak terdisosiasi mampu menembus dinding sel dan mengganggu permeabilitas membran. Selain itu setelah berada dalam sitoplasma akan terdisosiasi menghasilkan proton, dan proton yang berlebihan akan menyebababkan keseimbangan terganggu. Gangguan tersebut berakibat pada berkurangnya energi sel untuk pertumbuhan karena dialihkan untuk menyeimbangkan proton, dan juga akan mengganggu transport asam amino dan gula. Menginaktifkan Enzim Esensial Komponen antibakteri dapat menghambat pertumbuhan atau membunuh mikroorganisme dengan cara mengganggu aktivitas enzimenzim metaboliknya. Beberapa senyawa antibakteri yang diketahui dapat menginaktivasi enzim seperti asam benzoat, asam lemak, sulfit dan nitrit. Nitrit dapat menghambat sistem enzim fosfat dehidrogenase, sehingga mengakibatkan reduksi ATP dan ekskresi piruvat dalam bakteri S. aureus. Asam benzoat dapat menghambat aktivitas aketoglutarat dehidrogenase dan suksinat dehidrogenase. Hal ini akan menghambat konversi a ketoglutarat menjadi suksinil CoA dan suksinat menjadi fumarat. Kim et al. (1995) mengemukakan bahwa senyawa antimikroba dapat merusak sistim metabolisme di dalam sel dengan cara menghambat sintesis protein bakteri dan menghambat kerja enzim intraseluler. Sistem enzim yang terpengaruh akan mengakibatkan gangguan pada produksi energi penyusun sel dan sintesis komponen secara struktural. Selain itu asamasam lemak mampu bereaksi dengan enzim dehidrogenase dan akan mengakibatkan hilangnya aktivitas enzim tersebut. Gangguan aktivitas enzim dapat terjadi pada saat mikroba mensintesis asam dihidrofolat dari paminobenzoat (Davidson dan Branen 1994). Menginaktifkan fungsi material genetik Umumnya suatu senyawa antimikroba yang akan menghambat sintesis protein yang mampu mengikat ribosom. Sebagaimana diketahui bahwa sintesis protein merupakan hasil akhir dari proses transkripsi dan proses translasi. Jika

36 24 senyawa antimikroba menghambat salah satu dari kedua proses tersebut maka sintesis protein akan terhambat (Best 1999). Menurut Leive (1979) dalam Rahayu (1999) penghambatan sintesis DNA dapat disebabkan oleh adanya penghambatan proses transkripsi ikatan RNA polimerase, seperti yang diakibatkan aktinomisin atau rifamisin. Kondisi ini dapat mengakibatkan terhambatnya pembentukan komponen penyusun asam nukleat, yaitu purinpirimidin nukleotida, dan polimerisasi pembentukan asam nukleat akan terganggu pula. Gangguan ini dapat menyebabkan penghambatan pada pertumbuhan sel yang dapat berlanjut pada kematian sel. Hal yang sama juga dikemukakan oleh Kim et al. (1995) bahwa suatu senyawa yang bersifat antimikroba dapat mengganggu pembentukan asam nukleat (DNA dan RNA), sehingga transfer informasi genetik akan terganggu. Hal ini disebabkan karena senyawa antimikroba akan menghambat aktivitas enzim RNA polimerase dan DNA polimerase, yang selanjutnya dapat menginaktivasi atau merusak materi genetik sehingga mengganggu proses pembelahan sel untuk pembiakan. DAFTAR PUSTAKA Alakomi HL, Skytta E, Saarela M, MattilaSandholm T Lactic acid permeabilizes Gramnegatif bacteria by disrupting the outer membrane. J. Appl. Environ. Microbiol. 66: August EG Kajian Penggunaan Lipase Amobil dari Aspergillus niger pada Pembuatan Monoasilgliserol yang Bersifat Antibakteri dari Minyak Kelapa. Thesis Program Pascasarjana I P B. Bogor. Bautista DA, Hill AR, Griffiths MW An all natural approach to preserve cottage cheese. Modern Dairy 72 (1):1213. Best GK Antibacterial Chemotheraphy. Newdrgs.html. (18 Agustus 1999). Blaszyk M, Holley RA Interaction of monolaurin, eugenol and sodium citrace on growth of common meat spoilage and pathogenic organisms. Int. J. of Food Microbiol. 39: Blom H Addition of 2,5% Lactate and 0,25% acetate control growth of Listeria monocytogenes in vacuumpacked, sensoryacceptable servelat sausage and cooked ham stored at 4 o C. Int. J. of Food Microbiol. 38:7176. Bloomfield SF Methods for Assessing Antimicrobial Activity. Di dalam: Denyer S P, Hugo WB (ed). Mechanism of action of chemical biocides their study and exploitation. Blackwell scientific Publication London.

37 25 Brannen AL Introduction to Use of Antimicrobials. Di dalam: Davidson PM, Branen AL (ed) Antimicrobial in Food. Marcel Dekker.New York. Cabo ML, Braber AF, Koenreaad PM Apparent antifungal activity of several lactic acid bacteria againts Penicillium discolor is due to acetic acid in the medium. J. of Food Protec. 65: Castilo A, Lucia LM, Mercado I, Acuff GR Inplant evaluation of a lactic acid treatment for reduction of bacteria on chilled beef carcasses. J. of Food Protec, vol 64 no 5: Chipley JR, Story LD, Todd PT Inhibition of Aspergillus growth and extracellular aflatoxin accumulation by sorbic acid and derivative of fatty acid. J. Food Safety 3: Cuesta M Requirement of autolytic activity for bacteriocininduced lysis. Appl. and Env. Microbiology p Daeschei MA Antimicrobial substances from lactic acid bacteria for use as food preservatives. Food Technology. Davidson PM, Branen AL Antimicrobials in Food. Marcel Dekker, New York. D, Aost JY Salmonella. Di dalam: Lund BM, BairdParker TC, Gould GW (ed). The Microbiological Safety and Quality of Food. Volume 3. Aspen Publisher Inc. Maryland. Duxbury DD Combination emulsifier/acidulant extend cheese seauce shelf life. Food Proc. 46(9): Fardiaz S Mikrobiologi Pangan. Depdikbud, Dirjen Dikti, PAU Pangan dan Gizi, IPB. Bogor. Frazier WC, Westhof DC Food Microbiology. McGraw Hill Publishing Iowa USA. Garburtt J Essentials of Food Microbiology. Arnold, London, Sydney, Auckland. Gourama H, Bullerman B Antimycotic and antiaflatoxigenik effect of lactic acid bacteria. J. of Food Protec. Vol. 57, No. 11: Granum PE, Baird Parker TC Bacillus species. Di dalam: Lund BM, BairdParker TC, Gould GW (ed). The Microbial Safety and Quality of Food Vol II. Maryland: Aspen. Hlm Hasenhuetti G L, Hartel RW Food Emulsifies and Their Applications. International Thomson Publishing. New York. Hofvendahl K, Barebel H Factor affecting the fermentative lactic acid production from renewable resources. Enzyme and Microbial Technology 26: Hugo WB, Russel AD Pharmaceutical Microbiology. Blackwell Scientific Publication, Oxford.

38 26 Igoe RS, Hui YH Dictionary of Food Ingredient 3 rd ed Chapman and Hall, New York. Indriyati W Kajian Aktivitas Antimikroba Campuran Mono dan Diasilgliserol Hasil Pemanfaatan Destilat Asam Lemak Minyak Kelapa. Thesis Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor, Bogor. Jay JM Modern Food Microbiology 5 th edition. Chapman and Hall, New York. Jenie BSL.1996a. Peranan bakteri asam laktat sebagai pengawet hayati makanan. J. Ilmu dan Teknol. Pangan. 1 (2): Jenie BSL, Fardiaz S, Tandriarto N. 1996b. Produksi kultur kering Lactobacillus plantarum dan aplikasinya pada pengawetan ikan lamuru. Seminar Permi, November Jenie BSL Peranan Bakteri Asam Laktat Sebagai Pangawet Pangan Non Fermentasi. Materi Pengajaran Mata Kuliah Bioteknologi Bakteri Asam Laktat. Program Studi Ilmu Pangan Program Sarjana Institut Pertanian Bogor. Jenie BSL, Atifah N, Suliantari Peningkatan keamanan dan mutu pindang ikan kembung (Rastellinger sp) dengan aplikasi kombinasi natrium asetat, bakteri asam laktat dan pengemasan Vakum. J. Ilmu dan Teknol. Pangan. XII (1): Kabara JJ MediumChain Fatty Acids and Esters. Di dalam: Davidson, P. M dana. L Branen (ed), Antimicrobial in Food 2 nd ed. Marcel Dekker, New York. Kanazawa A, Ikeda T dan Endo T A novel approach to mode of action of cationic biocides morphological effect on antibacterial activity. J Appl Bacteriol 78:5560. Kim JM, Marshall MR, Wei CI, Antibacterial activity in extracts of Camelia japonica L. petals and its application to a model food system. J. Food Protec Leverentz B, et al Biocontrol of the foodborne pathogens Listeria monocytogenes and Salmonella enterica serovar poona on freshcut apples with naturally occurring bacterial and yest antagonists. Appl. Environ. Microbiol. 72 : Lisker N, Poster N Antifungal activity of lauricidin and related compounds. J. Food Safety 4:2732. Loessner M, Susane G, Sandra S, Siegfried S A pediocin producing Lactobacillus plantarum strain inhibits Listeria monocytogenes in a multispesies cheese surface microbial ripening consortium. App and Env. Microbiol p Madigan MT, Martinko JM, Parker J Brock Biology of Microorganisms. 10 th Edition. Southern Illinois University Carbondale.

39 27 Magnusson J Antifungal activity of lactic acid bacteria, Doctor s dissertation, Departemen of Microbiology, Swedish University of Agricultural Science. Sweden. Mappiratu Penggunaan Biokatalis Dedak Kasar Dalam Biosintesis Antimikroba Monoasilgliserol Dari Minyak kelapa. Disertasi Program Pascasarjana IPB, Bogor. Mappiratu Pengaruh waktu reaksi alkoholisis terhadap rendemen dan aktivitas antimikroba etil ester minyak kelapa. Laporan Penelitian Fakultas Pertanian Universitas Tadulako, Palu. Mariani. N Aplikasi bakteri asam laktat untuk meningkatkan keamanan dan umur simpan buah melon (Cucumis melo L.) olah minimal. Skripsi Fakultas Teknologi Hasil Pertanian, IPB. Bogor. Moreau C, Moss M Mould, Toxin and Food. John Wiley and Sons. Chichester. New York. Brisbane. Ming X, Weeber GH, Ayres JW, Sandine WE Bacteriocin applied to food packaging materials to inhibit Listeria monocytogenes on meats. J. Food Sci. 62: Murray PR, Rosenthal KS, Kobayashi GS, Pfallerial MA Medical Microbiology. Third edition. Mosby. London. Nair MKM, Aboelezz H, Hoagland T, Venkitanarayanan K Antibacterial effect of monocaprylin on Escherichia coli O157:H7 in apple juice. J. of Food Protec. Vol. 69. No. 9: Oh DH, Marshall DL Enhanced inhibition of Listeria Monocytogenes by glycerol monolaurat with organic acid. J. Food Science 59 (6): Ouattara B, Ronald ES, Richard AH, Gabriel JP, Andre B Antibacterial activity of fatty acids and essential oil against six meat spoilage organisms. Int. J. of Food Microbiol 37: Pitt WM, Terence JH, Ron RH Behavior of Listeria monocytogenes in pasteurized milk during fermentation with lactic acid bacteria. J. of Food Protec. Vol. 63. No. 7: Pitt JT, Hocking AD Current knowledge if fungi and mycotoxins associated with food commodities in Southeast Asia. Canberra: The Australian Centre for International Agricultural Research. Portillo FGD Molecular and Celuler Biology of Salmonella Pathogenesis. Di dalam Cary JW, John El., deppak B. Microbial Foodborne Disease. Technomic Publishing Co., Pennsylvania. Rahayu WP Kajian aktivitas antimikroba ekstrak dan fraksi rimpang lengkuas (Alpina galanga L. Swarts) terhadap mikroba patogen dan perusak makanan. Disertasi Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Bogor. Ryu JH, Kim H, Beuchat LR Spore formation by Bacillus cereus in broth as affected by temperatur, nutrien availability, and manganese. J. of Food Protec 68:

40 28 Salminen S, von Wright A Lactic Acid Bacteria. Mercel Dekker Inc. New York. Siswohutomo G Upaya peningkatan kualitas dan daya guna limbah dedak padi melalui penerapan bioteknolgi. Laporan Hasil Penelitian Hibah Bersaing IX/2 Tahun Anggaran 2001/2002. Fakultas Pertanian Universitas Tadulako, Palu. Stratford M Traditional preservativesorganic acids. Di dalam: Robinson RK, Batt CA, Patel PD, editor. Encyclopedia of Food Microbiology. Volume 1. Academic Press, London. Stiles ME, Wilhelm H Lactic acid bacteria of food and their current taxonomy. Int. J. of Food Microbiol. 36 : 119. Sudirman I Biologi Molekular Bakteriosin. Materi kuliah bioteknologi senyawa antimikroba, Program Pascasarjana IPB. Bogor. Supardi I, Sukamto Mikrobiologi Dalam Pengolahan dan Keamanan Pangan. Alumni, Bandung. Twillman TJ, White PJ Influence of monoglycerides on the textural shelf life and dough rheologi of corn tortillas. Cereal Chem. 65 (3) : Unda JR, Molins RA, Walker HW Clostridium sporogenes and Listeria monocytogenes: Survival and inhibition in microwaveready beef roasts containing selected antimicrobials. J. Food Sci. 56: Wang LL, Yang BK, Parkin KL, Johnson EA Inhibition of Listeria monocytogenes by monoacyglycerols synthesized from coconut oil and milk fat by lipasecatalyzed glycerolysis. J. Agric. Food Chem. 41: Zamfir Purification and characterization of a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus IBB 801. J. Appl. Environ. Microbiol. 87:

41 3. METODOLOGI UMUM Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan pada bulan Juni 2004 sampai Pebruari 2006, yang dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Pangan, Laboratorium Kimia dan Biokimia Pangan South East Asian Food and Agricultural Science and Technology Center (SEAFAST CENTER) IPB, Laboratorium Mikrobiologi Pangan, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fateta IPB Bogor, Laboratorium Naval Medicine Research Unit (NAMRU ) Jakarta, Laboratorium Elektron Mikroskop Biomaterial Fakultas MIPA, Universitas Indonesia, Jakarta Bahan dan Alat Bahan Bahan dasar yang digunakan dalam penelitian mencakup monoasilgliserol (MAG) minyak kelapa yang diperoleh dari Laboratorium Agroindustri Fakultas Pertanian Universitas Tadulako, dengan karakteristik sebagai berikut: MAG 65%, DAG 27%, FFA 1,5% dan TAG 6,5%. Kultur bakteri asam yang terdiri dari Lb. plantarum, sa28k (sauerkraut), Lb. plantarum pi28a ( pikel), Lb. plantarum (kecap ikan), Lb. coryneformis, dan Lb. brevis diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Pangan Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan dan Gizi, Fateta IPB, sedangkan Lb. acidophilus diperoleh dari PAU (Pusat Antar Universitas) Pangan dan Gizi UGM. Mikroba uji yang digunakan untuk pengujian aktivitas antimikroba adalah Escherichia coli (ATCC 25922) yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Pangan SEAFAST Center IPB, sedangkan Bacillus cereus (FNCC 057), Listeria monocytogenes (FNCC 0156) dan kapang Aspergillus flavus (FNCC 6109) diperoleh dari PAU (Pusat Antar Universitas) Pangan dan Gizi UGM. Media pertumbuhan mikroba yang digunakan adalah medium PDA (Potato Dextrose Agar), NA (Nutrien Agar) dan medium PDB (Potato Dextrose Broth) (semuanya diperoleh dari Difco). Media yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri asam laktat adalah MRS (de Mann Ragosa Agar,Oxoid), MRS modifikasi

42 30 (MRS + glukosa 2%, ekstrak khamir 2%, 1% tripton dan 1% tween). Bahan bahan kimia yang digunakan adalah garam fisiologis (NaCl 0,85%), aquades, spiritus, alkohol 70% dan 98%, kristal violet dan minyak emersi serta buffer ph 4, 5, 6, dan 7. Alat Peralatan yang digunakan mencakup pompa vakum, oven analitik, vortex, autoklav, ph meter, neraca analitik, spektrofotometer, HPLC, GC, Scanning Elektron Mikroskop, sentrifus, cawan petri, coloni counter (alat hitung ), jarum ose, bunsen, pipet mikro, refrigerator, jangka sorong, inkubator, mikroskop, dan alat alat gelas. Metodologi Penelitian Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap (Gambar 3.1), meliputi (1) seleksi bakteri asam laktat (BAL) yang memiliki efek sinergis terhadap MAG minyak kelapa, penentuan komposisi metabolit BALMAG pada berbagai rasio metabolit BALMAG minyak kelapa yang memberikan penghambatan tertinggi terhadap bakteri uji, (2) penentuan aktivitas antimikroba dari metabolit BALMAG minyak kelapa, (3) penentuan mekanisme kerja senyawa antimikroba metabolit BALMAG minyak kelapa, serta (4) penentuan stabilitas senyawa antimikroba pada ph dan suhu dan lama pemanasan yang berbeda serta (5) aplikasi metabolit BALMAG terhadap sistem pangan (tahu). Seleksi BAL yang Bersifat Sinergi dengan MAG Minyak Kelapa Persiapan kultur stok BAL (Jenie et al. 2000) Isolat BAL yang terdiri dari: Lb. plantarum sa28k (isolat saur kraut), Lb. plantarum pi28a (isolat pikel), Lb. Plantarum (isolat kecap ikan), Lb. Coryneformis, Lb. acidophilus, Lb. brevis masingmasing dipindahkan ke dalam MRS Broth lalu diinkubasi selama 2 hari. Selanjutnya satu ose kultur diinokulasikan ke media agar tegak semisolid MRSA yang ditambah 1% CaCO 3 lalu diinkubasi selama 2 hari pada suhu 37 o C (kultur stok). Kultur stok disimpan dalam refrigerator bersuhu 4 o C.

43 31 Isolat BAL: 1. Lb.plantarum sa28k 2. Lb.plantarum pi28a 3. Lb.plantarum kik 4. Lb.plantarum brevis 5. Lb.acidophilus 6. Lb.coryneformis dicampur MAG minyak kelapa Seleksi BAL yang bersinergi dengan MAG Bakteri uji Listeria monocytogenes Jenis BAL terbaik Penentuan rasio BALMAG: A) 40:1;B) 20:1;C)10:1;D) 5:1;E) 5:2; F) 5:2 G)5:3;H)5:4 dan I)5:5 Bakteri uji : Listeria monocytogenes Rasio BALMAG terbaik Aktivitas antimikroba: Mikroba Uji : L.monocytogenes; E.coli; S.Typhimurium; B.cereus; Aspergillus flavus. Mekanisme kerja antibakteri: kebocoran protein, asam nukleat, kebocoran ion (Ca 2+ dan K + ) serta perubahan morfologi sel (SEM) Stabilitas BAL MAG : terhadap ph, suhu dan lama pemanasan ph: 4,5,6 dan 7 Suhu : 75,100 dan 121 o C selama 10,20 dan 30 menit. Penentuan nilai MIC : Bakteri uji : S.Typhimurium; E.coli; L.monocytogenes, B.cereus Aplikasi BALMAG pada sistem pangan (tahu): TPC Masa simpan pada suhu ruang Gambar 3.1. Bagan Alir Pelaksanaan Penelitian

44 32 Persiapan kultur mikroorganisme uji Pengujian aktivitas antimikroba dari metabolit BALMAG minyak kelapa dilakukan terhadap 4 jenis bakteri dan 1 jenis kapang. Bakteri yang digunakan adalah bakteri Gram positif Listeria monocytogenes, bakteri pembentuk spora Bacillus cereus, dan bakteri Gram negatif Salmonella Typhimurium, Eschericia coli, dan kapang perusak pangan (A. flavus). Isolat bakteri dan kapang uji dibuka dari ampul secara aseptis kemudian ditambahkan NB untuk bakteri dan PDB untuk kapang sebanyak 1 ml sampai larut. Suspensi bakteri dan kapang dipipet dan dipindahkan dalam tabung lain yang berisi 5 ml NB dan 5 ml PDB selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 o C (bakteri) dan 25 o C (kapang) sampai terlihat adanya pertumbuhan. Setelah diamati adanya pertumbuhan, kultur digores dengan menggunakan ose pada NA untuk bakteri dan PDA untuk kapang (Fardiaz 1989). Kultur disimpan dalam NA dan PDA miring pada suhu 6 o C. Satu ose dari biakan agar miring diambil dan diinokulasikan ke dalam 10 ml NB dan 10 ml PDB kemudian diinkubasi kembali selama 24 jam pada suhu 37 o C (bakteri) dan 25 o C (kapang). Kultur ini yang selanjutnya digunakan pengujian antibakteri (Fardiaz 1989). Persiapan kultur spora dilakukan sebagai berikut, kultur yang berumur 24 jam diinokulasikan sebanyak 1 ml ke dalam 10 ml NB, setelah itu diinkubasi selama 48 jam. Sebelum pengujian, dilakukan pemanasan spora pada suhu 80 o C selama 5 menit untuk menginaktivasi sel vegetatif. Konsentrasi spora yang digunakan sebanyak 10 6 CFU/ml (Fardiaz 1989). Produksi metabolit BAL Fermentasi untuk menghasilkan metabolit BAL berlangsung pada kondisi optimum, dan mengikuti cara Jenie et al. (2000) sebanyak 12 ose kultur BAL dari kultur stok masingmasing diinokulasikan ke dalam 10 ml MRS Broth, dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 2 hari (kultur induk). Sebanyak 4% (v/v) kultur induk tersebut dipindahkan ke dalam media MRS modifikasi (MRS ditambah 2% glukosa, 2% tripton dan 1% Tween 800) dan diinkubasi selama 2 hari pada suhu 37 o C (kultur kerja). Sebelum digunakan, media MRS modifikasi disterilisasi pada suhu 121 o C selama 20 menit.

45 33 Produk fermentasi dipisahkan dari massa sel dengan pemusingan yang berlangsung pada ppm selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk dipisahkan dari endapan, melalui penyaringan yang menggunakan membran milipore 0,22 µm secara aseptik sehingga diperoleh supernatan bebas sel. Supernatan yang dihasilkan juga ditentukan phnya, serta komposisi asamasam organik dalam metabolit BAL dengan HPLC. Penentuan aktivitas antibakteri campuran BALMAG dengan metode sumur (Carson dan Riley 1995) Dari seleksi BAL akan diperoleh satu jenis isolat BAL yang bersinergi terbaik dengan MAG minyak kelapa. Supernatan BAL dicampur dengan MAG minyak kelapa dengan volume yang sama (1:1). Campuran yang dihasilkan selanjutnya diuji aktivitas antibakteri menggunakan metode difusi sumur (Carson dan Riley 1995). Penentuan Rasio Metabolit BALMAG Minyak Kelapa. Untuk mengetahui metabolit BALMAG minyak kelapa yang optimum dalam menghambat pertumbuhan bakteri, dilakukan uji pada berbagai rasio metabolit BALMAG terhadap L. monocytogenes. Rasio metabolit BALMAG yang diujikan terdiri atas: 40:1 (A); 20:1 (B); 10:1 (C); 5:1 (D); 5:2 (E); 5: (F); 5:4 (G), dan 5:5 (H). Aktivitas penghambatan masingmasing terhadap bakteri uji diamati menggunakan metode difusi sumur (Carson dan Riley 1995). Rasio campuran metabolit BALMAG minyak kelapa yang memberikan daya penghambatan maksimum, akan digunakan untuk penelitian tahap selanjutnya. Aktivitas Antimikroba Rasio Metabolit BALMAG Terpilih Pengujian aktivitas antimikroba dari rasio BALMAG terbaik dari hasil penelitian sebelumnya dilakukan terhadap 4 jenis bakteri, yaitu E. coli (bakteri Gram negatif), S. Typhimurium (bakteri Gram negatif), L. monocytogenes (bakteri Gram positif), B. cereus (bakteri pembentuk spora) dan kapang A. flavus (kapang perusak pangan). Pengujian aktivitas antibakteri dengan metode sumur (Carson dan Riley, 1995), sedangkan terhadap kapang dilakukan dengan metode uji kontak melalui pengukuran berat miselia (Parish dan Davidson, 1993).

46 34 Penentuan aktivitas antibakteri dari rasio BALMAG terpilih (Carson dan Riley, 1995) Sebanyak 25 ml Nutrien agar (NA) yang mengandung bakteri uji dari akhir fase pertumbuhan yang berjumlah 10 6 CFU/ml dituang ke cawan petri, kemudian dibiarkan memadat. Setelah agak keras dibuat sumur dengan diameter 6 mm. Selanjutnya ke dalam sumur dimasukkan 60 µl campuran metabolit BALMAG minyak kelapa dan diinkubasi selama 24 jam. Aktivitas antibakteri diukur berdasarkan diameter zona bening di sekitar sumur. Pengujian aktivitas antikapang metabolit BALMAG (Parish dan Davidson, 1993) Uji aktivitas antikapang metabolit BALMAG terhadap kapang penguji A. flavus menggunakan metode kontak. Suspensi spora kapang dengan konsentrasi 10 6 CFU/ml diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam 25 ml media PDB steril secara aseptik. Metabolit BALMAG pada berbagai konsentrasi (0, 5, 10, 15 dan 20%) dimasukkan ke dalam media, dan diinkubasi pada inkubator bergoyang agitasi 100 rpm pada suhu ruang selama 48 jam. Massa sel kapang yang tumbuh setelah 48 jam dipisahkan dengan penyaringan vakum menggunakan corong Buchner, kemudian dikeringkan dalam oven suhu 100 o C sampai beratnya tetap. Sebagai kontrol adalah perlakuan tanpa penambahan metabolit BALMAG minyak kelapa. Jumlah reduksi masa sel kapang dihitung dengan rumus sebagai berikut: Reduksi masa sel = Masa sel kontrol Masa sel metabolit BALMAG Masa sel kontrol Penentuan nilai MIC Penentuan nilai MIC dimaksudkan untuk mengetahui konsentrasi terendah antimikroba metabolit BALMAG yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji. Penentuan nilai MIC dilakukan menggunakan metode Bloomfield (1991) dengan memplotkan antara ln konsentrasi antimikroba pada sumbu X dengan nilai kuadrat zona penghambatan (Z 2 ) pada sumbu Y.

47 35 Perpotongan dari regresi linier Y = a + bx dengan sumbu X merupakan nilai Mt. Nilai MIC adalah 0,25 x Mt. Hasil perhitungan tersebut dikonfirmasi dengan metode Kubo et al. (1995) pada selang waktu kontak dan konsentrasi yang beragam. Metabolit BALMAG dicampur dengan kultur bakteri uji, yaitu L. monocytogenes, B. cereus, E. coli dan S. Typhimurium dalam inkubator goyang dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 37 o C selama 24 jam. Selanjutnya setelah inkubasi, jumlah mikroba dihitung dengan metode pemupukan (plating). Mekanisme Kerja Antibakteri Metabolit BALMAG Mekanisme kerja antibakteri dari campuran BALMAG terbaik dilakukan terhadap kebocoran protein dan asam nukleat, kebocoran ionion (Ca 2+, K + ) serta perubahan morfologi dan struktur sel L. monocytogenes, B. cereus dan S. Typhimurium. Analisis kebocoran sel (Bunduki et al. 1995) Analisis kebocoran sel dilakukan untuk mengukur derajat kerusakan dinding dan membran sel bakteri uji setelah dipapar dengan campuran BALMAG. Kebocoran sel diamati pada konsentrasi 0, 1 dan 2 MIC, dengan bakteri uji L. monocytogenes, S. Typhimurium dan B. cereus. Kebocoran diamati dalam bentuk kebocoran protein dan asam nukleat menggunakan alat Double Beam Spektrophotometer (Model U2000 Hitachi Instruments, Inc, Westone, MA) masingmasing pada panjang gelombang 280 nm dan 260 nm. Panjang gelombang 280 nm digunakan untuk mengukur kadar nitrogen dari protein sel, sedangkan panjang gelombang 260 nm untuk mengukur kadar nitrogen asam nukleat. Suspensi bakteri dari kultur murni yang telah ditumbuhkan selama 24 jam di dalam media NB, diambil 10 ml dan disentrifus dengan kecepatan putar 3500 rpm selama 20 menit. Filtrat dibuang dan endapan sel dicuci dengan buffer fosfat dalam tabung reaksi sebanyak 2 kali. Setelah itu ditambahkan metabolit BAL MAG pada tingkat 0,1 dan 2 MIC, dishaker selama 24 jam pada suhu 37 o C untuk S. Typhimurium dan B. cereus dan pada suhu ruang untuk L. monocytogenes. Suspensi disentrifus dengan kecepatan 3500 rpm selama 20 menit, kemudian disaring dan supernatan yang diperoleh diukur absorbansinya pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.

48 36 Kebocoran ionion diukur dalam bentuk ion Ca 2+ dan K + yang dilepaskan oleh sel bakteri akibat pemberian metabolit BALMAG minyak kelapa. Pengukuran kebocoran ion dilakukan pada berbagai dosis MIC. Kebocoran ionion K + dan Ca 2+ dideteksi dengan menggunakan AAS (Atomic Absorption Spectrophotometer). Pelet sel hasil kontak dengan metabolit BALMAG minyak kelapa dicuci dengan air bebas ion steril sebanyak 3 kali. Pelet yang telah bersih ditimbang, diabukan dengan cara pengabuan basah dengan menggunakan metode Park (1996). Perubahan morfologi sel dengan SEM (JEOL 1995 ; Noer 2001) Tujuan penelitian tahapan ini adalah untuk mengetahui perubahan morfologi dan struktur sel bakteri L. monocytogenes dan S. Thypymurium. Perubahan perubahan yang diamati diantaranya perubahan penampakan sel secara umum, ketebalan dinding sel, ukuran sel dan lainnya yang dapat diamati menggunakan alat Scanning Electron Microscopy (SEM). Metode SEM dilakukan dengan cara suspensi sel bakteri uji yang telah diberi perlakuan 0 MIC, 1 MIC dan 2 MIC diinkubasi selama 24 jam pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 37 o C untuk S. typhimurium dan suhu ruang untuk L. monocytogenes. Setelah itu disentrifus pada 3500 rpm selama 15 menit, supernatan dibuang dan diambil peletnya untuk kemudian dicuci dengan buffer fosfat sebanyak 2 kali. Pelet selanjutnya difiksasi dengan glutaraldehid 2,5% dalam (0,1 M buffer sodium cacodilat ph 7.2) dibiarkan selama 1,5 jam, dicuci dua kali dengan buffer cacodilat 0,05M ph 7,2 selama 20 menit untuk masingmasing perlakuan. Selanjutnya difiksasi dengan osmium tetraoxide 1% dalam buffer cacodilat 0,05%, ph 7,2 selama 12 menit lalu dicuci dengan akuabides (DDH 2 O) 3 kali masingmasing selama 2 menit, dikeringkan dengan etanol pada berbagai konsentrasi yang dimulai dari konsentrasi 25, 50, 75 kemudian 100% sebanyak tiga kali masingmasing selama 10 menit. Spesimen diambil dan dilewatkan pada membran 0,2 µm untuk selanjutnya direkatkan pada stub alumunium dan dilapisi dengan emas melalui proses vakum (67 Pa) selama 20 menit. Sampel diamati di bawah Scanning Electron Microscopy tipe JEOL 5310.

49 37 Penentuan Stabilitas Aktivitas Metabolit BALMAG serta Aplikasi ke Sistem Pangan (Carson dan Riley, 1995) Pada tahapan ini dilakukan penentuan stabilitas aktivitas antimikroba metabolit BALMAG terhadap berbagai ph medium, yaitu pada ph 4, 5, 6,dan 7 dengan menggunakan HCl 0,01 N atau NaOH 0,1 N dan suhu 75, 100 dan 121 o C masingmasing selama 10, 20 dan 30 menit. Selanjutnya stabilitas antibakteri ditetapkan berdasarkan zona penghambatan yang dihasilkan terhadap L. monocytogenes, B. cereus dan S. Typhimurium. Pengujian terhadap sistem pangan (tahu) yang direndam campuran metabolit BALMAG minyak kelapa pada konsentrasi 2 dan 4 MIC yang disimpan pada suhu ruang selama 6 hari. Tahu (merek Yunyi) direndam sampai seluruh permukaan tahu terendam dalam wadah berisi larutan yang diberi campuran metabolit BALMAG dengan konsentrasi 2 (2,4%) dan 4 MIC (4,8%). Selanjutnya dilakukan pengujian organoleptik dengan menggunakan panelis semi terlatih sebanyak 20 orang panelis terhadap warna, bau dan tekstur tahu dengan ukuran ( 6 cm x 5 cm x 2,1 cm) ) selama 6 hari penyimpanan pada suhu ruang. Pengujian terhadap total mikroba dengan metode Fardiaz (1989) diambil sebanyak 10 g tahu yang telah direndam dimasukkan ke dalam plastik steril yang telah berisi 90 ml larutan pengencer steril. Sampel tersebut kemudian dihancurkan dengan menggunakan alat stomacher selama 1 menit, dan dihasilkan sampel tahu dengan pengenceran 1:10. Campuran dikocok diambil 1 ml kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi 9 ml larutan pengencer steril (10 2 ) dengan cara yang sama diperoleh pengenceran 10 3 dan seterusnya. Dari tiaptiap pengenceran, dipipet secara aseptis 1 ml suspensi sampel dan dimasukkan ke dalam cawan petri steril, lalu dituang 1520 ml medium PCA (Plate Count Agar) steril dibuat secara duplo. Setelah medium membeku, cawan petri diinkubasi dengan posisi terbalik pada inkubator suhu 37 o C. dengan : Koloni per ml/g Perhitungan total mikroba menggunakan metode SPC = Jumlah koloni x 1 Faktor pengenceran

50 38 Metode Analisis Pengukuran ph (Apriyantono et al. 1989) Sampel diambil sekitar 5 ml kemudian diukur ph nya. Alat ph meter yang digunakan terlebih dahulu dinyalakan selama 1530 menit. Elektroda kemudian dibilas dengan air destilata dan dikeringkan dengan kertas tissue. Setelah itu elektroda dicelupkan ke dalam media sampel, pengukuran ph diset. Elektroda dibiarkan tercelup beberapa saat sampai diperoleh pembacaan yang stabil. Sebelum pengukuran sampel, ph meter distandarisasi dengan buffer fosfat ph 4, 5, 6, dan 7. Langkahlangkah yang harus dilakukan dalam standarisasi phmeter sama dengan cara pengukuran sampel, hanya saja setelah pembacaan ph yang stabil, tombol dikalibrasi disesuaikan sampai diperoleh angka ph yang sesuai dengan ph buffer. Analisis Komposisi Asam Lemak monoasilgliserol (AOCS, 1995) Monoasilgliserol yang akan dianalisis asam lemaknya ditimbang sebanyak gram, kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup, selanjutnya ditambah kan 1,5 ml NaOH metanol 0,5 N. Campuran yang ada dalam tabung dialiri gas nitrogen dan ditutup rapat, kemudian divorteks. Campuran reaksi selanjutnya dipanaskan dalam penangas air yang mendidih selama 5 menit, diikuti dengan pendinginan sampai suhu campuran berada pada kisaran suhu 30 dan 40 o C. Pereaksi BF3metanol 14 % (b/v) ditambahkan ke dalam campuran, dialiri gas nitrogen dan ditutup rapat, kemudian dipanaskan kembali dalam penangas air mendidih selama 30 menit. Campuran didinginkan, kemudian ditambahkan 1 ml pelarut heksana, dialiri gas nitrogen, ditutup rapat dan divorteks selama 30 menit. Campuran yang dihasilkan selanjutnya ditambahkan 5 ml larutan NaCl jenuh, dialiri gas nitrogen, ditutup rapat dan divorteks, kemudian didiamkan sampai terjadi dua lapisan. Lapisan atas (lapisan heksana yang mengandung metil ester asam lemak) dipindahkan ke tabung vial yang berisi natrium sulfat anhidrat, selanjutnya dipekatkan dengan gas nitrogen sampai diperoleh volume sekitar 1 ml.

51 39 Metil ester asam lemak yang telah dibebaskan dari kandungan air dengan natrium sulfat anhidrat dan telah dipekatkan dengan gas nitrogen disuntikkan ke alat Kromatografi Gas GC9 AM sebanyak 1 µl. Alat Kromatografi Gas dilengkapi dengan detektor FID, integrator Chromatopac CR6 dan kolom kapiler DB23 (30 m X 0,25 mm i.d; J & W Scientific, Folsom, CA). Suhu injektor diatur 250 o C dan suhu detektornya 260 o C. Suhu awal kolom 140 0C yang dipertahankan selema 6 menit dengan laju kenaikan suhu 30 o C/menit. Suhu akhir kolom diatur 230 o C dan dipertahankan selama 25 menit. Gas pembawa yang digunakan adalah gas helium dengan tekanan 1 kg/cm 2 dan detektor FID. Tekanan gas hidrogen dan tekanan udara diatur sampai 0,5 kg/cm 2. Kromatogram yang diperoleh digunakan untuk menentukan persentase komposisi asam lemak menggunakan persamaan : Luas area peak asam lemak Persen asam lemak = x 100% Luas total area peak asam lemak Penentuan Asam Organik dengan HPLC HPLC yang digunakan adalah HPLC dengan kolom ion ekslusi cartridge H + tipe Rader Organik acid berukuran 300 X 7,8 mm, temperatur kolom 22 o C, fase gerak H 2 SO 4 0,01 N laju elusi 0,6 ml/menit, detector model UVVis panjang gelombang 210 nm). Standar asam sebanyak 20 µl yang telah diencerkan diinjeksikan ke dalam alat kromatografi terlebih dahulu sebelum menginjeksikan sample. Sampel ditambah pelarut sampai tanda tera (labu ukur 100 ml), lalu disaring dengan milipore 0,45 µm dan diinjeksikan ke HPLC. Penginjeksian standar dimaksudkan untuk mengetahui waktu retensi dari asamasam yang dianalisa. Adapun perhitungan kadar asamasam organik dalam sampel adalah sebagai berikut: Luas area peak sample A (%) = x konsentrasi standar x fp Luas area peak standar asam A = rendemen asam organik dalam sample (%) fp = faktor pengenceran

52 40 Analisis Data Analisis data hasil penelitian dilakukan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dilanjutkan dengan uji Duncan dengan program Statistik Versi 5. Data lain seperti kebocoran protein, asam nukleat dan SEM diolah secara tabulasi dalam bentuk tabel, grafik atau gambar (Santoso, 2002). DAFTAR PUSTAKA Apriyantono A, Fardiaz D, Puspitasari NL, Yasni S, Budiyanto S Petunjuk Laboratorium Analisa Pangan. PAU Pangan dan Gizi, IPB, Bogor. Bunduki MMC, Flanders KJ, Donnelly CW Metabolic and structural site of damage in heat and sanitizerinjured population of Listeria monocytogenes. J. Food Protect. 58(4): 410. Carson CF, Riley TV Antimicrobial activity of the major components of the esensial oil of Melaleuca alternifolia. J. Appl. Bacteriol. 78: Fardiaz S Mikrobiologi Pangan. Depdikbud, Dirjen Dikti, PAU Pangan dan Gizi, IPB. Bogor. Jenie BSL, Suliantari, Andjaya N Pengembangan produk makanan tradisional rendah garam berbasis ikan melalui aplikasi bakteri asam laktat penghasil bakteriosin. Laporan Hibah Bersaing Tahun 1999/2000. JEOL, Specimen Preparation Methods for Scanning Electron Microscope. JEOL Application Note. Tokyo, 23p. Kim JG, Lee YW, Kim PG, Roh WS, Shintani H Reduction of aflatoxin by Korean Soybean paste and its effect on cytotoxicity and reproductive toxitypart I. Inhibition of growth and aflatoxin production of Aspergillus parasiticus by Korean soybean paste (doenjang) and identification of active component. J. Food Protect. 63: Kubo I, Murpi H, Himejima M Antimicrobial activity of green tea flavo component and their combination effects. J. Agric. Food Chem. 40: Noor RR Scanning Electron Microscope (SEM). Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Ternak. Fakultas Peternakan IPB. Bogor. Parish ME, Davidson PM Method for evaluation. Di dalam: Davidson PM, Branen AL (ed). Antimicrobial in Food 2 nd Ed. Marcell Dekker, New York.

53 41 Park YW Determination of moisture and ash contents of food. Di dalam Leo M.L. Nollet (ed). Handbook of Food Analysis. Volume 1. Marcel Dekker, Inc, Newyork. Basel. Hongkong. Santoso S Mengolah Data Statistik Secara Profesional. Penerbit PT Elex Media Komputindo Kelompok Gramedia. Jakarta. Widyastuty A Aplikasi Bakteri Asam Laktat untuk Meningkatkan Keamanan dan Umur Simpan Buah Nenas (Ananas comosus (L) Merr) Olah Minimal. Skripsi Fakultas Teknologi Hasil Pertanian, IPB. Bogor.

54 4. EFEK SINERGI ANTIBAKTERI BEBERAPA CAMPURAN METABOLIT BAL DENGAN MAG MINYAK KELAPA DALAM MENGHAMBAT PERTUMBUHAN Listeria monocytogenes ABSTRAK Enam jenis isolat bakteri asam laktat indigenus yang berasal dari berbagai jenis bahan pangan tradisional yaitu Lb. plantarum pi28 a (pikel), Lb. plantrum sa28 k (sauerkraut), Lb. plantarum kik (kecap ikan), Lb. brevis AE 1.6, Lb. acidophilus dan Lb. coryneformis (tempoyak) ditumbuhkan dalam MRS Broth, dan dicampurkan dengan MAG minyak kelapa dengan perbandingan 1:1. Aktivitas antibakteri campuran metabolit BALMAG minyak kelapa diuji terhadap L. monocytogenes (FNCC 0156), dengan menggunakan metode difusi sumur. Penentuan rasio yang memberikan aktivitas penghambatan maksimum dari campuran metabolit BALMAG minyak kelapa dilakukan dengan menerapkan delapan jenis rasio metabolit BALMAG minyak kelapa, yakni 40:1 (A); 20:1 (B); 10:1 (C); 5:1 (D); 5:2 (E); 5:3 (F); 5:4 (F) dan 5:5 (G). Hasil penelitian menunjukkan bahwa keenam jenis isolat BAL bersinergi dengan MAG minyak kelapa. Isolat yang paling kuat efek sinerginya adalah isolat Lb. plantarum kik. Hal ini diperlihatkan dengan tingginya zona hambat bakteri uji tersebut (31,12 mm), bila dibandingkan dengan kelima isolat lainnya. Kisaran diameter penghambatan masingmasing adalah Lb. acidophilus (26,09 mm), Lb. brevis AE 1.6 (25,84 mm), Lb. plantarum sa28 k (24,58 mm), Lb. plantarum pi28a (23,89 mm), dan Lb. coryneformis (23,20 mm). Aplikasi campuran metabolit BALMAG minyak kelapa yang terbaik diperoleh pada kisaran rasio 5:3. PENDAHULUAN Bakteri asam laktat merupakan kelompok bakteri yang mampu menghasilkan asam laktat sebagai produk utama disamping produk lain pada metabolisme karbohidrat (Frazier dan Westhof 1988). Bakteri asam laktat yang termasuk dalam kelompok bakteri gram positif, pada umumnya tidak membentuk spora, berbentuk batang dan tidak menghasilkan katalase (Salminen dan Wright 2004). Sebagai sumber energi utama adalah karbohidrat yang dapat difermentasi, maka heksosa didegradasi terutama menjadi asam laktat (homofermentatif) atau asam laktat dan produk lain seperti asam asetat, etanol, karbon dioksida, asam format dan asam suksinat (heterofermentatif). Selain menghasilkan asam organik, BAL juga telah dikenal mampu menghasilkan berbagai senyawa antibakteri. Peranan BAL dalam mengawetkan bahan pangan telah banyak diteliti diantaranya oleh Jenie et al. (1999, 2000), Mariani (2002) dan Wydyastuti (2002) terutama terhadap produk perikanan dan buah segar olah minimal. Penggunaan metabolit BAL terhadap

55 ikan peda kering mampu menekan pertumbuhan bakteri patogen (S. aureus ) sebesar 2 unit log, sedangkan terhadap P. fluorescens sebesar 4 unit log (Jenie et al. 2000). Demikian pula terhadap buah segar seperti Mariani (2002) pada buah melon, Rahmadi (2002) pada buah apel manalagi yang mampu menekan pertumbuhan bakteri S. aureus, E. coli dan L. monocytogenes sebesar 0,52 satuan log. Smith et al. (2005) melaporkan kemampuan dari bakteri asam laktat dalam mereduksi E. coli O157:H7 sebesar 1,5 log cycle dan Salmonella 3 log cycle pada daging sapi selama penyimpanan 12 hari pada suhu penyimpanan 5 o C. Meskipun BAL memiliki aktivitas antibakteri yang tinggi dalam menghambat pertumbuhan bakteri namun penggunaan asamasam organik dari BAL pada sistem pangan membatasi aplikasinya karena rasanya yang asam. Untuk mengatasi hal tersebut, maka dibutuhkan suatu senyawa yang tidak hanya bersifat sebagai antibakteri tetapi dapat pula mereduksi rasa asam dari metabolit BAL. Sebagai contoh, penggabungan metabolit BAL dengan monoasilgliserol (MAG) minyak kelapa diharapkan dapat mereduksi rasa asam dan dapat meningkatkan penghambatannya terhadap mikroba patogen, serta aplikasinya pada pengolahan pangan menjadi lebih luas. MAG minyak kelapa yang pada awalnya hanya dikenal sebagai emulsifier ternyata juga memiliki sifat antimikroba (Wang et al. 1993; August 2000; dan Indryati 2004). Mappiratu 2002) menemukan adanya efek antimikroba dari MAG minyak kelapa terhadap berbagai jenis bakteri patogen diantaranya Vibrio cholerae, B. cereus, dan L. monocytogenes. Beberapa peneliti telah melaporkan bahwa aktivitas antimikroba dari campuran asam laktat dan monolaurin lebih tinggi dibandingkan dengan penggunaannya secara tunggal. Oh dan Marshall (1994) menemukan adanya efek sinergi dari monolaurin dengan asamasam organik seperti asam laktat, asam asetat dan asam benzoat dalam menghambat pertumbuhan L. monocytogenes. Penggunaan asam laktat dan monolaurin menyebabkan penurunan jumlah sel L. monocytogenes sebesar 2 unit log dari campuran monolaurin 0,72 mm dan asam laktat 1,44 mm. Apabila monolaurin digunakan secara tunggal pada konsentrasi 0,72 mm hanya mampu mereduksi sebesar 0,5 unit log, sedangkan penggunaan asam laktat pada konsentrasi 1,44 mm hanya mampu mereduksi L. monocytogenes sebesar 1 unit log pada produk udang selama penyimpanan 20 hari pada penyimpanan suhu refrigerator 4 o C. Penggunaan kombinasi asam laktat dan monolaurin

56 sangat potensial dalam mengontrol Clostridia dan L. monocytogenes pada produk daging sapi dalam microwave (Unda et al. 1994). Dalam penelitian ini digunakan sebagai mikroba uji L. monocytogenes berdasarkan laporan beberapa hasil penelitian diantaranya Blaszyik et al. (1998), Oh dan Marshall (1994) serta Mappiratu et al. (2002) menggunakan L. monocytogenes sebagai bakteri uji dalam penggunaan monolaurin dan MAG minyak kelapa maupun gabungan dari monolaurin dan asam organik. Selain itu L. monocytogenes juga sering ditemukan pada produk pangan meskipun disimpan pada suhu rendah. Penelitian ini bertujuan untuk melihat efek sinergi dari beberapa jenis metabolit BAL dengan MAG minyak kelapa dalam menghambat L. monoasilgliserol, serta menentukan rasio dari metabolit BAL terpilih dengan MAG minyak kelapa yang menghasilkan diameter penghambatan maksimum terhadap pertumbuhan L. monocytogenes. METODOLOGI Bahan dan Alat Isolat bakteri asam laktat yang digunakan adalah Lb. plantarum pi28a (pikel), Lb. plantarum sa28 k (sauerkraut), Lb. plantarum kik (kecap ikan), dan Lb. Coryneformis dan Lb. Brevis 1,6 yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Pangan Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan IPB sedangkan Lb. acidophilus diperoleh dari Pusat Antar Universitas (PAU) UGM. MAG minyak kelapa diperoleh dari Laboratorium Agroindustri Fakultas Pertanian Universitas Tadulako Palu (Sula wesi Tengah). Bakteri uji yang digunakan adalah L. monocytogenes yang diperoleh dari Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi UGM. Semua media mikrobiologi diperoleh dari Oxoid Ltd, sedangkan peralatan berupa inkubator, sentrifus, oven, dan alatalat gelas diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia Pangan IPB. Persiapan kultur bakteri uji (L.monocytogenes) Sebanyak satu ose bakteri dari stok agar miring diinokulasikan ke dalam medium nutrien broth (NB) dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Selanjutnya sebanyak 1 ml kultur bakteri ditambahkan ke dalam 9 ml media NB dan diinkubasikan selama 24

57 jam pada suhu 37 o C. Kultur bakteri uji sebanyak 10 6 CFU/ml digunakan dalam uji antimikroba BAL, MAG minyak kelapa maupun campuran BALMAG minyak kelapa. Produksi metabolit bakteri asam laktat Produksi metabolit BAL dipersiapkan secara bertahap dengan mengikuti metode Jenie et al. (2000) sebagai berikut: Kultur BAL sebanyak 1 ml diambil dari masingmasing kultur stok dan diinokulasikan ke dalam 9 ml MRS Broth, kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 2 hari. Sebanyak 4% kultur BAL tersebut diinokulasikan ke dalam media steril MRSB yang dimodifikasi dengan 2% glukosa, 2% ekstrak khamir, 2% tripton dan 1% tween 80, selanjutnya diinkubasi selama 2 hari pada suhu 37 o C. Produk fermentasi dipisahkan dari massa sel dengan cara sentrifus pada rpm selama 15 menit. Supernatan yang terbentuk dipisahkan dari endapan dengan menyaring menggunakan kertas saring whatman ukuran 0,22 µm, kemudian diambil untuk dicampur dengan MAG minyak kelapa dengan perbandingan 1 : 1 atas dasar v/v. Penentuan konsentrasi MAG minyak kelapa dalam larutan alkohol Agar MAG minyak kelapa dapat bercampur dengan metabolit BAL, maka sebelumnya MAG minyak kelapa dilarutkan dengan alkohol 98%. Konsentrasi yang digunakan adalah konsentrasi MAG minyak kelapa yang memberikan aktivitas optimal. Alkohol 98% digunakan karena disamping berperan sebagai pelarut yang tidak memilki aktivitas antimikroba juga cukup aman diaplikasikan pada bahan pangan dan tidak meninggalkan residu. Seleksi Kultur BAL yang Bersinergi dengan MAG Minyak Kelapa Enam isolat BAL yang telah disebutkan sebelumnya diseleksi kemampuannya untuk bersinergi dengan MAG minyak kelapa. Produk metabolit BAL yang telah dipersiapkan sebelumnya dicampur dengan MAG minyak kelapa dengan perbandingan 1 : 1 (v/v). Selanjutnya campuran yang dihasilkan diuji aktivitas antibakterinya menggunakan metode difusi sumur (Carson dan Riley 1995). Supernatan yang dihasilkan juga diukur ph, konsentrasi asam laktat, dan komposisi asamasam organik

58 menggunakan HPLC, serta bakteriosin menggunakan metode difusi sumur (Carson dan Riley 1995), dan hidrogen peroksida (kualitatif). Penentuan rasio metabolit BALMAG minyak kelapa Untuk mengetahui rasio campuran metabolit BALMAG minyak kelapa yang memberikan penghambatan tinggi terhadap L. monocytogenes, diterapkan berbagai rasio campuran metabolit BALMAG yaitu: 40:1 (A); 20:1 (B); 10:1 (C); 5:1 (D); 5:2 (E). Metabolit BAL yang digunakan adalah metabolit BAL terseleksi hasil penelitian sebelumnya. Aktivitas penghambatannya terhadap bakteri uji diamati menggunakan metode difusi sumur (Carson dan Riley 1995). Rasio campuran metabolit BALMAG minyak kelapa yang memberikan aktivitas penghambatan tertinggi, digunakan untuk penelitian tahap selanjutnya. HASIL DAN PEMBAHASAN Penentuan konsentrasi MAG dalam larutan alkohol Tahap ini bertujuan untuk menentukan konsentrasi MAG dalam alkohol sebagai pelarut yang memberikan aktivitas tinggi dalam menghambat pertumbuhan L.monocytogenes dan untuk mendapatkan konsentrasi MAG terpilih untuk digunakan pada campuran metabolit BALMAG. Untuk pengujian selanjutnya. Konsentrasi MAG yang akan digunakan adalah konsentrasi terendah dengan penghambatan optimal berdasarkan analisis statistik. Berdasarkan hasil uji statistik pada konsentrasi 070 % MAG dalam alkohol memberikan pengaruh yang sangat nyata (P<0,01) (Lampiran 22). Uji Duncan menunjukkan penghambatan MAG pada konsentrasi % dalam alkohol terhadap L.monocytogenes tidak berbeda nyata. Oleh sebab itu konsentrasi MAG 30% dalam alkohol dipilih untuk digunakan dalam pengujian selanjutnya (lampiran 1).

59 16 14 Diameter penghambatan (mm) Konsentrasi MAG dalam alkohol Gambar 4.1. Diameter penghambatan MAG minyak kelapa dalam berbagai konsentrasi alkohol Berdasarkan pengujian larutan MAG dalam alkohol pada berbagai konsentrasi 0 70% diperoleh bahwa MAG dalam pelarut alkohol menunjukkan pola yang relatif sama, dimana makin tinggi konsentasi MAG dalam alkohol semakin tinggi pula aktivitas penghambatannya. Pada gambar 4.1 terlihat bahwa konsentrasi 60 % MAG dalam alkohol menunjukkan aktivitas penghambatan yang optimum sebab jika konsentrasi ditingkatkan menunjukkan peningkatan yang lebih kecil dibanding dengan peningkatan penghambatan pada konsentrasi 10 60%. Menurut Fardiaz et al. (1989) efektifitas dari senyawa antimikroba dipengaruhi oleh konsentrasi dimana semakin besar konsentrasi antimikroba semakin besar pula jumlah senyawa antimikroba yang berdifusi ke dalam medium agar sehingga diharapkan diameter penghambatannya juga makin meningkat. Namun demikian aktivitas antimikroba tergantung pada laju difusi dari senyawa antimikroba. Penentuan isolat BAL yang bersinergi kuat dengan MAG minyak kelapa Tahapan ini bertujuan untuk menentukan satu jenis isolat bakteri asam laktat yang unggul dalam memberikan efek sinergi tinggi terhadap MAG minyak kelapa yang ditandai dengan aktivitas penghambatan tertinggi. Pengaruh penggunaan campuran kultur bakteri asam laktat dan monoasilgliserol minyak kelapa terhadap pertumbuhan L.

60 monocytogenes dibandingkan dengan penggunaan masingmasing kultur bakteri asam laktat maupun monoasilgliserol secara tunggal dapat dilihat pada Gambar 4.2 dan 4.3. Aktivitas penghambatan pada masingmasing isolat BAL secara tunggal diperoleh dari diameter terkecil ke yang terbesar diperoleh: Lb. plantarum pi28a sebesar 9,18 mm; Lb. plantarum sa 28k sebesar 9,24 mm; Lb. coryneformis sebesar 10,05; Lb.plantarum kik sebesar 12,98 mm; Lb. brevis sebesar 13,12 mm dan Lb.acidophilus sebesar 13,45 mm sedangkan MAG diperoleh sebesar 11,94 mm. Bila penghambatan dari masingmasing isolat BAL dijumlah dengan penghambatan dari MAG minyak kelapa diperoleh hasil masingmasing untuk Lb. plantarum pi28a + MAG (21,12 mm); Lb. plantarum sa 28k+MAG (21,18 mm); Lb. coryneformis +MAG (21,99 mm); Lb.plantarum kik + MAG (24,92 mm); Lb. brevis + MAG (25,06 mm); dan Lb.acidophilus + MAG (25,39 mm). Namun setelah dicampur dengan MAG diperoleh data sebagai berikut : Lb. plantarum pi28a + MAG (23,89 mm); Lb. plantarum sa 28k + MAG (24,58 mm); Lb. coryneformis + MAG (23,20 mm); Lb.plantarum kik + MAG (31,12 mm); Lb. brevis + MAG (25,84 mm); dan Lb.acidophilus + MAG (26,09 mm). Data tersebut di atas menunjukkan aktivitas penghambatan kultur BAL dan MAG lebih efektif dalam bentuk campuran dibandingkan dalam bentuk tunggal atau dapat dikatakan bahwa terjadi efek sinergi antara metabolit BAL dengan MAG minyak kelapa. Hal ini sejalan dengan pernyataan Paster et al.( 2002) bahwa efek sinergi dari suatu senyawa antimikroba adalah campuran dari dua jenis atau lebih senyawa yang akan memberikan aktivitas penghambatan yang lebih besar dibanding dengan jumlah kumulatif dari campuran kedua antimikroba tersebut. Secara berurutan efek sinergi metabolit BALMAG minyak kelapa terhadap bakteri uji dari diameter terkecil ke terbesar adalah MAGsa28k, MAGpi28a dan MAGcoryneformis. MAGbrevis, MAGacidophilus, dan MAGkik. Efek sinergi ini mampu meningkatkan aktivitas antibakteri dengan diameter penghambatan dari 9,1913,45 mm menjadi 23,231,12 mm atau 23 kali lipat lebih besar dari pada penggunaan tunggal (Gambar 4.4, serta Lampiran 2 dan 3).

61 Gambar 4.2. Diameter penghambatan penggunaan tunggal metabolit (1) coryneformis; (2) sa28k; (3) MAG; (4) pi28a; (5) kik; (6)acidophilus; (7) Brevis terhadap L. Monocytogenes Gambar 4.3. Diameter penghambatan penggunaan campuran metabolit (1) kikmag; (2) pi 28a + MAG; (3) coryneformis + MAG (4) acidophilus +MAG; (5) sa28k +MAG ; (6) brevis + MAG terhadap L.monocytogenes

62 35 MAG + kik Diameter penghambatan (mm) MAG + acidophilus MAG + brevis acidophilus brevis MAG MAG MAG kik MAG + pi28a MAG + sa28k MAG + coryneformis MAG pi28a MAG sa28k MAG coryneformis 0 Gambar 4.4. Aktivitas antibakteri MAG minyak kelapa dan metabolit BAL serta campuran metabolit BALMAG minyak kelapa terhadap L. monocytogenes. Berdasarkan hasil analisis statistik aktivitas antibakteri dari semua isolat BAL berpengaruh sangat nyata (P<0,01) terhadap bakteri uji. Uji Duncan menunjukkan aktivitas antibakteri dari metabolit Lb. brevis AE 1,6, Lb. acidophilus dan Lb. plantarum kik tidak menunjukkan perbedaan nyata dalam menghambat bakteri uji. Demikian pula antara Lb. plantarum pi28 dengan Lb. plantarum sa 28k tidak menunjukan perbedaan nyata, namun jik a dibandingkan dengan penghambatan dari Lb. plantarum coryneformis menunjukkan perbedaan yang nyata, dimana Lb. plantarum coryneformis memiliki penghambatan yang lebih besar dibanding dengan Lb. plantarum pi28 dan Lb. plantarum sa 28k. Pada Gambar 4.4 terlihat bahwa Lb. brevis AE 1.6 dan Lb. acidophilus memiliki daya hambat yang lebih besar dibanding dengan keempat BAL lainnya. Perbedaan ini diduga terkait dengan produk metabolit dari masingmasing isolat BAL yang dihasilkan selama metabolisme glukosa. Lb. brevis AE 1.6 dan Lb. acidophilus tergolong bakteri asam laktat yang bersifat obligat heterofermentatif (Salminen dan von Wright 2004), sedangkan Lb. plantarum bersifat homofermentatif. Produk metabolit dari BAL yang bersifat heterofermentatif adalah asam asetat, asam laktat, bakteriosin, CO 2 dan etanol. Bakteri homofermentatif mampu mengubah 95% glukosa atau heksosa lain menjadi asam laktat dan sejumlah kecil asamasam volatil. Jay (1996) menyatakan bahwa BAL homofermentatif memproduksi asam laktat sebagai produk utama atau dalam jumlah

63 yang besar pada produk hasil fermentasi glukosa, sedangkan BAL heterofermentatif selain memproduksi laktat, juga menghasilkan CO2, bakteriosin dan etanol dari metabolisme heksosa. Penghambatan yang tinggi dari kedua kultur BAL, yakni Lb. brevis AE 1.6 dan Lb. acidophilus pada penggunaan tunggal dibanding dengan keempat kultur BAL lainnya adalah selain karena kandungan asam organiknya, juga karena adanya komponen lain seperti bakteriosin yang dihasilkan oleh kedua BAL tersebut. Hasil pengamatan (Lampiran 3) menunjukkan bahwa campuran Lb. plantarum kik dan MAG minyak kelapa memiliki efek penghambatan terbesar bila dibanding dengan kelima (5) isolat BAL lainnya. Meskipun diameter penghambatan terbesar diperoleh pada Lb. acidophilus dan Lb. brevis AE 1.6 pada penggunaan tunggal, namun jika penggunaannya dicampur dengan MAG minyak kelapa aktivitas penghambatannya lebih rendah bila dibanding dengan Lb. plantarum kik, akan tetapi masih lebih tinggi dibandingkan dengan ketiga (3) isolat lainnya. Tingginya efek sinergi yang dihasilkan pada isolat bakteri asam laktat Lb. plantarum kik diduga disebabkan karena produksi asam laktat dan asam sitrat yang relatif lebih tinggi serta adanya sinergi dari asamasam organik lainnya dibandingkan pada isolatisolat lainnya. Hal ini membuktikan bahwa yang berperan dalam aktivitasnya sebagai antibakteri dari semua isolat tersebut umumnya bersumber dari asam organik. Hal ini ditunjukkan pula pada pengujian sebelumnya terhadap kemungkinan adanya komponen lain seperti bakteriosin dengan meningkatkan ph metabolit menjadi ph netral (ph 7) lalu diuji dengan difusi sumur. Semua isolat tidak memperlihatkan penghambatan terhadap bakteri uji kecuali pada Lb. acidophilus dan Lb.brevis 1,6. Menurut Jin et al. (1996) pengujian peranan asam lipofilik sebagai senyawa antimikroba, dapat dilakukan melalui penambahan alkali hingga sampel mempunyai ph netral lalu dilanjutkan dengan pengujian aktivitas antibakteri. Adanya asam organik berupa asam laktat dan asam sitrat dalam jumlah yang tinggi maupun asam organik lain pada metabolit Lb. plantarum kik dapat menghambat sel bakteri karena kelarutannya dalam bentuk tidak terdisosiasi di dalam larutan sehingga lebih mudah dapat berpenetrasi ke dalam membran. Pada ph intraseluler (phi) yang tinggi, asam ini akan berdisosiasi dan menghasilkan ion hidrogen atau proton (H + ). Bila

64 jumlah asam yang tidak terdisosiasi banyak yang masuk ke dalam sel, maka jumlah proton yang dihasilkan juga akan semakin banyak. Jumlah proton yang berlebihan dapat mempengaruhi integritas membran sitoplasma dan terjadi pengasaman sel. Akibatnya akan terjadi denaturasi protein, yang akan merusak membran sitoplasma (Yuk et al. 2005). Hal ini dapat menyebabkan gangguan pada sistem metabolisme seperti penghambatan transport substrat, penghambatan proses produksi energi dan sintesis makromolekul (Ray 2001). Penghambatan yang tinggi dari gabungan metabolit terhadap semua kultur BAL dan MAG minyak kelapa, bukan hanya diperankan oleh adanya sinergi dari asamasam organik yang terdapat dalam metabolit BAL terutama asam laktat tetapi juga adanya efek sinergi dari asam lemak terutama monokaprilin, monokaprat dan monolaurin yang juga termasuk asam lipofilik. Asam organik termasuk asam laktat merupakan asam lemah yang lebih mudah masuk ke dalam sel mikroba melalui dinding sel mikroorganisme yang akan menurunkan ph sitoplasma dan menghambat aktivitas dari sel bakteri. Penghambatan ini akan menjadi lebih besar dengan adanya efek dari MAG minyak kelapa yang dengan mudah menembus membran sitoplasma melalui interaksi dengan komponen fosfolipid, dan menghambat aktivitas enzim yang terlibat dalam produksi energi dan transpor nutrisi. Tingginya efek penghambatan pada campuran Lb. plantarum kik dengan MAG minyak kelapa dibanding dengan isolat BAL lainnya diperkirakan karena selain konsentrasi asam laktat juga kandungan asam sitrat yang relatif lebih tinggi dibanding dengan kelima isolat lainnya. Hal ini sejalan dengan hasil penelitian dari Blaszyk et al. (1998) yang menyatakan adanya efek sinergi dari asam sitrat dengan monolaurin pada konsentrasi 0,01% monolaurin dan asam sitrat 0,2% pada suhu 7 o C mampu menurunkan pertumbuhan L. monocytogenes pada tingkat yang tidak terdeteksi. Efek sinergi dari asam oganik (asam laktat) dan MAG minyak kelapa di duga karena kedua senyawa tersebut memiliki sifat yang hampir sama dalam aktivitasnya sebagai senyawa antimikroba. Sifat antimikroba dari MAG minyak kelapa ditunjukkan oleh sifat yang tidak mudah terdisosiasi dan memiliki gugus yang bersifat lipofilik (Davidson dan Branen 1994), sedangkan sifat antimikroba dari asam organik juga disebabkan oleh sifat tidak terdisosiasi yang dapat menurunkan ph sitoplasma. Sifat tidak

65 terdisosasi dari ke dua antimikroba inilah yang memudahkan senyawa antimikroba ini menembus dinding sel bakteri untuk selanjutnya masuk ke dalam membran sel, mempengaruhi ph sitoplasma dan aktivitas enzim maupun proses metabolisme di dalam sel bakteri. Hasil penelitian ini sejalan dengan temuan Oh dan Marshall (1994) yang menyatakan adanya efek sinergi dari asam laktat dengan monolaurin yang mampu mereduksi L. monocytogenes sebesar 2 unit log pada udang selama penyimpanan 20 hari pada suhu 4 o C. Pada penggunaan monolaurin secara tunggal hanya mampu menekan jumlah L. monocytogenes sebesar 0,5 unit log dan 1 unit log pada penggunaan asam laktat selama penyimpanan yang sama. Pada kultur Lb. acidophilus dan Lb. brevis AE 1,6 secara tunggal terlihat adanya efek penghambatan yang lebih besar dibandingkan dengan Lb. plantarum kik, dan jika penggunaannya dicampur MAG minyak kelapa memberikan penghambatan yang lebih kecil. Hal ini diduga karena produk metabolit yang dihasilkan dari Lb. acidophilus dan Lb. brevis AE 1,6 tidak hanya berupa asamasam organik seperti laktat, asetat dan sitrat, tetapi juga menghasilkan komponen lain yang dapat mempengaruhi aktivitas antimikroba dari monoasilgliserol. Mengingat bahwa Lb. acidophilus dan Lb. brevis merupakan BAL yang bersifat heterofermentatif, Lb. plantarum kik sebagai bakteri asam laktat yang bersifat homofermentatif lebih banyak memproduksi asam organik terutama asam laktat. Menurut Adams dan Moss (1995) BAL heterofermentatif mempunyai kemampuan untuk menghambat mikroorganisme lain karena menghasilkan metabolit berupa asam organik, hidrogen peroksida, etanol, dan bakteriosin. Pada kelompok homofermentatif akan di hasilkan jumlah asam laktat dalam jumlah yang lebih tinggi dibanding dengan heterofermentatif. Dalam penelitian ini rendahnya penghambatan yang diperoleh pada kedua kultur bakteri asam laktat ketika digabungkan dengan MAG minyak kelapa diduga karena adanya senyawa atau komponen lain yang menghalangi aktivitas antimikroba dari MAG minyak kelapa, seperti kandungan bakteriosin didalam metabolit dari kedua jenis kultur bakteri asam laktat tersebut. Menurut Shibasaki (1982) aktivitas antimikroba MAG minyak kelapa dalam bahan pangan yang berkadar pati atau protein tinggi akan mengalami penurunan, karena

66 terjadinya reaksi pembentukan senyawa kompleks, yang menyebabkan penurunan gugus hidroksil (gugus hidrofilik) dari MAG minyak kelapa. Lebih lanjut Kabara et al. (1994) menyatakan bahwa salah satu sifat antimikroba dari asam lemak dan turunannya disebabkan karena adanya gugus hidroksil. Hal inilah yang diduga menjadi penyebab berkurangnya aktivitas antimikroba dari kultur Lb. brevis dan Lb. acidophilus ketika dicampur dengan MAG minyak kelapa sebagai senyawa antimikroba, karena terjadi penurunan jumlah gugus hidroksil. Penelitian ini sejalan dengan yang dilaporkan oleh Endrakasih (2005) yang menyatakan protein antibakteri (bakteriosin) yang membentuk kompleks dengan lipida akan menurunkan aktivitas biologisnya sehingga kemampuannya dalam menghambat pertumbuhan bakteri berkurang. Hoffman et al. (2001) menemukan adanya efek penghambatan yang rendah dari gabungan asam laurat dengan nisin terhadap bakteri Salmonella Typhimurium bila dibandingkan dengan gabungan EDTA dan asam laurat. Asam laurat adalah jenis asam lemak yang mendominasi MAG minyak kelapa, sedangkan nisin adalah merupakan senyawa protein dari kelompok bakteriosin. Produksi Senyawa Antimikroba Untuk mengetahui senyawa yang memiliki aktivitas antimikroba dalam metabolit dari ke enam BAL yang digunakan dilakukan pengujian terhadap kadar asam, bakteriosin maupun terhadap hidrogen peroksida. Kandungan asamasam organik dalam metabolit BAL dilakukan dengan menggunakan HPLC, uji bakteriosin dengan difusi sumur (Delgado et al. 2000) dan hidrogen peroksida (kualitatif) dengan melihat ada tidaknya gas yang diproduksi. Berdasarkan hasil analisis terhadap kandungan asamasam organik dalam metabolit BAL diperoleh hasil sebagaimana yang terdapat dalam tabel 4.1. Berdasarkan hasil analisis tersebut menunjukkan bahwa ke enam BAL yang digunakan menghasilkan asam asam organik yang diketahui memiliki aktivitas antimikroba terhadap L.monocytogenes. Hal ini diperlihatkan dengan adanya areal penghambatan terhadap bakteri uji di sekitar sumur yang diberi supernatan dari metabolit BAL pada lubang sumur (Lampiran 2). Perbedaan kandungan asam

67 Tabel 4.1 Kandungan asamasam organik berbagai metabolit isolat BAL Hasil pengujian dengan HPLC Jenis asam organik Lb. acido Lb. plant Kik Lb. plant brevis Jenis isolat Lb. coryne Lb. plant Sa28k Lb. plant Pi28a Asetat 0,108 0,063 0,391 0,068 0,065 0,064 Propionat 0,082 0, ,061 0,081 0,068 Laktat 1,010 1,250 1,000 0,890 0,950 0,910 Oksalat 0,065 0,048 0,042 0,052 0,320 0,082 Malat 0,024 0,020 0,018 0,058 0,020 0,017 Sitrat 0,038 0,140 0,056 0,038 0,064 asam organik dari masingmasing BAL menunjukkan perbedaan dalam kemampuannya menghambat L. monocytogenes, BAL yang mengandung kadar asam laktat yang tinggi menghasilkan diameter penghambatan yang lebih tinggi dibandingkan dengan BAL lain dengan kadar asam laktat yang lebih rendah. Untuk menguji aktivitas penghambatan dari bakteriosin dalam supernatan, maka efek penghambatan oleh asam organik dalam supernatan yang digunakan dalam pengujian aktivitas antimikroba dihilangkan terlebih dahulu dengan menambahkan NaOH sampai ph supernatan menjadi netral. Hasil pengujian isolat terhadap bakteriosin (ph netral) yang dilakukan dengan difusi sumur, dimana menunjukkan bahwa semua isolat tidak memiliki aktivitas antibakteri terhadap L. monocytogenes, kecuali pada Lb. acidophilus dan Lb.brevis. Penghambatan dari semua isolat tersebut disebabkan oleh asam laktat kecuali pada Lb. acidophilus dan Lb.brevis yang tidak hanya diakibatkan karena kemampuannya dalam memproduksi asam tetapi juga karena poduksi bakteriosin. Tidak ditemukannya aktivitas penghambatan pada hampir semua isolat yang digunakan dalam penelitian ini diduga karena isolatisolat tersebut tidak memproduksi bakteriosin atau menghasilkan bakteriosin tapi tidak mampu menghambat bakteri uji. Marugg (1991) menyatakan bahwa bakteriosin yang diproduksi Lactobacillus memiliki aktivitas antimikroba yang spesifik, sedangkan

68 Tabel 4.2. Diameter penghambatan beberapa metabolit BAL pada ph Supernatan dan ph Supernatan yang dinetralkan Jenis BAL Diameter penghambatan (mm) metabolit BAL ph Supernatan ph Supernatan yang dinetralkan (ph 7) Lb.plantarum kik Lb.brevis 1,6 Lb.plantarum pi28a Lb.plantarum sa28k Lb.acidophilus Lb.coryneformis 12,98 13,12 9,19 9,24 13,45 10,05 0 6, ,13 0 Diaz et al. (1993) yang telah menseleksi 26 galur L. plantarum dari fermentasi buah zaitun hijau menyatakan bahwa plantarisin S yang dihasilkan oleh L. plantarum dapat menghambat Leoconostoc mesentroides dan Streptococus tetapi tidak menghambat bakteri Bacillus dan L. monocytogenes. Pengujian produksi hidrogen peroksida hanya dilakukan secara kualitatif sesuai dengan hasil penelitian yang dilakukan oleh peneliti terdahulu terhadap isolat yang sama, yakni Lb. plantarum oleh Idawati (1996), Solihati (1995) dan Lee (1995) diperoleh hasil sekisar 7,9215,81 µg/ml pada media pepton setelah dua hari inkubasi. Sementara Price dan Lee (1970) menemukan konsentrasi hidrogen peroksida bersifat bakteriosidal pada konsentrasi 2533 µg/ml. Pengaruh rasio metabolit BALMAG minyak kelapa terhadap efek sinergi Untuk mengetahui rasio campuran metabolit BALMAG yang menghasilkan penghambatan yang maksimum, diterapkan delapan tingkatan rasio campuran metabolit BALMAG, yaitu 40:1 (A); 20:1 (B); 10:1 (C); 5:1 (D); 5:2 (E); 5:3 (F); 5:4 (G) dan 5:5 (H). Analisis statistik menunjukkan bahwa rasio campuran metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa terhadap bakteri uji memberikan perbedaan yang sangat nyata pada P<0,01 (Lampiran 26). Pengamatan aktivitas antimikroba campuran metabolit BALMAG minyak kelapa pada berbagai rasio (Gambar 4.5 dan lampiran 4) cenderung mengalami peningkatan

69 dengan menurunnya rasio campuran metabolit BAL dan MAG minyak kelapa atau semakin efektif pada rasio 5:3 sampai 5:5. Peningkatan aktivitas antibakteri metabolit BALMAG minyak kelapa pada rasio antara 40:1 dan 20:1 tidak berbeda nyata, demikian pula antara 10:1 dan 5:2 serta antara 5:3 dan 5:5. Pada rasio 20:1 dengan 10:1 dan 5:2 dengan 5:3 terjadi peningkatan yang cukup berarti (Lampiran 26). Berdasarkan pola peningkatan aktivitas tersebut dapat diduga bahwa aktivitas antimikroba campuran metabolit BALMAG akan meningkat pada penurunan rasio campuran metabolit BAL MAG lebih rendah dari 5:5. Berdasarkan pola peningkatan aktivitas antimikroba campuran metabolit BALMAG minyak kelapa yang tidak berbeda antara 5:3 dan 5:5, dipilih rasio campuran metabolit BALMAG minyak kelapa 5:3 sebagai rasio terseleksi yang akan digunakan pada penelitian selanjutnya. Hasil penelitian ini sejalan dengan temuan Blaszyk et al. (1998) yang melaporkan daya penghambatan pertumbuhan bakteri L. monocytogenes lebih rendah pada penggunaan 0,01% monolaurin dan 0,2% asam sitrat atau rasio asam sitrat/monolaurin 20:1 dibandingkan pada penggunaan 0,025% monolaurin dan 0,2% asam sitrat atau pada rasio asam sitrat/monolaurin 8:1 (v/v). Oh dan Marshall (1994) juga menemukan penurunan jumlah L. monocytogenes pada produk udang yang lebih rendah pada penggunaan rasio asam laktat/monolaurin yang lebih tinggi. 35 Diameter penghambatan (mm) :1 20:1 10:1 5:1 5:2 5:3 5:4 5:5 Rasio metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa Gambar 4.5. Aktivitas antimikroba campuran metabolit Lb.plantarum kikmag minyak kelapa pada berbagai rasio terhadap L. monocytogenes

70 Menurut Davidson dan Branen (1994) polaritas suatu senyawa antimikroba merupakan sifat fisik yang penting, karena sifat ini akan menyebabkan senyawa antimikroba dapat larut dalam fase cair yang merupakan tempat hidup mikroba, meskipun demikian sifat non polar (hidrofobik) juga penting karena akan bekerja pada membran sel yang bersifat hidofobik. Oleh karena itu senyawa antimikroba membutuhkan keseimbangan hidrofiliklipofilik untuk mencapai aktivitas yang optimal. Diduga keseimbangan tersebut akan tercapai pada peningkatan penggunaan MAG minyak kelapa atau pada rasio campuran metabolit BALMAG minyak kelapa berada pada kisaran rasio 5:3, sebab pada peningkatan MAG minyak kelapa cenderung meningkatkan aktivitas antibakteri campuran metabolit Lb.plantarum kikmag minyak kelapa. Disamping itu aplikasi pada sistem pangan dapat lebih luas karena dengan rasio tersebut diperoleh sistem emulsi minyak dalam air yang lebih baik. KESIMPULAN Semua isolat BAL (Lb. plantarum pi28a, Lb. plantarum sa28k Lb. plantarum coryneformis, Lb. plantaum kik, Lb. brevis dan Lb. acidophlius ) yang diteliti berpotensi untuk bersinergi dengan MAG minyak kelapa dengan efek sinergi terbesar diberikan oleh Lb. plantarum kik. Rasio metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa yang memberikan aktivitas antimikroba terbaik adalah kikmag 5:3. Umumnya BAL yang digunakan pada metabolitnya menghasilhan asam organik, hidrogen peroksida dan sebagian BAL (Lb. brevis dan Lb. acidophlius) selain menghasilkan asam organik dan hidrogen peroksida juga menghasilkan bakteriosin. DAFTAR PUSTAKA Adam MR, Moss MO Food Microbiology. The Royal Society of Chemistry. August EG Kajian Penggunaan Lipase Amobil dari Aspergillus niger pada Pembuatan Monoasilgliserol yang Bersifat Antibakteri dari Minyak Kelapa. Thesis Program Pascasarjana I P B. Bogor. Bloomfield SF Assessing antimicrobial activity. Di dalam: Denyer SP, Hugo WB, editor. Mechanism of action of chemical biocides. Oxoford: Blackwell Scientific Publication.hlm 122.

71 Carson, C.F, T.V. Riley Antimicrobial activity of the major components of the esensial oil of Melaleuca alternifolia. J. Appl. Bacteriol. 78: Davidson PM, Parish ME Methods for testing the efficacy of food antimicrobials. J. Food Technol. 43: Davidson PM, Branen AL Antimicrobial in Food. Marcel Dekker, New York. Diaz, R.J, RiosSanchez. Desmazeaud M, RuizBarba, Piard J.C Plantaricin S and T, two new bacteriocins produced by Lactobacillus plantarum LPC010 isolated from a green olive fermentation. Appl. and environ. Microbiol, May, Duxbury DD Combination emulsifier/acidulant extends cheese sauce shelf life. J. Food Protec. 46 (9): Elida M Profil Bakteri Asam Laktat dari Dadih yang Difermentasi dalam Berbagai Jenis Bambu dan Potensinya Sebagai Probiotik. Thesis Program Pasacasarjana, IPB. Bogor. Endarkasih E Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Antibakteri Bacillus subtilis T4 Isolat Lapangan. Disertasi Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Fardiaz S Mikrobiologi Pangan. Depdikbud, Dirjen Dikti, PAU Pangan dan Gizi, IPB. Bogor. Hoffman KL, Han IY, Dawson PL Antimicrobial effects of corn zein film impregnated with nisin, lauric acid, and EDTA. J. of food protec, Vol 64, (6): Indriyati Kajian Aktivitas Antimikroba Campuran Mono dan Diasilgliserol Hasil Pemanfaatan Destilat Asam Lemak Minyak Kelapa. Thesis Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Jay JM Modern Food Microbiology 5 th edition. Chapman and Hall, New York. Jenie BSL, Andjaya N, Noor A Aplikasi bakteri asam laktat dalam proses pengolahan ikan kembung kering rendah garam. Prosiding Seminar Nasional Makanan Tradisional, Yogyakarta, 16 Maret Jenie BSL, Suliantari, Andjaya N Pengembangan produk makanan tradisional rendah garam berbasis ikan melalui aplikasi bakteri asam laktat penghasil bakteriosin. Laporan Hibah Bersaing Tahun 1999/2000. Jin LZ, Ho YW, Abdullah N, Ali MA, Jalaludin S Antagonistic effects of intestinal Lactobacillus isolates on pathogens of chicken. Lett. In Appl. Microbiol. 23: Kabara JJ Antimicrobial agents derived from fatty acids. J. Am. Oil Chem. Soc. 61: Mappiratu Penggunaan Biokatalis Dedak Kasar dalam Biosintesis Antimikroba Monoasilgliserol dari Minyak Kelapa. Disertasi Program Pascasarjana IPB, Bogor.

72 Mappiratu, Umrah, Ijirana Pemanfaatan sabun hasil samping pengolahan minyak kelapa dalam pembuatan monoasilgliserol menggunakan lipase Apergillus niger amobil isolat kapang kopra. Laporan Penelitian RUT VIII/2 Fakultas Pertanian, UNTAD. Mariani N Aplikasi bakteri asam laktat untuk meningkatkan keamanan dan umur simpan buah melon (Cucumis melo L.) olah minimal. Skripsi Fakultas Teknologi Hasil Pertanian, IPB. Bogor. Marugg JD Bacteriocins, their role in developing natural products. Food Biotechnology 5 (3) : 305. Naidu AS, Clemens RA Probiotics. Di dalam: Natural Food Systems. Naidu AS (Ed). CRC Press,LLC. Antimicrobial Oh DH, Marshall DL Enhanced inhibition of Listeria monocytogenes by glycerol monolaureate with organic acid. J. Food Science, 59 (6): Price RJ, Lee JS Inhibition of Pseudomonas species by hydrogen peroxide producing Lactobacilli di Dalam: Suarsana IN, Utama IH, Suhartini NA Aktivitas invitro senyawa antimikroba dari Streptococcus lactis. Veterinary journal Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana 2 (1) : Rahmadi M Aplikasi Bakteri Asam Laktat untuk Meningkatkan Keamanan dan Umur Simpan Buah Apel Manalagi (Malus sylvestris Mill) Olah Minimal. Skripsi Fakultas Teknologi Hasil Pertanian, IPB. Bogor. Ray B Probiotic of Lactic Acid Bacteria Science or Myth. Di dalam NATO ASI Series, editor. Lactic Acid Bacteria. Current Advance in Metabolism,Genetic, and Application. Volume V(98). SpringerVerlag Germany. Ray B Fundamental Food Microbiology 2 nd edition. CRC Press New York. Salminen S, von Wright A Lactic Acid Bacteria. Marcel Dekker Inc. New York. Shibasaki I Recent trends in the development of food preservatives. J. Food Safety 4:3539. Smith L, Mann JE, Harris K, Miller MF, Brashears MM Reduction of Escherichia coli O157:H7 and Salmonella in ground beef using lactic acid bacteria and the impact on sensory properties. J. of Food Protec, 68: Unda JR, Molins RA, Walker HW Clostridium sporogenes and L. monocytogenes. Survival and inhibition in microwave ready beef roast containing selected antimicrobial. J. Food Sci Wang LL, Yang BK, Parkin KL, Johnson EA Inhibitionnof Listeria monocytogenes by monoacyglycerols synthesized from coconut oil and milk fat by lipasecatalyzed glycerolysis. J. Agric. Food Chem. 41: Widyastuty A Aplikasi Bakteri Asam Laktat untuk Me ningkatkan Keamanan dan Umur Simpan Buah Nenas (Ananas comosus (L) Merr) Olah Minimal. Skripsi Fakultas Teknologi Hasil Pertanian, IPB. Bogor.

73 Yuk HG, Marshall DL Influence of acetic, citric, and lactic acids on Escherichia coli O157:H7 membrane lipid composition, verotoksin secretion, and acid resistance in simulated gastric fluid. J. of Food Protec. 68:

74 5. AKTIVITAS ANTIMIKROBA CAMPURAN METABOLIT Lb. plantarum kikmag MINYAK KELAPA TERHADAP MIKROBA PATOGEN PANGAN ABSTRAK Penelitian ini mengkaji aktivitas antimikroba campuran metabolit bakteri Lb. plantarum kik dan monoasilgliserol (Lb. plantarum kikmag) terhadap empat jenis bakteri patogen, yaitu L. monocytogenes, B. cereus, Salmonella Typhimurium, E. coli dan kapang Aspergillus flavus. Daya hambat campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa terhadap pertumbuhan ke empat jenis bakteri patogen diuji dengan metode difusi sumur, sedangkan untuk mengetahui nilai MIC dari campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa digunakan metode kontak dalam medium broth. Hasil penelitian menunjukkan bahwa campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa mampu menghambat pertumbuhan semua jenis bakteri uji dengan diameter penghambatan di atas 22,2 mm. Diameter penghambatan tertinggi (30,7mm) ditemukan pada L. monocytogenes, sedangkan diameter penghambatan terendah pada E. coli (22,2 mm). Nilai MIC campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa berbedabeda untuk setiap jenis bakteri patogen. Nilai MIC campuran metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa berkisar antara 1,23% (v/v). E. coli adalah bakteri yang paling resisten dibandingkan bakteri lainnya, dengan nilai MIC sebesar 3%, sedangkan bakteri L. monocytogenes adalah bakteri yang terpeka dengan nilai MIC sebesar 1,2 %. Aktivitas antikapang dari campuran metabolit Lb. plantarum kik dan MAG secara tunggal menyebabkan penurunan berat miselia kapang sebesar 0,35 1,54 mg/ml, sedangkan penggunaan campuran metabolit Lb. plantarum kikmag menyebabkan penurunan lebih besar, yaitu 0,822,75 mg/ml pada penggunaan 5 20%. PENDAHULUAN Lactobacillus plantarum merupakan bakteri asam laktat (BAL) dari famili Lactobacillaceae yang berbentuk batang dan pada umumnya berukuran tunggal atau membentuk rantai pendek, bersifat anaerob fakultatif, dengan suhu pertumbuhan minimum 10 o C dan maksimum 40 o C (Surono 2004). Pembentukan asam yang tinggi dalam metabolit Lb. Plantarum, baik dalam bentuk tunggal maupun campuran dengan metabolit BAL lain, telah diketahui dapat menghambat pertumbuhan bakteri perusak dan bakteri patogen atau bahkan tidak dapat bertahan hidup. Untuk lebih meningkatkan aktivitas antimikroba dari metabolit Lb. Plantarum yang diketahui memiliki kandungan asam yang relatif tinggi yang dapat mempengaruhi cita rasa dari produk, maka perlu dilakukan penggabungan dengan

75 63 bahan antibakteri lain seperti MAG. Dengan penggabungan ini diharapkan dapat mereduksi rasa asam dari bahan antibakteri tersebut, dan sekaligus memperluas penggunaannya sebagai antibakteri bahan pangan. Monoasilgliserol (MAG) dari minyak kelapa selain berfungsi sebagai pengemulsi, juga dapat berfungsi sebagai antimikroba. Sifat ini tidak dimiliki oleh MAG dari minyak nabati lain yang mengandung asam lemak rantai panjang jenuh dan tidak jenuh (Wang et al. 1993; Lee et al. 2002; Mappiratu et al. 2002). Perbedaan tersebut disebabkan oleh jenis asam lemak minyak kelapa yang didominasi oleh asam lemak jenuh rantai pendek dan menengah (C8:0 sampai C14:0). MAG minyak kelapa dalam bahan pangan menunjukkan efek sinergi dengan asamasam organik yang telah umum digunakan pada bahan pangan, seperti asam atau garam laktat, asam atau garam sorbat, dan asam atau garam sitrat (Davidson dan Branen 1994). Penggunaan campuran asam laurat dan kalsium laktat dapat meningkatkan waktu simpan kamaboko (pasta ikan) dari enam hari menjadi 20 hari pada penyimpanan suhu rendah. Selain itu, penggunaan asam sitrat 0,2% dan asam laurat 0,025% pada daging ayam tanpa tulang dan sosis ayam dapat memperpanjang masa simpan produk tersebut masingmasing 5, 7, dan 8 hari di suhu ruang (Baker et al. 1982). Campuran monolaurin dan asam organik selain memiliki aktivitas antibakteri, juga dapat menghambat aktivitas kapang yang bersifat patogen pada bahan pangan. Lb. plantarum sa 28k dilaporkan mampu menghambat pertumbuhan A. flavus dan R. oligosporus (Hidayat 2001), dan campuran Lb. plantarum kik dengan garam 7,5% mampu menghambat pertumbuhan A. flavus sebesar 3 unit log dari jumlah awal 10 6 CFU/ml setelah 3 jam perendaman (Situngkir 2005). Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mempelajari aktivitas antibakteri dan antikapang dari metabolit yang dihasilkan oleh Lb.plantarum kik dengan MAG minyak kelapa terhadap beberapa bakteri dan kapang patogen, seperti L. monocytogenes, B. cereus, S. Typhimurium, E. coli dan kapang Aspergillus flavus.

76 64 METODOLOGI Bahan dan Alat Isolat BAL yang digunakan adalah Lb. plantarum kik (isolat kecap ikan) yang merupakan hasil seleksi tahapan sebelumnya. MAG minyak kelapa diperoleh dari Laboratorium Agroindustri Fakultas Pertanian Universitas Tadulako. Bakteri uji yang digunakan adalah L. monocytogenes (FNCC 0156), Bacillus aureus (FNCC 057), S. Typhimurium (FNCC 0734) yang diperoleh dari Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi UGM dan E. coli (ATCC 25922) diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Pangan Seafast (Southeast Asian Food and agriculture Science and Technology) Center IPB. Semua media mikrobiologi diperoleh dari Oxoid Ltd, sedangkan peralatan berupa inkubator, sentrifus, oven, dan alatalat gelas diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia Pangan IPB. Persiapan kultur bakteri uji Sebanyak satu ose bakteri uji dari stok agar miring diinokulasikan ke dalam medium nutrien broth (NB) dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Sebanyak 1 ml kultur bakteri ditambahkan ke dalam 9 ml media NB dan diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37 o C. Kultur bakteri uji 10 6 CFU/ml digunakan dalam uji antimikroba dari campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa. Produksi metabolit bakteri asam laktat Produksi metabolit BAL dipersiapkan secara bertahap dengan mengikuti metode Jenie et al. (2000) sebagai berikut. Kultur Lb. plantarum kik sebanyak 1 ml diambil dari stok masingmasing dan diinokulasikan ke dalam 9 ml MRS Broth, diinkubasi pada suhu 37 o C selama 2 hari. Sebanyak 4% (v/v) kultur Lb. plantarum kik tersebut diinokulasikan ke dalam media steril MRSB modifikasi dengan penambahan 2% glukosa, 2% ekstrak khamir, dan 1% tripton, selanjutnya diinkubasi selama 2 hari pada suhu 37 o C. Produk fermentasi dipisahkan dari masa sel dengan cara sentrifus pada rpm selama 15 menit. Supernatan yang terbentuk dipisahkan dari endapan menggunakan kertas saring whatman ukuran 0.22 µm, dalam proses penyaringan

77 65 larutan diambil dan dicampur dengan MAG minyak kelapa dengan perbandingan 5:3 (v/v) yang merupakan rasio terbaik dari hasil penelitian sebelumnya. Selanjutnya campuran yang dihasilkan diuji aktivitasnya terhadap beberapa mikroba uji dengan menggunakan metode difusi sumur dan penentuan nilai MIC dari beberapa jenis bakteri uji. Aktivitas antimikroba metabolit Lb. plantarum kikmag Minyak Kelapa terhadap beberapa bakteri patogen Kultur yang diambil dari persiapan bakteri uji dihomogenkan dengan vorteks lalu diambil sebanyak 25 µl, dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang berisi 25 ml media agar cair steril, dikocok merata lalu dituang ke dalam cawan petri steril dan dibiarkan sampai membeku, selanjutnya dibuat lubang (sumur) dengan diameter sekitar 6 mm menggunakan pipa kapiler, yang sebelumnya terlebih dahulu disterilkan. Campuran metabolit BALMAG minyak kelapa dengan rasio 5:3 (v/v) yang akan diujikan diambil sebanyak 60 µl, kemudian dimasukkan dalam sumur dan dibiarkan berdifusi pada suhu dingin selama 120 menit (2 jam). Selanjutnya cawan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Areal bening yang menunjukkan daerah hambat di sekitar sumur diukur mulai dari tepi sumur menggunakan jangka sorong. Penentuan MIC untuk beberapa bakteri patogen Minimum Inhibitory Concentration (MIC) didefenisikan sebagai konsentrasi terkecil dari senyawa antimikroba yang dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme pada periode inkubasi tertentu. Penentuan MIC dapat dilakukan dengan metode difusi sumur atau dengan metode pengenceran broth. Pada penelitian ini penentuan MIC dilakukan dengan metode pengenceran yang mengacu pada metode Kubo et al. (1995) dengan beberapa deret pengenceran dalam tabung yang berisi nutrien Broth (NB). Ke dalam masing masing tabung serial pengenceran diinokulasikan bakteri uji yang berjumlah 10 6 CFU/ml. Kemudian ditambahkan campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa (5:3) pada berbagai konsentrasi secara aseptis. Selanjutnya diinkubasi dalam shaker goyang dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 37 o C, kecuali untuk L. monocytogenes dilakukan pada suhu ruang selama 24 jam. Nilai MIC dinyatakan

78 66 sebagai konsentrasi terendah yang dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme sebesar 90%. Persiapan spora kapang uji (Kim et al. 2000) Kultur murni A. flavus disegarkan dengan cara menggores kembali kultur murni tersebut pada medium PDA, kemudian diinkubasi pada suhu ruang (28 o C) selama 7 hari. Suspensi spora dibuat dengan menambahkan larutan garam fisiologis yang mengandung 0,5% Tween 80 ke dalam agar miring. Suspensi spora kapang dihitung dengan menggunakan hemasitometer kemudian diatur konsentrasinya menjadi 10 6 CFU /ml dan digunakan untuk uji selanjutnya. Aktivitas metabolit Lb. plantarum kikmag terhadap berat miselia A. flavus Uji aktivitas antikapang campuran metabolit Lb. plantarum kikmag terhadap A. flavus menggunakan metode kontak. Potensi anti kapang campuran metabolit Lb. plantarum kikmag terhadap A. flavus pada metode ini ditunjukkan dengan berat kering miselia setelah inkubasi 48 jam pada suhu kamar. Semakin sedikit miselia yang dihasilkan kapang, berarti semakin besar aktivitas penghambatan dari campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa yang ditambahkan. Hal ini disebabkan miselium merupakan kumpulan hifa yang terbentuk dari germinasi spora kapang, sehingga dapat digunakan sebagai parameter pertumbuhan kapang (Gourama dan Bullerman 1995). Suspensi spora kapang dengan konsentrasi 10 6 CFU/ml diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam 25 ml media PDB steril secara aseptik. Kemudian dimasukkan campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa pada berbagai konsentrasi (0, 5, 10, 15, dan 20%), dan diinkubasi pada inkubator bergoyang agitasi 100 rpm pada suhu ruang selama 48 jam. Masa sel kapang yang tumbuh setelah 48 jam dipisahkan dengan penyaringan vakum menggunakan corong Buchner, kemudian dikeringkan dalam oven bersuhu 100 o C sampai beratnya tetap. Sebagai kontrol adalah perlakuan tanpa penambahan metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa.

79 67 Reduksi masa sel = Masa sel kontrol masa sel metabolit BALMAG Masa sel kontrol HASIL DAN PEMBAHASAN Aktivitas campuran metabolit BALMAG terhadap beberapa bakteri patogen Hasil pengukuran diameter penghambatan yang tertinggi sampai ke yang terendah ditemukan berturutturut pada L. monocytogenes, B. cereus, S. Typhimurium dan E. coli masingmasing sebesar 30,7 mm, 28,2 mm, 22,1 mm dan 20,2 mm. Campuran metabolit Lb. plantarum kikmag memberikan pengaruh yang berbeda nyata (P<0,01) terhadap masingmasing bakteri uji. Zona penghambatan L. monocytogenes dan B. cereus tidak berbeda nyata, demikian pula antara S. Typhimurium dan E. coli. Aktivitas antibakteri metabolit Lb. plantarum kikmag lebih kuat terhadap bakteri Gram positif (L. monocytogenes dan B. cereus) dibandingkan dengan Gram negatif (S. Typhimurium dan E. coli) yang ditandai dengan tingginya diameter penghambatan pada L. monocytogenes dan B. cereus dibanding S. Typhimurium dan E. coli (Gambar 5.1 dan Lampiran 5). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa dapat menghambat pertumbuhan semua jenis bakteri uji yang meliputi bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Hal ini disebabkan karena komponen yang ada pada campuran metabolit Lb. plantarum kikmag mampu membunuh semua jenis mikroba atau dengan kata lain komponen yang ada pada campuran metabolit Lb. plantarum kikmag memiliki spektrum penghambatan yang luas. Dari hasil analisis asamasam lemak dalam campuran metabolit Lb. plantarum kikmag dengan menggunakan gas kromatografi (Tabel 5.1) diketahui bahwa kandungan asam lemak jenuh rantai pendek dan menengah sebesar 86,8% dan jumlah terbesar didominasi oleh asam laurat. Hasil analisis kandungan asam organik dari metabolit Lb. plantarum kik dengan HPLC menunjukkan bahwa asam laktat terdapat dalam jumlah besar, sedangkan asam asetat, propionat, dan sitrat dalam jumlah kecil (Tabel 4.1).

80 68 L.monocytogenesDiameter penghambatan (mm) B. cereus S. Typhimurium E. coli 20.2 Jenis bakteri uji Gambar 5.1. Aktivitas antibakteri campuran metabolit Lb.plantarum kikmag terhadap beberapa bakteri patogen Keberadaan asam lemak maupun asamasam organik dalam campuran metabolit Lb. plantarum kikmag ikut memperkuat sifat antibakteri campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa. Kedua senyawa tersebut dapat bekerja secara sinergi dalam menghambat pertumbuhan bakteri dan pada akhirnya kematian bakteri dipercepat. Asamasam organik seperti asam laktat, sitrat, propionat maupun asamasam organik lainnya yang terdapat dalam campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa telah dilaporkan oleh beberapa peneliti mempunyai aktivitas antibakteri yang cukup besar, selain itu peranan asam lemak dalam campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa juga berperan untuk menghambat pertumbuhan bakteri uji. Hal ini terbukti dari hasil penelitian Wang et al. (1993); Mappiratu (1999), Mappiratu et al. (2002), August (2000) yang menemukan adanya penghambatan terhadap bakteri Gram positif dan Gram negatif oleh asam lemak seperti kaprilin, kaprat, laurat, maupun meristin yang diketahui asamasam lemak ini banyak ditemukan dalam MAG dari minyak kelapa. Sementara Indriyati (2003) menemukan efek penghambatan dari MAG minyak kelapa hanya terhadap bakteri Gram positif sedangkan pada gram negatif tidak ada penghambatan.

81 69 Tabel 5.1. Kandungan asamasam lemak pada campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa Jenis asam lemak Kaprilat (C8:0) Kaprat (C10:0) Laurat (C12:0) Meristat (C14:0) Palmitat (C16:0) Stearat (C18:0) Oleat (C18:1) Linoleat (C18:2) Berat molekul MAG minyak kelapa 7,50 9,20 49,90 17,66 9,3 2,14 4,30 0,00 Komposisi Asam lemak (%) Campuran Metabolit Lb.plantarum kikmag minyak kelapa 9,89 10,71 45,42 18,24 9,90 2,00 3,84 0,00 Menurut Lee et al. (2002) ester MAG dalam bentuk monolaurin, monokaprilin dan monokaprin memiliki daya antibakteri, terutama terhadap S. aureus, B. cereus dan B. subtilis. Mappiratu (1999) juga menemukan hal yang sama, yaitu aktivitas antibakteri MAG terhadap S. aureus, B. cereus dan V. parahaemoliticus tertinggi diperoleh pada waktu reaksi 96 jam dengan jumlah asam lemak jenuh rantai pendek dan menengah tertinggi dalam MAG minyak kelapa. Daya hambat campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa lebih kuat terhadap bakteri Gram positif, yaitu 30,66 mm untuk L. monocytogenes dan 28,25 mm untuk B. cereus dibandingkan dengan bakteri Gram negatif 22,12 mm untuk S. typhimurium dan 20,2 mm untuk E. coli. Menurut Elgayyar et al. (2000), jika senyawa memiliki zona hambat (termasuk diameter sumur) lebih besar atau sama dengan (=) 28 mm menunjukkan penghambatan yang kuat, jika = mm menunjukkan penghambatan sedang, dan jika < 16 sampai 10 mm menunjukkan penghambatan kecil. Perbedaan daya hambat ini disebabkan oleh struktur dinding sel bakteri. Bakteri Gram positif hanya mempunyai satu lapisan membran yang mengandung peptidoglikan, sedangkan bakteri Gram negatif mempunyai membran dalam dan membran luar.

82 70 Lapisan membran luar disebut juga Outer Wall Layer. Lapisan ini mengandung fosfolipid, lipopolisakarida dan lipoprotein. Lipopolisakarida dan peptidoglikan merupakan saringan untuk berbagai senyawa antibakteri seperti bakteriosin, enzim, maupun senyawa yang bersifat non polar (Alakomi et al. 2000). Senyawa antibakteri yang terkandung dalam campuran metabolit Lb. plantarum kik MAG selain mengandung senyawa yang bersifat polar (asam organik) juga mengandung senyawa yang bersifat non polar, terutama asam lemak asam lemak dari MAG minyak kelapa, seperti laurat, kaprilin dan kaprat memiliki sifat kurang hidrofilik atau cenderung bersifat non polar, sehingga lebih sulit berpenetrasi ke dalam sel bakteri Gram negatif daripada bakteri Gram positif (Blaszyk et al. 1998). Lebih lanjut dikemukakan oleh Davidson dan Branen (1994) bahwa pada senyawa antimikroba yang bersifat hidrofobik lebih efektif menghambat bakteri Gram positif dibandingkan Gram negatif. Ketahanan bakteri Gram negatif terhadap senyawa antibakteri dari monolaurin, karena pada dinding selnya terdapat lapisan lipopolisakarida (LPS) yang akan menyaring masuknya asamasam lemak yang terdapat dalam monolaurin tersebut agar tidak dapat masuk ke dalam sel (Outarra et al. 1997). Adanya gugus hidrofobik inilah yang menjadi pembatas dari metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa dalam melakukan aksinya terhadap bakteri Gram negatif sehingga diperoleh penghambatan yang relatif kecil. August (2000) menemukan adanya aktivitas antibakteri dari MAG minyak kelapa terhadap B. subtilis dan S aureus (bakteri Gram positif), lalu diikuti oleh S. Typhimurium (Gram negatif). Outarra et al. (1997) dalam penelitiannya tidak menemukan adanya aktivitas antibakteri dari monolaurin terhadap P. fluorescens dan S. liquefaciens, sedangkan terhadap L. curvatus dan Candida pisciola diperoleh penghambatan yang cukup tinggi. Penentuan Nilai MIC (Minimum Inhibitory Concentration) Minimum Inhibitory Concentration (MIC) didefenisikan sebagai konsentrasi terkecil dari senyawa antimikroba yang dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme pada masa inkubasi 24 jam (Kubo et al. 1993). Penentuan nilai MIC dilakukan menggunakan metode kontak pada berbagai konsentrasi campuran metabolit Lb. Plantarum kikmag minyak kelapa.

83 71 Pengujian MIC dengan difusi sumur, dilakukan dengan memasukkan bahan antimikroba ke dalam sumur agar. (A) (B) (A) (C) Gambar 5.2. Diameter penghambatan campuran metabolit Lb.plantarum kik MAG terhadap L. monocytogenes ; (B) B. cereus ; (C) E. Coli; dan (D) S. Typhimurium. Nilai MIC memberikan perbedaan yang nyata (P<0.01) antara bakteri Gram positif (L. monocytogenes dan B.cereus) dan bakteri Gram negatif (S. Typhimurium dan E. coli), tetapi antara sesama bakteri Gram positif maupun bakteri Gram negatif sendiri memiliki nilai MIC yang relatif sama. Dengan kata lain jenis bakteri yang sama memiliki respon yang sama terhadap campuran metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa, dan sebaliknya bakteri yang berbeda jenisnya memiliki respon yang berbeda terhadap metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa. (B) (D) Nilai MIC dalam penelitian ini berkisar antara 1,23% (Gambar 5.3).

84 72 Bila dibandingkan dengan nilai MIC yang ditemukan oleh Wang et al. (1993) pada asam lemak monokaprilin minyak kelapa sebesar 10%, Lee et al. (2002) pada gliserol monolaurat sebesar 5%, Ardiansyah (2003) pada daun beluntas 2,26 3,19%, Naufalin (2005) pada ekstrak kecombrang 3 13%, demikian halnya dengan senyawa antimikroba alamiah lainnya seperti pada daun salam (Nuraida dan Dewanti, 2001) sekitar 1,49 3,97% maupun pada biji picung (Nuraida et al. 1999) sekitar 3,36 6,25 maka campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa yang digunakan dalam penelitian ini memiliki nilai MIC yang lebih rendah Nilai MIC L. monocytogenes B. cereus S. Typhimurium Gambar 5.3. Nilai MIC Metabolit Lb. plantarum kikmag minyak Kelapa Terhadap Beberapa Bakteri Patogen Adanya perbedaan nilai MIC dari berbagai senyawa antimikroba yang telah dilaporkan oleh beberapa peneliti terdahulu disebabkan oleh berbagai faktor diantaranya komponen yang terdapat pada bahan antimikroba tersebut, metode uji yang digunakan maupun kriteria yang dipilih untuk menyatakan MIC. Pada penelitian ini, terlihat bakteri yang paling peka terhadap campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa adalah L. monocytogenes dengan nilai MIC sebesar 1,2% (Gram positif ) dan yang paling tahan adalah bakteri E. coli dengan nilai MIC sebesar 3% (Gram negatif). Hasil yang sama juga ditemukan oleh August (2000), Mappiratu et al. (2002) dan Lee et al. (2002), yaitu efek penghambatan dari MAG minyak kelapa yang lebih tinggi pada kelompok bakteri Gram positif dari pada bakteri Gram negatif. Membran terluar (outer membran) E. coli

85 73 bakteri Gram negatif akan memberikan ketegaran yang lebih kuat dibandingkan dengan bakteri Gram positif. Keadaan ini disebabkan oleh adanya senyawa lipopolisakarida, protein, fosfolipid dan peptidoglikan sehingga bakteri Gram negatif mempunyai ketahanan terhadap senyawa antimikroba dari campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa. Alakomi et al. (2000) menyatakan bahwa outer membran pada bakteri Gram negatif berfungsi sebagai penghalang masuknya senyawasenyawa yang tidak diperlukan sel seperti bakteriosin, enzim dan senyawa hidrofobik. Mekanisme masuknya campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa ke dalam sel diduga diawali dengan kemampuan dari campuran metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa yang dalam bentuk tidak terdisoasiasi mudah menembus ke dalam sel, sehingg ph internal dari sel akan menurun. Penurunan ph ini akan menyebabkan enzimenzim bekerja untuk mengembalikan ph internal sel menjadi normal. Warneclo dan Gill (2005) menyatakan bahwa asamasam organik yang tidak terdisosiasi dapat menembus lapisan bilayer lipid pada bakteri E. coli dan akan melepaskan proton ke dalam sitoplasma. Kelebihan proton intraseluler akan mengasamkan sitoplasma dan menyebabkan denaturasi protein, serta kehilangan energi karena aktivasi pompa proton (membutuhkan ATP), dan pada gilirannya akan menghambat pertumbuhan bakteri. Selain itu dengan adanya MAG minyak kelapa yang mengandung komponen asam lemak, maka interaksi dengan protein maupun fosfolipid dari dinding sel atau sitoplasma melalui ikatan hidrogen dan ikatan hidrofobik menjadi lebih mudah. Kondisi ini menyebabkan larutnya komponen penyusun membran sel, seperti protein, fosfolipid yang mengakibatkan permeabilitas membran meningkat dan memungkinkan keluarnya substansi sel seperti asam nukleat dan protein yang mengakibatkan kematian sel. Perbedaan komposisi dinding sel bakteri Gram positif dan Gram negatif ini yang menjadi penyebab terjadinya perbedaan dalam kemampuan campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa untuk berpenetrasi ke dalam membran sitoplasma yang merupakan sisi aktif dari kerja antibakteri asam lemak dan turunannya. Tingginya efek antibakteri dari metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa diduga karena adanya efek sinergi dari semua komponen yang terdapat pada metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa (Wang et al. 1993; August 2000;

86 74 dan Mappiratu 2002), yaitu asam lemak monokaprilin (C8:0), monokaprat (C10:0), monolaurat (C12:0) dan monomeristin (C14:0) dari MAG minyak kelapa yang dilaporkan memiliki sifat antimikroba, maupun berbagai komponen asam organik seperti propionat, asetat, sitrat dan laktat dari metabolit Lb. plantarum kik. Selain itu efek sinergi ini menyebabkan antibakteri dari campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa memiliki spektrum penghambatan yang besar dibanding penggunaannya secara tunggal. Menurut Ultee et al. (1998) mekanisme kerja dari senyawa antimikroba ada yang memiliki spektrum luas dan ada pula yang memiliki spektrum sempit dan hanya efektif terhadap mikroorganisme tertentu. Selanjutnya dinyatakan bahwa mekanisme yang dimaksud adalah mekanisme penghambatan yang berhubungan dengan kemampuan suatu senyawa antimikroba untuk mempengaruhi dinding sel. Pengaruh terhadap dinding sel dapat terjadi akibat akumulasi asam lemak maupun asam organik dari campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa yang dalam bentuk tidak terdisosiasi akan menyebabkan perubahan terhadap komposisi penyusun dinding sel. Senyawa aktif yang terdapat dalam campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa disamping bereaksi dengan dinding sel bakteri dapat pula bereaksi dengan membran sel, yaitu dengan menyerang membran sitoplasma dan mempengaruhi integritas membran sitoplasma sehingga mengakibatkan kebocoran materi intraseluler. Adanya gugus hidrofobik pada campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa akan menyebabkan perubahan komposisi dan pelarutan pada membran sel yang akhirnya membran mengalami kerusakan. Keadaan inilah yang menyebabkan pada konsentrasi tertentu, campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa mampu menghambat pertumbuhan bakteri uji yang ditandai dengan tidak terjadinya kenaikan jumlah koloni bakteri ketika dikontakkan selama 24 jam. Asam organik menurut Naidu dan Clemens (2000) mampu menghambat sel bakteri karena kemampuannya dalam meningkatkan aliran proton ke dalam sel, sehingga menembus membran yang mengakibatkan terganggunya fungsi kimiostatik sel seperti gangguan pada transport asam amino. Adanya gangguan pada asam amino ini akan mengakibatkan sintesis protein yang diperlukan pada proses germinasi juga terhambat.

87 75 Pengaruh campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa terhadap berat miselia Aspergillus flavus Pengaruh campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa maupun penggunaan tunggal dari campuran metbolit Lb. plantarum kik dan MAG minyak kelapa terhadap berat kering miselia kapang Aspergillus flavus ditentukan berdasarkan berat kering miselia. Hal ini disebabkan oleh pertumbuhan kapang berbanding lurus dengan produksi miselia. Hasil pengukuran berat miselia kapang terlihat pada Gambar 5.4 (Lampiran 8a 8c). Campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa pada berbagai konsentrasi menurunkan berat miselia kapang. Pada Gambar 5.4 terlihat bahwa semakin tinggi konsentrasi yang digunakan semakin tinggi pula penurunan berat miselia kapang. Hal ini terjadi baik pada penggunaan tunggal dari Lb. plantarum kik, MAG minyak kelapa maupun penggunaan campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa. Penurunan berat miselia kapang terbesar diperoleh pada penggunaan campuran metabolit Lb. plantarum kikmag (2,75 mg/ml) kemudian diikuti oleh MAG minyak kelapa (1,54 mg/ml), metabolit Lb. plantarum kik (1,33 mg/ml) sedang perlakuan kontrol (tanpa penggunaan antikapang) tidak ditemukan penurunan berat miselia kapang. Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas antikapang campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa lebih kuat dari pada aktivitas antikapang dari campuran metabolit Lb. plantarum kik atau MAG minyak kelapa secara tunggal. Berdasarkan hasil uji statistik terhadap perlakuan konsentrasi antikapang menunjukkan perbedaan sangat nyata pada P<0,01 (Lampiran 29). Perlakuan 15% sudah memberikan penurunan berat miselia kapang yang cukup berarti dan tidak berbeda dengan penurunan berat miselia yang diperoleh pada perlakuan 20%. Tingginya aktivitas antikapang dari campuran metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa dibanding dengan perlakuan antikapang secara tunggal disebabkan adanya efek sinergi dari metabolit yang dihasilkan oleh bakteri Lb. plantarum kik dan asamasam lemak yang terdapat dalam MAG minyak kelapa. Beberapa penelitian melaporkan bahwa bakteri asam laktat menghasilkan substansi dengan berat molekul rendah yang memiliki aktivitas antikapang, antara lain asam phenyllactic, asam phydroksi fenillaktik, asam benzoat, metilhidantoin, asam laktat, asam asetat maupun asam sitrat (Sjogren et al. 2003).

88 Plantarum kikmag Plantarum kik MAG Berat miselia (mg/ml) Konsentrasi antikapang (%) Gambar 5.4. Berat kering miselia kapang Aspergillus flavus (mg/ml) yang diberi metabolit Lb. plantarum kik, MAG dan campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa Pada MAG minyak kelapa (Kabara 1993) yang berperan adalah asam laurat (C12:0) dan asam kaprat (C10:0) maupun asam kaprilat (C8:0). Mappiratu (1999) melaporkan efek antikapang dari MAG minyak kelapa tidak hanya berasal dari monolaurat tapi juga berasal dari monokaprilin, monokaprin dan monomeristin dan yang paling dominan adalah monokaprin. Diduga asamasam lemak tersebut memiliki aktivitas seperti detergen (Kabara 1993) yang akan mempengaruhi struktur membran sel kapang dengan meningkatnya permeabilitas membran dan terbebasnya elektrolit serta protein intraseluler yang mengakibatkan disintegrasi sitoplasma sel kapang. Penggunaan antikapang dari campuran metabolit Lb. plantarum kik dan MAG minyak kelapa secara tunggal menunjukkan berat miselia yang rendah dibanding dengan penggunaan campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa. Pada penggunaan metabolit Lb. plantarum kik secara tunggal dengan konsentrasi 5%, penurunan berat miselia kapang sebesar 0,35 mg/ml, sedangkan pada konsentrasi yang sama MAG minyak kelapa dapat mereduksi berat miselia kapang sebesar 0,76 mg/ml. Rendahnya aktivitas antikapang dari campuran metabolit Lb. plantarum kik dalam penelitian ini diduga karena komponen yang bersifat antikapang sebagian besar hanya berupa asamasam

89 77 organik (asam laktat, asetat, sitrat dan propionat). Hasil penelitian yang dilakukan oleh Sjogren et al. (2003) menemukan bahwa aktivitas antikapang dari metabolit BAL sebagian besar ditentukan oleh adanya substansi dengan berat molekul rendah, antara lain asam fenillaktik, asam phydroksi fenil laktat, metil hidantoin. Roy et al. (1996) melaporkan bahwa efek antikapang dari BAL tidak hanya disebabkan oleh asam organik tetapi juga karena adanya senyawa protein dari metabolit BAL. Cabo et al. (2002) menemukan efek penghambatan dari Lb. plantarum yang lebih rendah terhadap kapang Aspergillus versicolor dibandingkan Lb. brevis. Lebih lanjut dijelaskan bahwa efek penghambatan yang lebih besar dari Lb. brevis dibandingkan Lb. plantarum karena konsentrasi dari asam organik yang dihasilkan oleh kedua jenis BAL tersebut berbeda. Pada Lb. brevis konsentrasi asam asetat yang dihasilkan lebih tinggi dibandingkan dengan konsentrasi asam laktat, sebaliknya pada Lb. plantarum asam laktat yang dihasilkan lebih besar dari pada asam asetat. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa konsentrasi yang dibutuhkan oleh campuran metabolit Lb. plantarum kikmag untuk menghambat kapang lebih besar dari pada bakteri. Dengan kata lain dapt dikatakan bahwa aktivitas antibakteri campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa lebih besar dari pada aktivitas antikapang. Sisi aktif mekanisme kerja dari campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa adalah pada membran sitoplasma. Perbedaan komponen membran sitoplasma pada sel prokariot (bakteri) dan eukariot (kapang) terlertak pada jenis fosfolipid dan protein yang menyusun membran tersebut, atau kemungkinan adanya perbedaan pada komponen penyusun dari dinding sel yang menyebabkan terjadinya perbedaan dalam penghambatan bakteri dan kapang. KESIMPULAN Campuran metabolit Lb. plantarum kik MAG memiliki aktivitas antibakteri yang berbeda terhadap masingmasing bakteri uji. Aktivitas campuran metabolit Lb. plantarum kikmag lebih kuat terhadap L. monocytogenes dan B. cereus dari pada terhadap bakteri Gram negatif (S. Typhimurium dan E. coli) pada konsentrasi Lb. plantarum kikmag yang sama. Aktivitas antibakteri tersebut ditunjukkan

90 78 dengan diameter penghambatan yang berkisar antara 20,2 30,7 mm untuk keempat bakteri uji. Nilai MIC untuk masingmasing bakteri uji adalah 1,2%; 1,4 %; 2,5 % dan 3%, berturutturut untuk bakteri L. monocytogenes, B. cereus, S. Typhimurium dan E. coli. Metabolit Lb. plantarum kikmag dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji, yaitu mencapai 2 4 log CFU/ml selama waktu kontak 24 jam. Efek penghambatan Lb. plantarum kik MAG terhadap Gram negatif berkisar 22,5 kali lebih besar dibandingkan dengan bakteri Gram positif. Kemampuan campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa dalam menghambat bakteri lebih besar dibandingkan dengan kapang. Reduksi berat miselia kapang lebih tinggi pada penggunaan campuran metabolit Lb. plantarum kik dan MAG minyak kelapa dari pada penggunaan secara tunggal. Penggunaan secara tunggal menunjukkan kemampuan mereduksi miselia kapang hanya sebesar 0,351,54 mg/ml sedangkan penggunaan campuran dari metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa diperoleh sebesar 0,862,75 mg/ml atau hampir 2 kali lebih kuat pada penggunaan 520%. DAFTAR PUSTAKA Ardiansyah Aktivitas antimikroba ekstrak daun beluntas (Plucea indica L.) dan stabilitas aktivitasnya pada berbagai konsentrasi garam dan tingkat ph. J. Ilmu dan Teknol Pangan XIV (2): Alakomi HL, Skytta E, Saarela M, MattilaSandholm T Lactic acid permeabilizes Gramnegatif bacteria by disrupting the outer membrane. Appl. Environ. Microbiol. 66: Baker RC, Kline D, Poon W, Vadehra DH Antimicrobial properties of lauricidin in mechanically deboned chicken and minced fish. J. Food Safety 4: Blaszyk M, Richard A, Holley Interaction of monolaurin, eugenol and sodium citrate on growth of common meat spoilage and pathogenic organisms. J. Food Microbiology 39: Cabo ML, Braber AF, Koendraad PM Apparent antifungal activity of several lactic acid bacteria against penicillium discolor is due to acetic acid in the medium. J. Food Protec. 65: Catsara M, Danjoy JP, Seynave R Temperature and action of laurilac on multlipication of Salmonella in minced meat. Bull. Acad. Vef. Fr 60:

91 79 Davidson PM, Branen AL Antimicrobial in Food. Mercel Dekker, New York. Duxbury DD Combination emulsifier/acidulant extends cheese sauce shelf life. Food Proc. 46(9):3839. Fardiaz S Mikrobiologi Pengolahan Pangan Lanjut. Bogor PAU Pangan dan Gizi Institut Pertanian Bogor. Gourama H, Bullerman LB Inhibition on growth and aflatoxin production of Aspergillus flavus by Lactobacillus spp. J. Food Protect. 58: Hamilton RJ, Rosella JB Analysis of oil and fats. Elsivier Applied Science Publisher London. 58: Hidayat A Mempelajari Potensi Antimikotik Lactobacillus plantarum Sa28 terhadap pertumbuhan Aspergillus flavus. Skripsi. Fakultas Teknologi Pertanian, IPB, Bogor. Indriyati Kajian Aktivitas Antimikroba Campuran Mono dan Diasilgliserol Hasil Pemanfaatan Destilat Asam Lemak Minyak Kelapa. Thesis Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Jenie BSL Peranan bakteri asam laktat sebagai pengawet hayati makanan. J. Ilmu dan Teknol Pangan 20:6073. Kabara J.J Medium Chain Fatty Acids and Esters. Di dalam: Davidson PM, Branen AL (ed). Antimicrobial in Food 2 nd Ed. Marcell Dekker, New York. Karunaratne A, Wezenberg E, Bullerman LB Inhibition of mold growth and aflatoksin production by Lactobacillus spp. J. Food Protect. 53: Kubo I, Murphi H, Himejima M Antimicrobial activity of green tea flavor component and their combination effects. J. Agric. and Food Chem. 40: Lee JY, Kim YS, Shin DH Antimicrobial Synergistic Effect of linolenic acid and monoglyceride against Bacillus cereus and Staphylococcus aureus. J. Agric. and Food Chem. 50: Lisker N, Poster N Antifungal activity of lauricidin and related compounds. J. Food Safety 4:2732. Parish ME, Davidson PM Method for evaluation. Di dalam: Davidson PM, Branen AL (ed). Antimicrobial in food 2 nd Ed. Marcell Dekker, New York. Mappiratu, Fardiaz, Umrah, Ijirana Pemanfaatan sabun hasil samping pengolahan minyak kelapa dalam pembuatan monoasilgliserol menggunakan lipase Aspergillus niger amobil isolat kapang kopra. Laporan Riset Unggulan Terpadu VIII bidang teknologi hasil pertanian. Naidu AS, Clemens RA Lactic Acid. Di dalam: Naidu AS(Ed). Natural Food Antimicrobial System. CRC Press, LLC. Naufalin R Kajian Sifat Antimikroba Ekstrak Bunga Kecombrang (Nicolaia speciosa Horan) Terhadap Berbagai Mikroba Patogen Dan Perusak Pangan. Disertasi Sekolah Pascasarjana Intitut Pertanian Bogor. Bogor.

92 80 Ouattara B, Simard RE, Holley RA, Piette GJP, Begin A Antibacterial activity of selected fatty acid and essensial oils against six meat spoilage organisms. J. Food Microbiol. 37: Salminen S, Wright AV (eds) Lactic Acid Bacteria: Micribiology and Functional Aspects. 2 nd edition. Marcel Dekker Inc. New York. Shibasaki I Recent trends in the development of food preservatives. J. Food Safety 4:3539. Situngkir R Aplikasi kultur bakteri asam laktat dengan garam untuk mereduksi Aspergillus flavus dan aflatoksin pada proses pengolahan kacang asin. Thesis Sekolah Pascasarjana Intitut Pertanian Bogor, Bogor. Southwell LA, Hayes AJ, Markham J, Leach DN The search for optimally bioactive Australian tea tree oil. Acta Horticulture 334: Sjogren J, Jesper M, Broberg A, Schnurer J, Kenne L Antifungal 3 Hydroxy Fatty Acids from Lactobacillus plantarum MiLAB. App. and Env. Microbio.Vol. 69, No12: Ultee A, Goris LGM, Smid EJ Bacterial activity of carvacrol towards the foodborne pathogen Bacillus cereus. J. App. Microbiol. 85: Warneclo T, Gill RT Organic Acid Toxicity, Tolerance, and Production in E. coli Biorefining Application. Microbial Cell Factories 4:25.

93 6. MEKANISME KERJA ANTIBAKTERI CAMPURAN METABOLIT Lb. plantarum kik MAG MINYAK KELAPA TERHADAP BAKTERI PATOGEN PANGAN ABSTRAK Mekanisme antibakteri campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa dipelajari pada dosis MIC yang telah diperoleh pada penelitian tahapan sebelumnya. Dosis 1 dan 2 MIC dapat meningkatkan kebocoran terhadap bakteri Gram positif (L. monocytogenes dan B. cereus) maupun terhadap bakteri Gram negatif (S. Typhimurium). Kebocoran sel yang diukur dengan spektrofotometer menunjukkan peningkatan absorbansi sebesar 0,33 atau dari 0,33 menjadi 0,66 untuk asam nukleat dan 0,46 atau dari 0,41 menjadi 0,87 untuk protein. Kebocoran ionion logam ditunjukkan dengan peningkatan sebesar 40,2% untuk ion Ca 2+ dan 22,1% untuk ion K +. Pengamatan kerusakan sel dengan SEM (Scanning Electron Microscopy) terhadap L. monocytogenes dan S. Typhimurium menunjukkan adanya perubahan morfologi sel baik pada konsentrasi 1 MIC maupun pada konsentrasi 2 MIC, dengan perubahan yang paling parah terjadi pada pemberian dosis campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa 2 MIC. PENDAHULUAN Inaktivasi bakteri merupakan hasil interaksi suatu senyawa anti mikroba dengan bagian tertentu dari sel mikroba. Interaksi senyawa antimikroba tersebut dapat menyebabkan sejumlah perubahan atau kerusakan sel bakteri yang akhirnya dapat mempengaruhi fungsi metabolisme sel, bahkan pada kerusakan yang parah dapat menimbulkan kematian sel bakteri. Aktivitas suatu senyawa antimikroba dapat menyebabkan rusaknya permeabilitas membran dan menimbulkan kebocoran pada komponen intraseluler, seperti natrium glutamat, natrium hidrogen fosfat, nukleotida, kalium dan fosfat organik (Nychas dan Tassou 2000). Perubahan atau kerusakan oleh suatu senyawa antimikroba pada sel bakteri umumnya dinyatakan dalam bentuk kebocoran sel, perubahan ukuran dan ketebalan dinding sel, maupun penampakan sitoplasma. Dari kebocoran sel dapat diamati derajat kerusakan dinding dan membran sel. Derajat kerusakan dinding sel diukur dari jumlah ion Ca 2+ yang terdapat pada dinding sel, sedangkan derajat kerusakan membran dapat diukur dari bahanbahan yang dilepaskan oleh sel yang dapat diserap pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm (Bunduki et al. 1995). Kerusakan sel oleh senyawa antibakteri telah diamati oleh beberapa peneliti

94 82 sebelumnya dengan menggunakan SEM, diantaranya Naufalin (2005) pada ekstrak bunga kecombrang, dan Parhusip (2006) pada ekstrak buah andaliman terhadap berbagai bakteri Gram positif dan Gram negatif. Hasil penelitian tersebut umumnya dilaporkan bahwa kerusakan pada sel diawali dengan rusaknya membran sel yang berlanjut dengan keluarnya material isi sel dan akhirnya sel mengalami kematian. Menurut Park et al. (2003) komponen sel yang bocor keluar sel dapat diukur pada panjang gelombang 260 nm seperti DNA (purin, pirimidin ribonukleotida), sedangkan pada panjang gelombang 280 nm dapat mengukur tirosin dan triptofan. Burth dan Reinders (2003) menyatakan bahwa kerusakan dinding sel akibat interaksi dengan senyawa antimikroba dapat juga diamati dengan menggunakan Scanning electron microscopy (SEM ). Campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa berpotensi menghambat ataupun menginaktifkan mikroba patogen. Hal ini didasarkan pada adanya berberapa komponen di dalam campuran metabolit Lb. plantarum kik MAG yang bersifat sebagai antimikroba, seperti asam laktat, asam asetat, asam sitrat maupun asam lemak dalam MAG minyak kelapa berupa asam kaprilat, asam kaprat, laurat maupun miristat. Semua komponen tersebut di atas telah terbukti aktivitasnya sebagai senyawa antimikroba berdasarkan hasil penelitian dari Wang et al. (1993), Mappiratu et al. (2002), dan Jenie et al. (2001). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui mekanisme kerja antibakteri campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa terhadap bakteri patogen (L. monocytogenes, B. cereus dan S. Typhimurium) dengan pengukuran protein, asam nukleat dan ionion logam dari bakteri uji serta perubahan morfologi sel menggunakan SEM. METODOLOGI Bahan dan Alat Isolat bakteri asam laktat yang digunakan adalah Lb. plantarum kik yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Pangan, sedangkan MAG minyak kelapa diperoleh dari Laboratorium Agroindustri Fakultas Pertanian Universitas Tadulako Palu (Sulawesi Tengah).

95 83 Bakteri uji yang digunakan adalah L. monocytogenes (FNCC 0156), Bacillus aureus (FNCC 057) dan S. Typhimurium (FNCC 0734) yang diperoleh dari Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi UGM. Semua media mikrobiologi diperoleh dari Oxoid Ltd. Pengamatan dengan SEM dilakukan di Laboratorium Naval Medicine Research Unit (NAMRU) dan Laboratorium Fisika Biomaterial Universitas Indonesia (UI). Persiapan isolat bakteri uji Sebanyak satu ose bakteri dari stok agar miring diinokulasikan ke dalam medium nutrien broth (NB) dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Sebanyak 1 ml kultur bakteri ditambahkan ke dalam 9 ml media NB dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Kultur bakteri uji sebanyak 10 6 CFU/ml digunakan dalam pengujian kebocoran protein dan asam nukleat, serta perubahan morfologi sel bakteri yang diberi campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa. Produksi metabolit bakteri asam laktat Produksi metabolit Lb. plantarum kik dipersiapkan secara bertahap dengan mengikuti metode Jenie et al. (2000) sebagai berikut: kultur Lb. plantarum kik sebanyak 1 ml diambil dari stok masingmasing dan diinokulasi ke dalam 9 ml MRS Broth, diinkubasi pada suhu 37 o C selama 2 hari. Sebanyak 4% (v/v) kultur tersebut diinokulasikan ke dalam media steril MRSB modifikasi (MRSB di tambah 2% glukosa, 2% ekstrak khamir, 1% tripton) selanjutnya diinkubasi selama 2 hari pada suhu 37 o C. Produk fermentasi dipisahkan dari masa sel dengan cara sentrifus yang berlangsung pada rpm selama 15 menit. Supernatan yang terbentuk dipisahkan dari endapan dengan menyaring menggunakan kertas saring whatman ukuran 0.22 µm, kemudian dicampur dengan MAG minyak kelapa dengan perbandingan 5:3 atas dasar v/v.

96 84 Analisis kebocoran protein dan asam nukleat (Bunduki et al. 1995) Suspensi bakteri uji yang telah ditumbuhkan selama 24 jam dalam media nutrien broth sebanyak 10 ml diambil dan disentrifus dengan kecepatan 3500 rpm selama 20 menit. Filtrat dibuang lalu pelet dalam tabung dicuci dengan buffer fosfat ph 7,0 sebanyak 2 kali, kemudian disuspensikan di dalam 10 ml buffer fosfat ph 7,0. Selanjutnya ditambahkan campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa dengan dosis 1 MIC, 2 MIC dan kontrol, dan diinkubasi dalam inkubator goyang selama 24 jam. Suspensi disentrifus dengan kecepatan 3500 rpm selama 20 menit, lalu disaring dengan tujuan untuk memisahkan supernatan dari sel. Cairan supernatan diambil dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm dengan menggunakan spektrofotometer. Kebocoran ionion logam ( Park 1996 ) Untuk analisis kebocoran ionion diukur dalam bentuk ion Ca 2+ dan K + yang dilepaskan oleh sel bakteri akibat pemberian metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa. Analisis kebocoran ion dilakukan pada pelet bakteri yang dipersiapkan seperti pada pengukuran kebocoran protein dan asam nukleat. Kebocoran dinyatakan dengan terukurnya ionion logam yang terdapat pada bakteri uji setelah dikontakkan dengan metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa pada berbagai tingkat (1 dan 2 MIC) dibandingkan dengan kontrol. Kebocoran ionion K + dan Ca 2+ dideteksi dengan menggunakan AAS (Atomic Absorption Spectrophotometer). Pelet sel hasil kontak dengan metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa dicuci dengan air bebas ion steril sebanyak 3 kali. Pelet yang telah bersih ditimbang, diabukan dengan cara pengabuan basah. Pengamatan morfologi sel dengan SEM (Scanning Electron Microscopy ) ( JEOL 1995, Noor 2001). Analisis kerusakan morfologi sel dimaksudkan untuk mempelajari perubahan morfologi dan struktur sel dari L. monocytogenes dan S. Typhimurium akibat pengaruh campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa yang meliputi pola kerusakan morfologi dan struktur bakteri sel, serta kerusakan dinding sel dan membran sitoplasma.

97 85 Metode SEM dilakukan dengan cara suspensi sel bakteri uji yang telah diberi perlakuan 0 MIC, 1 MIC dan 2 MIC diinkubasi selama 24 jam pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 37 o C untuk B. cereus dan suhu ruang untuk L. monocytogenes. Setelah itu suspensi sel disentrifus pada 3500 rpm selama 20 menit, supernatan dibuang dan diambil peletnya untuk kemudian dicuci dengan buffer fosfat sebanyak 2 kali. Pelet selanjutnya difiksasi dengan glutaraldehida 2,5% dalam (0,1 M buffer natrium kakodilat ph 7,2), dibiarkan selama 1,5 jam, dicuci dua kali dengan buffer kakodilat 0,05 M ph 7,2 selama 20 menit untuk masingmasing. Selanjutnya difiksasi dengan osmium tetraoksida 1% dalam buffer cacodilat 0,05%, ph 7,2 selama 1 2 menit, lalu dicuci dengan akuabides (DDH 2 O) 3 kali masingmasing selama 2 menit, dikeringkan dengan etanol pada berbagai konsentrasi yang dimulai dari konsentrasi 25, 50, 75 kemudian 100% sebanyak tiga kali masingmasing selama 10 menit. Spesimen diambil dan dilewatkan pada membran 0,2 µm untuk selanjutnya direkatkan pada stub aluminium dan dilapisi dengan emas melalui proses vakum (67Pa) selama 20 menit. Selanjutnya sampel diamati di bawah SEM tipe JEOL HASIL DAN PEMBAHASAN Kebocoran protein dan asam nukleat Mekanisme kerja antimikroba dari campuran metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa dapat diamati melalui analisis kebocoran sel mikroba uji. Untuk itu dilakukan analisis kebocoran asam nukleat melalui pengamatan pada panjang gelombang 260 nm, dan analisis kebocoran protein pada panjang gelombang 280 nm. Hasil pengamatan yang terlihat pada Gambar 6.1a6.1c (Lampiran 9a9c) menunjukkan bahwa dengan meningkatnya dosis MIC, nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm maupun pada panjang gelombang 280 nm semakin meningkat pula. Peningkatan nilai absorbansi ini menunjukkan peningkatan jumlah senyawa yang dikeluarkan oleh sel bakteri, yang berarti antibakteri campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa merusak membran sel dalam aktivitasnya sebagai antimikroba. Pada sel L. monocytogenes dan B. cereus, nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm lebih tinggi jika dibandingkan dengan nilai

98 86 absorbansi S. Typhimurium. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm akan semakin meningkat dengan semakin tinggi dosis MIC. Nilai absorbansi (nm) : Dosis MIC 260 nm 280 nm Gambar 6.1a. Pengaruh dosis campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa terhadap kebocoran protein (280 nm) dan asam nukleat (260 nm) dari sel L. monocytogenes Menurut Lin et al. (2000), senyawasenyawa yang terserap pada panjang gelombang 260 nm adalah RNA dan turunan RNA, yaitu nukleotida. Pada panjang gelombang 280 nm senyawa yang terserap diidentifikasi sebagai protein. Park et al. (2003) menyatakan bahwa senyawasenyawa yang dapat terdeteksi pada panjang gelombang 260 diantaranya adalah purin, pirimidin dan ribonukleotida, sedangkan pada panjang gelombang 280 nm senyawa yang terserap dapat mendeteksi asam amino, seperti tirosin dan triptofan. Hal ini menunjukkan adanya perbedaan kerusakan sel antara bakteri Gram positif (L. monocytogenes dan B. cereus) dengan bakteri Gram negatif (S. Typhimurium). Menurut Nychas (1995), kebocoran sel adalah fenomena umum yang disebabkan oleh beberapa senyawa antimikroba. Selanjutnya, Bunduki et al. (1995) menemukan adanya perubahan jumlah asam nukleat dan protein dalam medium pada L. monocytogenes yang mengalami kerusakan sublethal panas (56 o C, 20 menit) atau pemberian sanitaiser klorin (100 ppm, 20 menit). Hasil penelitian ini memperlihatkan bahwa kebocoran sel pada bakteri Gram positif seperti L. monocytogenes dan B. cereus maupun bakteri Gram negatif

99 87 S. Typhimurium akibat pemberian campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa, protein yang dilepaskan lebih tinggi dibandingkan dengan asam nukleat yang berarti sel bakteri mengalami kebocoran senyawa protein lebih banyak dari pada asam nukleat. Nilai absorbansi (nm) Dosis MIC 260 nm 280 nm Gambar 6.1b. Pengaruh dosis campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa terhadap kebocoran protein (280 nm) dan asam nukleat (260 nm) dari sel B. cereus nm 280 nm Nilai absorbansi (nm) Dosis MIC Gambar 6.1c. Pengaruh dosis campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa terhadap kebocoran protein (280 nm) dan asam nukleat (260 nm) dari sel S. Typhimurium

100 88 Davidson dan Branen (1994) menyatakan bahwa senyawa yang terdeteksi pada kebocoran sel Pseudomonas spp. yang diberi BHA (butylated hydroxyanisole) lebih banyak pada panjang gelombang 280 nm dibandingkan pada panjang gelombang 260 nm. Dalam penelitian ini kebocoran sel disebabkan oleh adanya interaksi antara campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa dengan komponen membran luar sel bakteri terutama komponen fosfolipida yang membentuk pori pada membran sel bakteri. Jika pori membran membesar karena adanya perubahan fosfolipida, molekul yang berukuran lebih besar dapat keluar dari membran sel atau sifat semipermeabel membran mengalami perubahan. Gangguan permeabilitas membran pada sel bakteri menyebabkan terjadinya kebocoran protein dan asam nukleat. Kebocoran sel bakteri akibat penggunaan campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa dapat pula diakibatkan oleh rusaknya ikatan hidrofobik komponen penyusun membran sel, seperti protein, fosfolipid serta larutnya komponenkomponen yang berikatan secara hidrofilik dan hidrofobik (Kim et al. 1995). Keadaan ini meningkatkan permeabilitas membran sel, sehingga memudahkan masuknya komponen antimikroba ke dalam sel serta keluarnya substansi sel seperti protein dan asam nukleat yang menyebabkan kerusakan sel (Lin et al. 2000). Kabara (1993) melaporkan bahwa asam laurat dalam MAG minyak kelapa dapat menyebabkan kerusakan membran serta kebocoran protein intraseluler dan asam nukleat, sehingga terjadi penurunan aktivitas enzimatik yang berperan dalam metabolisme. Wang dan Johnson (1993) menyatakan bahwa sifat lipofilik dari MAG minyak kelapa mampu menembus membran sitoplasma dan menghambat aktivitas enzim yang berperan dalam produksi energi dan transport nutrisi. Mappiratu et al. (2002), August (2000) dan Indriyati (2003) menemukan efek penghambatan asam laurat yang lebih besar terhadap bakteri Gram positif dibanding dengan bakteri Gram negatif, akan tetapi menurut Kabara (1994) aktivitas ini dapat ditingkatkan dengan penambahan asam seperti asam sitrat dan asam polifosfat yang berfungsi sebagai pengkelat. Rohani Razavi dan Griffith (1994) melaporkan perbedaan komponen penyusun dinding sel dapat menyebabkan asam laurat efektif terhadap semua bakteri Gram positif, sedangkan Gram negatif

101 89 akan efektif dengan adanya pengkelat seperti EDTA (Etilen Diamin Tetra Asetat). Peningkatan aktivitas monogliserida oleh asam atau EDTA disebabkan oleh kemampuannya dalam mengkelat, sehingga dapat merusak dan membebaskan sejumlah lapisan lipopolisakarida dari dinding sel mikroba dan menyebabkan mikroba bersifat seperti bakteri Gram positif (Kabara 1994). Aktivasi antimikroba dari MAG minyak kelapa selain karena dalam bentuk tidak terdisosiasi dan adanya gugus ester (Davidson dan Branen 1993) juga disebabkan oleh adanya gugus hidroksil (Kabara 1994), gugus hidrosil ini bersifat racun bagi protoplasma sel, karena menembus dan merusak dinding sel serta mendenaturasi protein enzim dalam sitoplasma dengan membentuk ikatan hidrogen pada sisi aktif enzim. Menurut Surono (2004), efek antimikroba dari asam organik terutama dalam bentuk tidak terdisosiasi menyebabkan turunnya ph sitoplasma yang menyebabkan metabolisme sel terganggu. Telaah lebih lanjut tentang nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 dan 280 nm memperlihatkan nilai absorbansi untuk L. monocytogenes dan B. cereus relatif lebih besar (Gambar 6.1a dan 6.1b) dibandingkan dengan bakteri uji S.Typhimurium (Gambar 6.1c), baik pada penggunaan 1 MIC maupun penggunaan 2 MIC. Hal ini menunjukkan bahwa L. monocytogenes dan B. cereus relatif lebih peka terhadap metabolit BALMAG dibandingkan dengan S. Typhimurium, dimana nilai absorbansi sebanding dengan konsentrasi, yang berarti semakin tinggi absorbansi semakin banyak asam nukleat maupun protein yang keluar dari sel. Hal ini sejalan dengan hasil penelitian penentuan nilai MIC, dimana nilai MIC bakteri Gram positif sekitar separuh lebih kecil yaitu 1,2% dan 1,4% untuk L. monocytogenes dan B. cereus dibandingkan dengan nilai MIC bakteri Gram negatif S. Typhimurium sebesar 2,5%. Hasil penelitian ini membuktikan bahwa campuran metabolit Lb. plantarum kikmag mampu merusak protein maupun material genetik dari sel mikroba karena asam nukleat merupakan penyusun utama dari DNA. Diduga proses ini terjadi karena adanya pelekatan antara senyawa antibakteri pada permukaan sel atau senyawa tersebut berdifusi ke dalam sel (Kanazawa et al. 1995).

102 90 Kebocoran IonIon Logam Ion K + merupakan kation utama yang terkandung dalam sitoplasma pada sel yang sedang tumbuh, sedangkan ion Ca 2+ dan Mg 2+ terdapat di bagian sitosol yaitu cairan sitoplasma. Kedua jenis ion ini juga ditemukan pada dinding sel yang turut berperan dalam aktivitas enzim (Ultee 1998). Ion K + memiliki peran dalam mengaktivasi enzim sitoplasma, menjaga tekanan turgor serta mengatur ph sitoplasma. Ion Ca 2+ dan Mg 2+ berfungsi menghubungkan lipopolisakarida (LPS) pada dinding sel bakteri Gram negatif (Nikaido dan Vaara, 1985). Pada bakteri Gram positif ion Ca 2+ dan Mg 2+ berfungsi menghubungkan asam teikoat sebagai penyusun sel (Lay dan Hastowo 1992). Pada penggunaan campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa 1 MIC dan 2 MIC jumlah ion Ca 2+ dan ion K + yang dilepaskan oleh sel L. monocytogenes, B. cereus maupun S. Typhimurium lebih besar dibandingkan dengan kontrol (Gambar 6.2a 6.2c, Lampiran 10a 10c). Hal ini menunjukkan bahwa metabolit Lb. plantarum kikmag menyebabkan gangguan pada dinding sel dengan melepaskan ion Ca 2+, dan kebocoran pada membran sel dengan melepaskan protein, asam nukleat dan ion K + ke lingkungan. Penelitian ini sejalan dengan temuan Heipieper et al. (1996) terhadap Pseudomonas putida P8 dengan menggunakan senyawa fenol yang telah melepaskan ion K + secara nyata ke lingkungan luar. Lebih lanjut dinyatakan bahwa senyawa fenol mempunyai kemampuan dalam bereaksi dengan komponen fosfolipid dari membran luar sehingga sel mengalami lisis. Lisisnya sel diakibatkan melemahnya aktivitas enzimenzim yang mensintesis dinding sel dan porositas meningkat. Levlinesia (2004) juga menemukan kebocoran ionion K + dan Ca 2+ pada sel S. aureus dan P. fluorescens yang dikontakkan dengan ekstrak etil asetat biji atung, dimana pada dosis tinggi jumlah ionion yang dilepaskan juga semakin besar. Lebih lanjut dilaporkan bahwa jumlah ion Ca 2+ dan K + yang dilepaskan lebih besar pada bakteri Gram positif (S. aureus) dibanding dengan Gram negatif (P. fluorescens). Dalam penelitian ini jumlah ion K + dan ion Ca 2+ yang terukur pada L. monocytogenes dan B. cereus juga lebih besar dibandingkan dengan S. Typhimurium.

103 91 Menurut Friedman et al. (2004) beberapa senyawa antibakteri dapat merusak integritas dari membran sel bakteri dengan cara merusak ikatan kation divalen Ca 2+ dan Mg 2+ dengan lipopolisakarida pada bakteri Gram negatif, sedang pada bakteri Gram positif kationkation ini berfungsi menghubungkan asam teikoat sebagai penyusun sel. Ca2+ K+ Kebocoran ion (%) Dosis MIC Gambar 6.2a. Pengaruh dosis campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa terhadap kebocoran ionion logam dari sel L. monocytogenes Ca2+ K Kebocoran ion (%) Dosis MIC Gambar 6.2b. Pengaruh dosis campuran metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa terhadap kebocoran ionion logam dari sel B. cereus

104 92 Terlepasnya kation tersebut dari membran luar menyebabkan masuknya senyawa antibakteri ke dalam sel (Stratford 2000). Russel (1984) menyatakan bahwa bentuk kerusakan dari membran sel diperlihatkan dengan keluarnya kandungan dari bahanbahan yang terserap pada panjang gelombang 260 nm, seperti pentosa, atau asamasam amino atau ion K +. Ca2+ K+ Kebocoran ion (%) Dosis MIC Gambar 6.2c. Pengaruh dosis campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa terhadap kebocoran ionion logam dari sel S. Typhimurium Ultee et al. (2002) dalam penelitiannya terhadap pengaruh senyawa carvacrol (senyawa tidak terdisosiasi) menemukan adanya pelepasan ion K + dari Bacillus cereus. Selanjutnya dijelaskan bahwa ini terjadi karena senyawa carvacrol masuk kedalam membran sitoplasma karena ph di dalam sitoplasma lebih tinggi menyebabkan pelepasan ion H + dan membawa keluar ion K + akibatnya ion H + di dalam membran sitoplasma meningkat yang akan mengasamkan cairan sitoplasma sementara ion K + berkurang akibatnya aktivitas enzim terganggu dan pada gilirannya energi tidak terbentuk akhirnya sel mengalami kematian. Senyawa yang terdapat dalam campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa seperti asam organik diantaranya asam laktat, asetat, sitrat, dan asamasam lemak jenuh rantai pendek dan menengah diduga kuat penyebab dalam kebocoran sel mikroba yang ditandai dengan keluarnya berbagai komponen seperti protein, asam nukleat, maupun ionion logam yang berperan penting dalam metabolisme sel. Hal ini didasarkan pada pernyataan Stratford (2000) bahwa asam

105 93 asam organik seperti asam sitrat, asam malat, EDTA dan asam laktat maupun asam klorida (Alakomi et al. 2000) dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram negatif dengan mengkelat kation bivalen Ca 2+ dan Mg 2+. Perubahan Morfologi Sel dengan SEM (Scanning electron microscopy) Pengamatan terhadap kerusakan morfologi sel dilakukan terhadap Listeria monocytogenes dan Salmonela Typhimurium setelah dikontakkan dengan senyawa antimikroba metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa dengan dosis 0 MIC, 1 MIC dan 2 MIC. Listeria monocytogenes Sel L. monocytogenes normal berbentuk batang dengan ukuran diameter sel 0,5 0,7 µm dan tidak membentuk spora. Pada Gambar 6.3 terlihat bahwa pada sel bakteri yang diberi perlakuan sebesar 1 MIC (Gambar 6.3b), sel memanjang dan membesar dibanding sel normal (Gambar 6.3a). Bila konsentrasi campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa ditingkatkan menjadi 2 MIC (Gambar 6.3c) terlihat sel mengecil dan berlubang pada bagian dinding sel. Pada sel normal diperoleh ukuran sebesar 1,3 µm (panjang) dengan diameter 0,7 µm, sedangkan perlakuan 1 MIC dan 2 MIC masingmasing diperoleh sebesar 0,6 µm dan 0,4 µm untuk diameter dan 2,6 dan 1 µm untuk panjang sel.. Gambar 6.3a. Bentuk sel normal L. monocytogenes ( X)

106 94 Gambar 6.3b. Pengaruh campuran metabolit Lb. plantarum kikmag pada dosis 1 MIC terhadap morfologi sel L. monocytogenes (20000X) Gambar 6.3c. Pengaruh campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa pada konsentrasi 2 MIC terhadap morfologi sel L. monocytogenes (20.000X) Hal ini diduga karena asam lemak maupun asam organik yang terdapat pada campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa memudahkan masuknya antibakteri ke dalam sel yang selanjutnya akan berinteraksi dengan fosfolipid pada membran menyebabkan permeabilitas meningkat dan hilangnya

107 95 unsur pokok penyusun sel, sehingga terjadi pembengkakan yang berakibat pada kematian sel. Keadaan ini menyebabkan membran sel tidak dapat menahan tekanan dari dalam sitoplasma akibatnya membran bocor, lalu diikuti dengan mengkerutnya sel yang menyebabkan kematian sel. Fenomena kerusakan serupa ditemukan juga oleh Wang dan Davidson (1992), pemberian monolaurin sebesar 100 µg/ml terjadi perubahan morfologi dari L. monocytogenes berupa pemanjangan bila dibandingkan dengan sel normal, dan ketika konsentrasi monolaurin ditingkatkan 200 µg/ml, maka ukuran sel menjadi mengecil diikuti dengan kerusakan di sekitar dinding sel bakteri. Hal serupa juga ditemukan oleh Ultee et al. (2002) yang mengamatai efek sinergi dari karvakrol (asam lemah) dan cymene (senyawa non polar) terhadap B. Cereus. Menurutnya kerusakan sel bakteri oleh senyawa antibakteri menyebabkan pembengkakan sel akibat adanya akumulasi dari senyawa antibakteri lalu diikuti dengan kebocoran dan kematian sel. Kerusakan sel mikroba oleh senyawa antimikroba dapat berbeda tergantung sifat, struktur, serta komposisi kimia dinding dan membran sel. Kerusakan pada dinding sel atau terhambatnya sintesis dinding sel oleh antimikroba akan mengakibatkan lisis pada sel. Pada lingkungan hipertonik kerusakan dinding sel mengakibatkan terbentuknya protoplast (bakteri Gram positif) atau sferoplast (bakteri Gram negatif). Kondisi ini menyebabkan sel membengkak, membran terdesak ke arah dinding sel dan mengakibatkan sel pecah (Jawetz et al. 1996). Salmonela Typhimurium Salmonela Typhimurium Gram negatif berbentuk batang dan tidak membentuk spora, bersifat motil dengan flagela peritrikat berukuran 0,7 1,5 µm (Jay 1997). Pengaruh metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa dapat dilihat pada Gambar 6.4a6.4c. Pada sel yang normal terlihat permukaan sel yang mulus, agak bulat memanjang dengan ukuran diameter 1,2 µm dan panjang 2 µm. Pada penambahan metabolit BALMAG dengan konsentrasi 1 MIC sel nampak memanjang dari sel normal 3 µm, dengan diameter 1,4 µm dan terlihat mulai akan membelah diri. Seharusnya sel yang membelah akan membagi dua semua bahanbahan sel sehingga menjadi 2 sel yang ukuran dan sifatnya sama dengan sel induk.

108 96 Adanya bentuk seperti yang terlihat pada Gambar 6.4b diperkirakan septa sudah terbentuk dan belum membelah akibat dari aktivitas campuran metabolit Lb. plantarum kikmag, padahal septa dibutuhkan untuk memperbanyak diri dengan cara membelah. Bila proses pembelahan septa terganggu, maka proses pertumbuhan juga akan terhambat. Kondisi ini menunjukkan bahwa adanya campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa menyebabkan terjadinya gangguan pada proses reproduksi. Gambar 6.4a. Bentuk sel normal S. Typhimurium ( X) Terdapatnya komponen asam organik dan asam lemak terutama asam laktat dan asam laurat dalam campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa yang bekerja secara sinergi menyebabkan kerusakan membran, kebocoran protein intraseluler dan asam nukleat, serta penurunan aktivitas enzim yang berperan dalam pembentukan material genetik dan proses pembelahan sel. Hal ini sejalan dengan pernyataan Kim et al. (1995) bahwa salah satu kemampuan dari senyawa antimikroba untuk merusak sel adalah dengan mengganggu pembentukan asam nukleat (DNA dan RNA) yang akan mempengaruhi transfer informasi genetik dengan menghambat aktivitas enzim RNA polimerase dan DNA polimerase. Mekanisme selanjutnya menginaktivasi atau merusak materi genetik yang berimplikasi pada proses pembelahan sel untuk perkembangbiakan.

109 97 Gambar 6.4b. Pengaruh campuran metabolit BALMAG pada dosis 1 MIC terhadap morfologi sel S. Typhimurium (15.000X) Gambar 6.4c. Pengaruh campuran metabolit BALMAG pada dosis 2 MIC terhadap morfologi sel Salmonela Typhimurium (15.000X) Pada Gambar 6.4c terlihat bahwa pemberian campuran metabolit Lb. plantarum kikmag pada dosis 2 MIC dapat menyebabkan kerusakan yang lebih parah. Permukaan sel mengalami kerusakan yang lebih besar (permukaan sel terlihat berlubang) dengan ukuran panjang dan diameter yang berbeda dengan perlakuan pada dosis yang lebih kecil.

110 98 Keadaan ini menunjukkan bahwa campuran metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa mampu menimbulkan perubahan permeabilitas membran, dan mengakibatkan cairan sitoplasma merembes keluar sehingga terbentuk ruang antar sel yang akan meningkatkan porositas membran akibat melemahnya dinding sel. Dinding sel yang lisis mengakibatkan keluarnya cairan dalam jumlah besar dan menyebabkan sel mengkerut dan mati. KESIMPULAN Campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa pada dosis 1 dan 2 MIC menyebabkan kerusakan pada dinding dan membran sel dari L. monocytogenes, B.cereus dan S. Typhimurium dengan melepaskan protein dan asam nukleat serta ion K + dan ion Ca 2+ ke lingkungan luar. Jumlah protein, asam nukleat dan ionion yang dilepaskan dipengaruhi oleh dosis. Pada dosis 1 MIC kebocoran protein dan asam nukleat sebesar 0,330,59 dan kebocoran ion K + dan Ca 2+ pada kisaran 22,4942,3%. Pada dosis 2 MIC terjadi kerusakan yang lebih parah dengan konsentrasi masingmasing untuk protein dan asam nukleat berada pada kisaran 0,480,87 dan ion K + dan Ca 2+ pada kisaran 32,8%76,5%. Disamping itu itu campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa menyebabkan terjadinya perubahan morfologi sel L. monocytogenes dan S. Typhimurium dengan tingkat kerusakan yang bervariasi. Mekanisme kerja dari campuran metabolit Lb.plantarum kikmag minyak kelapa umumnya diawali dengan mengganggu atau merusak dinding dan membran sel kemudian fungsi materi genetik, hal ini terjadi baik pada bakteri Gram negatif maupun Gram positif. DAFTAR PUSTAKA Alakomi HL, Skytta E, Saarela M, MattilaSandholm T Lactic acid permeabilizes Gramnegative bacteria by distrupting the outer membrane. Appl. Environ. Microbiol. 66: August EG Kajian penggunaan lipase amobil dari Aspergillus niger pada pembuatan monoasilgliserol yang bersifat antibakteri dari minyak kelapa. Tesis Program Pascasarjana IPB. Bogor. Bunduki MMC, Flanders KJ, Donelly CW Metabolic and structural sites of damage in heat and sanitizer injured population of Listeria monocytogenes. J. Food Protect 58:

111 99 Burt SA, Reinders RD Antibacterial activity of selected plant essensial oils against Escherichia coli O157:H7. Letters in Appl Microbiol 78: Davidson PM, Parish ME Methods for testing the efficacy of food antimicrobials. Food Technol. 43: Davidson PM, Branen AL Antimicrobial in Food. Merckel Dekker, new York. Friedman M, Henika PR, Levin CE, Mandreil RE Antibacterial activities of plant essential oils and their components against Escherichia coli O157:H7 and Salmonella enteritica in apple juice. 52: J. Agric. and Food Chem. 52 : Gilbert P The revival of microorganism sublethally injured by chemical inhibitors. Di dalam: Andrew MHE, Russel AD (ed). The Revival of Injured Microbes. Academic Press, London. Heipieper HJ, Meulenbeld G, Qirschot Q, de Bont JAM Effect of environmental factors on the trans/cis ratio of unsaturated fatty acids in P. putida S12. App. and Env. Microbiol. 62 : Indriyati W Kajian aktivitas antimikroba campuran mono dan diasilgliserol hasil pemanfaatan destilat asam lemak minyak kelapa. Tesis Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Jay SJ Modern Food Microbiology 5 th edition. Chapman and Hall. New York. Jawetz E, Melnick J, Adelberg E Medical Microbiology. Appleton & Lange. San Fransisco. JEOL Specimen Preparation Methods for Scanning Electron Microscope. JEOL Application Note. Tokyo. 23p Jenie BSL, Atifah N, Suliantari Peningkatan keamanan dan mutu pindang ikan kembung (Rastellinger sp) dengan aplikasi kombinasi natrium asetat, bakteri asam laktat dan pengemasan vakum Pangan XII (1): J. Ilmu dan Teknol Pangan XII (1): Kabara JJ Antimicrobial agents derived from fatty acids. J. Am. Oil Chem. Soc. 61: Kanazawa A, Ikeda T, Endo T A Novel approach to mode of action of cationic biocides: morphological effect on antibacterial activity. J.Appl Bacteriol. 78: Kim JM, Marshal MR, Wei Cl Antibacterial activity of some essential components against five food borne pathogens. J. Agric. and Food Chem. 43: Lavlinesia Kajian pola dan mekanisme inaktivasi bakteri oleh ekstrak etil asetat biji atung (Parinarium glaberium Hassk). Ringkasan Disertasi Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.. Lin CM, James FP, Cheng IW Antibacterial mechanism of allyl isothiocyanate. J. of Food Protect. 61:

112 100 Mappiratu, Umrah, Ijirana Pemanfaatan sabun hasil samping pengolahan minyak kelapa dalam pembuatan monoasilgliserol menggunakan lipase Aspergillus niger amobil isolat kapang kopra. Laporan Penelitian RUT VIII/2 Fakultas Pertanian, Universitas Tadulako. Naufalin R Kajian sifat antimikroba ekstrak bunga kecombrang (Nicolaia speciosa Horan) terhadap berbagai mikroba patogen dan perusak pangan. Disertasi Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Bogor. Nikaido H, Vaara M Molekuler basis of bacterial outer membrane permeability. Microb. Reviews. 49(1):132. Nychas GJE, Tassou CC Traditional preservative oils and spices. Di dalam: Robinson RK, Batt CA, Patel PD (Ed). Encyclopedia of Food Microbiology Volume.2. Academy Press. London. Parhusip A Kajian Mekanisme Antibakteri Ekstrak Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC) Terhadap Bakteri Patogen Pangan. Disertasi Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Park SJ, Park HW, Park J Inactivation kinetics of food poisoning microorganisms by carbon dioxide and high hydrostatic pressure. J. Food. Sci 68(3): Russel AD Potential sites of damage in microorganisms exposed to chemical or physical agent. Di dalam Andrew MHE, Russel AD (ed). The Revival of Injured Microbes. Academic Press. London. Stratford M Traditional preservativesorganic acids. Di dalam: Robinson RK, Batt CA, Patel PD, editors. Encyclopedia of Food Microbiology. Volume 1. Academic Press. London. Surono IS Probiotik susu fermentasi dan kesehatan. YAPMMI (Yayasan pengusaha makanan dan minuman seluruh Indonesia). Ultee A, Goris LGM, Smidt EJ Bacterial activity of carvacrol towards the foodborne pathogen Bacillus cereus. J. App. Microbiol 85: Ultee A, Bennik MH, Moezelaar R The phenolic hydroxyl group of carvacrol is essential for action against the foodborne pathogen Bacillus cereus. J. App. and Environ. Microbiol. Vol 68, No 4: Wang LL, Johnson EA Inhibition of Listeria monocytogenes by fatty acids and monoglycerides. J. App. and Environ. Microbiol. Vol 58, N0 2: Wang LL, Yang BK, Parkin KL, Johnson EA Inhibition of Listeria monocytogenes by monoacylglycerol synthesized from coconut oil and milk fat by lipasecatalyzed glycerolysis. J. Agric. and Food Chem. 41:

113 7. STABILITAS AKTIVITAS ANTIMIKROBA CAMPURAN METABOLIT Lb. plantarum kik DAN MAG MINYAK KELAPA SERTA APLIKASINYA PADA PRODUK TAHU ABSTRAK Pengaruh ph dan pemanasan terhadap stabilitas antibakteri metabolit Lb. plantarum kik, MAG minyak kelapa dan campuran metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa dipelajari dengan menggunakan 3 jenis bakteri uji. Pengujian terhadap berbagai ph menunjukkan bahwa semakin tinggi ph, aktivitas penghambatan dari campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa semakin menurun, demikian halnya dengan suhu dan waktu pemanasan. Pada penggunaan MAG minyak kelapa secara tunggal dan campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa sampai dengan ph 7 masih menunjukkan aktivitas antibakteri, namun pada penggunaan metabolit Lb. plantarum kik secara tunggal tidak menunjukkan aktivitas antibakteri pada ph 7. Pengaruh pemanasan pada penggunaan tunggal metabolit Lb. plantarum kik, MAG minyak kelapa dan campuran metabolit Lb. plantarummag minyak kelapa pada suhu 75 o C dan 100 o C selama 10, 20 dan 30 menit masih menunjukkan aktivitas antibakteri, tetapi pada suhu 121 o C aktivitas antibakteri diperlihatkan hanya pada pemanasan 10 menit. Aplikasi campuran metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa pada tahu dengan dosis 2 MIC hanya bertahan selama 4 hari, sedangkan dosis 4 MIC dapat bertahan selama 6 hari dan secara organoleptik masih dapat diterima panelis. PENDAHULUAN Menurut Frazier dan Westhoff (1998), efektivitas antimikroba dipengaruhi oleh berbagai faktor diantaranya tingkat keasaman (ph), suhu, protein, lemak, karbohidrat dan a w medium pertumbuhan bakteri serta konsentrasi NaCl. Beberapa penelitian melaporkan bahwa asam organik maupun MAG minyak kelapa akan mengalami penurunan aktivitas pada ph medium tinggi. Menurut Fardiaz dan Jenie (1989), aktivitas antibakteri dari asam organik disebabkan karena bentuk tidak terdisosiasi. Asam organik seperti asam laktat dan asam asetat dalam bentuk tidak terdisosiasi atau tidak bermuatan (HA) dapat berpenetrasi ke dalam membran sel mikroba (Naidu dan Clemens 2000). Berbagai penelitian telah melaporkan adanya efek ph terhadap aktivitas antibakteri dari asam lemak monolaurat dan laurat. Semakin tinggi ph medium, aktivitas antibakteri akan menurun. Wang dan Johnson (1992) menemukan nilai MBC (Minimum bactericidal concentration) asam lemak monolaurat sebesar 10 µg/ml pada medium dengan ph 5 dan 20 µg/ml pada ph 6.

114 102 Beuchat (1980) melaporkan bahwa pada ph 6,7 efek penghambatan dari asam laurat terhadap bakteri V. parahaemolyticus lebih rendah bila dibandingkan pada ph 5 dan 6. Elida (2002) menemukan tidak adanya efek penghambatan dari metabolit BAL terhadap Salmonella Typhimurium pada medium dengan ph 7, sedangkan pada ph 5 dan 6 masih menunjukkan adanya aktivitas antibakteri. Hal yang sama juga dilaporkan oleh Ultee et al. (1998) pada antimikroba senyawa alami seperti karvakrol yang lebih efektif menghambat B. cereus pada ph 5 sampai 6, bila dibandingkan pada ph 7. Sementara Gino (2005) menemukan penurunan daya hambat dari ekstrak etanol sereh seiring dengan meningkatnya ph yaitu dari ph 4 sampai 7 terhadap E. coli. Suhu dan lama pemanasan juga dapat mempengaruhi aktivitas antibakteri. Menurut Tsuchido et al. (1981) efek bakterisidal dari monolaurin akan lebih efektif pada suhu rendah dan perlakuan yang relatif lama daripada perlakuan pada suhu tinggi dengan waktu singkat. Penelitian tentang aplikasi campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa terhadap bahanbahan pangan perlu dilakukan untuk mendapatkan informasi kemampuan metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa dalam menghambat pertumbuhan mikroorganisme pada bahan pangan. Akhirakhir ini semakin marak penggunaan bahan kimia seperti formalin dan borax sebagai pengawet pangan yang sangat membahayakan kesehatan tubuh manusia. Davidson dan Branen (1994) telah membuktikan penggunaan monolaurin dan kalsium laktat 500 ppm dapat mempertahankan masa simpan pasta ikan dari 6 menjadi 20 hari. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh aktivitas antibakteri campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa terhadap ph dan pemanasan serta aplikasinya pada sistem pangan, yaitu tahu. METODOLOGI Bahan dan Alat Isolat bakteri asam laktat yang digunakan adalah Lb. plantarum kik yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Pangan, sedangkan MAG minyak kelapa diperoleh dari Laboratorium Agroindustri Fakultas Pertanian Universitas Tadulako

115 103 Palu (Sulawesi Tengah). Bakteri uji yang digunakan adalah L. monocytogenes (FNCC 0156), Bacillus aureus (FNCC 057) dan S. Typhimurium (FNCC 0734) yang diperoleh dari Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi UGM. Semua media mikrobiologi diperoleh dari Oxoid Ltd. Persiapan isolat bakteri uji Sebanyak satu ose bakteri dari stok agar miring diinokulasikan ke dalam medium nutrien broth (NB) dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Sebanyak 1 ml kultur bakteri ditambahkan ke dalam 9 ml media NB dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Kultur bakteri uji sebanyak 10 6 CFU/ml digunakan dalam pengujian kebocoran protein dan asam nukleat, serta perubahan morfologi sel bakteri yang diberi campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa. Produksi metabolit bakteri asam laktat Produksi metabolit Lb. plantarum kik dipersiapkan secara bertahap dengan mengikuti metode Jenie et al. (2000) sebagai berikut: kultur Lb. plantarum kik sebanyak 1 ml diambil dari stok masingmasing dan diinokulasi ke dalam 9 ml MRS Broth, diinkubasi pada suhu 37 o C selama 2 hari. Sebanyak 4% (v/v) kultur tersebut diinokulasikan ke dalam media steril MRSB modifikasi (MRSB di tambah 2% glukosa, 2% ekstrak khamir, 1% tripton) selanjutnya diinkubasi selama 2 hari pada suhu 37 o C. Produk fermentasi dipisahkan dari masa sel dengan cara sentrifus yang berlangsung pada rpm selama 15 menit. Supernatan yang terbentuk dipisahkan dari endapan dengan menyaring menggunakan kertas saring whatman ukuran 0.22 µm, kemudian dicampur dengan MAG minyak kelapa dengan perbandingan 5:3 atas dasar v/v. Produksi metabolit bakteri asam laktat Produksi metabolit Lb. plantarum kik dipersiapkan secara bertahap dengan mengikuti metode Jenie et al. (2000) sebagai berikut: Kultur Lb. plantarum kik sebanyak 1 ml diambil dari stok masingmasing dan diinokulasikan ke dalam 9 ml MRS Broth, diinkubasi pada suhu 37 o C selama 2 hari. Sebanyak 4% (v/v) kultur

116 104 tersebut diinokulasikan ke dalam media steril MRSB yang dimodifikasi dengan 2% glukosa, 2% ekstrak khamir, 1% tripton selanjutnya diinkubasi selama 2 hari pada suhu 37 o C. Produk fermentasi dipisahkan dari massa sel dengan cara sentrifus yang berlangsung pada rpm selama 15 menit. Supernatan yang terbentuk dipisahkan dari endapan dengan menyaring menggunakan kertas saring whatman ukuran 0.22 µm, kemudian dicampur dengan MAG minyak kelapa dengan perbandingan 5:3 atas dasar v/v. Pengujian stabilitas aktivitas antibakteri campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa pada berbagai ph dan pemanasan (Carson dan Riley 1995) Senyawa antibakteri dilarutkan dalam larutan buffer fosfat dengan ph awal 7,3, selanjutnya ph diatur menjadi ph 4, 5, 6, dan 7 dengan menggunakan HCl 0,1 N dan NaOH 0,1 N. Larutan buffer fosfat disterilkan terlebih dahulu sebelum digunakan sebagai media antibakteri campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa. Pengaruh pemanasan dilakukan terhadap medium yang telah mengandung antibakteri dan dipanaskan pada suhu 75, 100 dan 121 o C selama 10, 20 dan 30 menit. Riley 1995). Pengujian dilakukan dengan menggunakan metode difusi sumur (Carson dan Aplikasi metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa pada bahan pangan tahu Pengujian metabolit BALMAG pada sistem pangan tahu dilakukan dengan cara merendam tahu (Merk Yungyi dengan ukuran 5 cm x 6 cm x 2,1 cm) dalam wadah yang telah berisi campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa pada dosis 0 (kontrol), 2 dan 4 MIC. Nilai MIC yang digunakan adalah nilai MIC yang terendah dari perhitungan MIC pada bakteri Gram positif, yakni 1,2 %. Selanjutnya tahu disimpan pada suhu ruang dan dilakukan analisis Total Plate Count, organoleptik (warna, bau dan tekstur) pada 0, 2, 4 dan 6 hari. Pada TPC, penghambatan pertumbuhan dihitung dari log CFU/g tahu kontrol dikurangi log CFU/g tahu yang diberi perlakuan, sedangkan analisis organoleptik dilakukan dengan uji hedonik menggunakan panelis semi terlatih sebanyak 20 orang.

117 105 HASIL DAN PEMBAHASAN Pengaruh ph Aktivitas antibakteri dari MAG minyak kelapa, metabolit Lb. plantarum kik dan campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa terhadap bakteri uji dipengaruhi oleh ph. Data hasil penelitian pengaruh ph terhadap aktivitas antibakteri campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa terdapat pada Gambar 7.1a7.1c dan Lampiran 11a14a. Berdasarkan hasil uji statistik, perlakuan ph berpengaruh sangat nyata (P<0,01) terhadap aktivitas antibakteri, baik dari metabolit Lb. plantarum kik, MAG minyak kelapa maupun campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa (Lampiran 3243). Dari Gambar 7.1a (Lampiran 11a) dapat diketahui bahwa pada ph 45 aktivitas campuran metabolit Lb. plantarum kikmag terhadap L. monocytogenes B. cereus (vegetatif), dan S. Typhimurium relatif sama, sedangkan pada spora B. cereus aktivitas dari campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa pada ph 46 masih memiliki aktivitas penghambatan yang relatif sama, dan pada ph 7 aktivitasnya menurun. Keadaan ini juga terjadi pada penggunaan tunggal dari MAG minyak kelapa, sedangkan pada metabolit Lb. plantarum kik aktivitas antibakterinya menghilang ketika ph medium menjadi 7. Aktivitas senyawa antibakteri dipengaruhi oleh tingkat keasaman atau ph. Pengaruh campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa pada ph rendah terhadap semua bakteri uji menunjukkan efek penghambatan yang lebih besar dibandingkan dengan ph tinggi. Keadaan ini memberikan informasi bahwa metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa akan bekerja lebih efektif pada kondisi ph yang rendah bila dibandingkan ph yang tinggi. Pada ph 7, MAG minyak kelapa secara tunggal masih memperlihatkan aktivitas, sedangkan pengaruh metabolit BAL secara tunggal hanya menghambat pada ph 46, dan setelah ph 7 tidak terlihat adanya aktivitas antibakteri. Hal ini disebabkan secara umum ph dapat mempengaruhi aktivitas antibakteri dengan cara mempengaruhi komponen yang ada baik pada MAG minyak kelapa, metabolit Lb. plantarum kik maupun campuran dari metabolit Lb. plantarum kikmag.

118 106 Diameter penghambatan (mm) L.monocytogenes B.cereus (vegetatif) B. cereus (spora) S. Typhimurium Nilai ph Gambar 7.1a. Pengaruh ph terhadap aktivitas antibakteri campuran metabolit Lb. Plantarum kikmag minyak kelapa Mekanisme penghambatan dari MAG, metabolit Lb. plantarum kik maupun campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa yang lebih efektif pada ph rendah berkaitan erat dengan bentuk tak terdisosiasi. Dengan adanya mekanisme ini dapat dinyatakan bahwa semakin banyak bentuk tidak terdisosiasi, maka aktivitas senyawa antibakteri semakin efektif. Davidson dan Branen (1994) menyatakan bahwa bentuk tak terdisosiasi dari senyawa antimikroba akan efektif bekerja pada ph rendah. Komponen aktif yang terdapat dalam MAG minyak kelapa, seperti kaproat, kaprilat, kaprat, maupun asam laurat memiliki aktivitas antibakteri yang cukup tinggi dan aktivitas ini akan dipertahankan jika berada dalam medium yang memiliki ph rendah (Mappiratu 2002; Surono 2004). Selain asamasam lemak dalam metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa juga ditemukan asamasam organik lain, seperti asam laktat, propionat, asetat, dan sitrat yang akan bekerja secara sinergi, sehingga akan mempercepat proses kerusakan atau kematian dari sel mikroba. Hal ini disebabkan oleh komponen yang ada pada metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa akan mempertahankan bentuk tidak terdisosiasinya pada ph rendah, dan pada kondisi ini akan memudahkan senyawa antibakteri untuk berdifusi secara pasif ke dalam sel bakteri. Selanjutnya komponen yang ada pada metabolit Lb. plantarum kik maupun pada MAG minyak kelapa akan bereaksi secara bersamasama untuk mempercepat

119 107 kerusakan sel bakteri. Kondisi inilah yang menyebabkan efektivitas penghambatan dari campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa lebih tinggi dibandingkan penggunaan secara tunggal baik dari MAG minyak kelapa maupun metabolit Lb. plantarum kik. Lambert dan Stratford (1999) menyatakan bahwa bahan pengawet kelompok asam lemah lebih efektif pada ph rendah, dan akan meningkatkan bentuk tak terdisosiasi. Dalam bentuk tidak terdisosiasi asam organik akan mudah masuk menembus lapisan lemak dari membran sel, sehingga keasaman sitoplasma meningkat dan pertumbuhan sel mikroba menjadi terhambat. Mekanisme penghambatannya disebabkan oleh sel pada kondisi asam akan berupaya untuk mempertahankan ph konstan di dalam sel. Jika ph diturunkan maka proton yang terdapat dalam jumlah tinggi pada medium akan masuk ke dalam sitoplasma sel. Proton harus dikeluarkan untuk mencegah terjadinya pengasaman dan denaturasi komponenkomponen sel. Aktivitas ini akan menguras energi dalam sel, sehingga sel akan kekurangan energi dan akibatnya pertumbuhan sel terhambat dan dapat menyebabkan kematian sel (Ray 2001). Efektivitas senyawa antimikroba alami pada ph rendah dalam menghambat beberapa bakteri telah dilaporkan Ultee et al. (1998); Beuchat et al. (1980) maupun Wang et al. (1993). Elida (2002) menemukan asam organik yang berasal dari metabolit BAL efektif menghambat bakteri patogen pada kisaran ph 45,5. Houghton dan Rahman (1998) melaporkan bahwa senyawa fenolik (yang juga merupakan asam lemah) pada minyak atsiri lebih efektif pada ph 5,56 dalam menghambat S. enteridis dibandingkan pada ph 7 dan 8. Aktivitas antibakteri dari metabolit Lb. plantarum kik (Gambar 7.1b dan Lampiran 11b, 12b,13b dan 14 b) pada ph 46 masih terlihat, namun setelah ph dinaikkan menjadi ph 7 aktivitas dari metabolit Lb. plantarum kik tidak terlihat. Fenomena ini didukung oleh temuan Wirawati (2002) yang melaporkan bahwa aktivitas antibakteri metabolit Lb. plantarum yang diisolasi dari tempoyak terhadap E. coli, S. aureus dan S. Typhimurium menurun seiring dengan meningkatnya ph dan pada ph 7 metabolit Lb. plantarum tidak menunjukkan adanya zona bening. Hal ini disebabkan karena pada ph rendah (ph 46) asam organik yang terdapat dalam metabolit Lb. plantarum kik berada dalam bentuk tak terdisosiasi yang dapat berdifusi secara aktiv ke dalam sel mikroba, sedangkan jika dalam

120 108 suasana ph tinggi (ph 7) bentuk tak terdisosiasi akan berkurang. Menurut Yuk et al. (2005), asam organik pada ph 5,4 bentuk tidak terdisosiasinya ditemukan masingmasing sebesar 5,53% untuk asam asetat; 0,701% untuk asam laktat dan 0,043% untuk asam sitrat sedangkan pada ph 6,4 bentuk tidak terdisosiasinya masingmasing ditemukan sebesar 0,314% untuk asam asetat ; 0,043% untuk asam laktat dan 0,002% untuk asam sitrat. Gambar 7.1b Pengaruh ph terhadap aktivitas antibakteri metabolit Lb. plantarum kik Fardiaz dan Jenie (1992) melaporkan bentuk tidak terdisosiasi dari beberapa asam organik seperti asam asetat, laktat dan sitrat pada ph 4, 5 dan 6 adalah masingmasing sebesar 84,35; 34,9 dan 5,1% untuk asam asetat, 39,2; 6,05 dan 0,64% untuk asam laktat, dan 18,9; 0,41 dan 0,006% untuk asam sitrat. Hal inilah yang menyebabkan pada penggunaan tunggal dari metabolit Lb. plantarum kik aktivitasnya menjadi berkurang atau hilang pada ph tinggi (ph 7) karena pada ph 7 asamasam organik yang ada pada metabolit Lb. plantarum kik akan berada dalam bentuk terdisosiasi. Menurut Garbutt (1997) tingkat disosiasi tergantung pada ph lingkungan, dalam larutan asam yang banyak mengandung ion H + terdisosiasi, kesetimbangan akan bergerak ke arah yang tidak terdisosiasi. Bentuk yang tidak terdisosiasi mempunyai sifat larut lemak (lipofilik), sehingga bergerak masuk ke dalam sel, dan ionion yang terdisosiasi tidak dapat masuk. Aktivitas antibakteri dari MAG

121 109 minyak kelapa (Gambar 7.1c; Lampiran 11c 14c) menunjukkan bahwa aktivitas antibakteri hingga ph 7 masih terlihat. Hal ini berarti bahwa kemampuan MAG minyak kelapa relatif stabil dibandingkan dengan metabolit Lb. plantarum kik secara tunggal. Pada ph 46 MAG minyak kelapa memperlihatkan aktivitas antibakteri yang relatif lebih tinggi dibandingkan pada ph 7. Hasil penelitian ini sejalan dengan yang dikemukakan oleh Beuchat (1980), yaitu monokaprilin dan monolaurin pada ph 6,7 masih dapat menghambat pertumbuhan V. parahaemolyticus. Menurut Surono (2004) daya antibakteri dari asam lemak disebabkan oleh molekul yang tidak terdisosiasi, bukan anionnya, karena ph mempengaruhi aktivitasnya, semakin rendah ph semakin kuat dan cepat efek antibakterinya. Diameter penghambatan (mm) L.monocytogenes 12 B.cereus (vegetatif) B. cereus (spora) 10 S. Typhimurium Nilai ph Gambar 7.1c. Pengaruh ph terhadap aktivitas antibakteri MAG minyak kelapa Secara umum pengaruh ph terhadap aktivitas antibakteri dari metabolit Lb. plantarum kik dan MAG minyak kelapa secara tunggal maupun campuran berbeda pada setiap jenis bakteri. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa pada ph 67 aktivitas antimikroba metabolit plantarum kikmag sel vegetatif dari B. cereus mengalami penurunan, sedangkan pada spora penurunan aktivitas relatif sama pada ph medium 46. Hal ini menunjukkan bahwa daya hambat dari metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa terhadap sel spora lebih tahan dibanding sel vegetatif.

122 110 Pengaruh suhu dan waktu pemanasan Pengaruh pemanasan terhadap aktivitas antibakteri dari metabolit Lb. plantarum kik, MAG minyak kelapa dan campuran metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa dapat dilihat pada lampiran 15a 16c. Hasil yang diperoleh menunjukkan metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa memiliki aktivitas antibakteri terhadap sel vegetatif dan spora B. cereus, L. monocytogenes dan S. Typhimurium pada berbagai pemanasan (Gambar 7.2a7.2c). Hal ini menunjukkan bahwa campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa masih stabil pada suhu 75 o C selama waktu pemanasan 10, 20 dan 30 menit. Demikian pula halnya pada suhu 100 o C sedangkan pada suhu 121 o C aktivitas antibakteri dari Lb. plantarum kik, dan MAG minyak kelapa secara tunggal maupun campuran dari keduanya hanya terlihat pada waktu pemanasan 10 menit. Metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa mengalami penurunan aktivitas antibakteri dengan semakin meningkatnya suhu dan waktu pemanasan terutama pada suhu tinggi. Terjadinya penurunan aktivitas antibakteri dengan meningkatnya suhu pemanasan diduga disebabkan oleh terbentuknya senyawa atau komponen lain yang dapat menurunkan aktivitas metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa. Beberapa hasil penelitian melaporkan bahwa komponen antimikroba dari berbagai ekstrak tanaman menunjukkan aktivitas antimikroba yang menurun karena adanya perlakuan panas. Ewald et al. (1999) menemukan efek pemanasan dari kuersetin dan kaemferol yang termasuk dalam golongan flavonoid, yaitu pada suhu 60 o C selama 2 jam akan menurunkan aktivitasnya sebesar 48 dan 68%. Shashikant et al. (1981) melaporkan bahwa aktivitas antimikroba tetap stabil selama 48 jam bila disimpan pada suhu 37 o C, dan hanya stabil selama 36 jam bila suhu penyimpanan dinaikkan menjadi 58 o C. Pada Gambar 7.2b dan 7.2c terlihat masih adanya aktivitas antibakteri pada metabolit Lb. plantarum kik dan MAG minyak kelapa pada suhu 75 dan 100 o C dengan lama pemanasan 10, 20 dan 30 menit. Pada suhu 121 o C aktivitas antibakteri dari metabolit Lb. plantarum kik, MAG minyak kelapa secara tunggal maupun campuran dari keduanya hanya terlihat pada pemanasan 10 menit. informasi ini bermafaat dalam rangka aplikasi metabolit Lb. plantarum kikmag

123 111 minyak kelapa sebagai pengawet alami pada bahan pangan, terutama pada bahanbahan pangan yang diolah dengan pemanasan L. monocytogenes B. cereus (vegetatif) B. cereus (spora) S. Typhimurium Diameter penghambatan (mm) K 75/10 75/20 75/30 100/10 100/20 100/30 121/10 Suhu ( o C) dan lama pemanasan (menit) Gambar 7.2a. Pengaruh suhu dan lama pemanasan terhadap aktivitas antibakteri campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa Aktivitas penghambatan dari penggunaan tunggal metabolit Lb. plantarum kik dan MAG minyak kelapa maupun penggunaan campuran setelah pemanasan pada kisaran suhu o C lebih tinggi dibandingkan dengan suhu 121 o C. Hal ini diduga karena pada suhu rendah belum mencapai titik didih air, sehingga pemanasan belum memberikan pengaruh yang cukup besar terhadap komponen yang terdapat pada senyawa antibakteri dari metabolit Lb. plantarum kik maupun MAG minyak kelapa. Namun setelah suhu ditingkatkan mencapai 100 o C dan 121 o C, yaitu titik didih air telah tercapai, akan menyebabkan beberapa komponen dari senyawa antibakteri menguap atau teroksidasi dan terbentuknya senyawa baru yang dapat menurunkan aktivitas antibakteri senyawa metabolit Lb. plantarum kik maupun MAG minyak kelapa.

124 112 Diameter penghambatan (mm) Suhu ( o C) dan lama pemanasan (menit) L. monocytogenes B. cereus (vegetatif) B. cereus (spora) S. Typhimurium 0 K 75/10 75/20 75/30 100/10 100/20 100/30 121/10 Gambar 7.2b. Pengaruh suhu ( o C) dan lama pemanasan terhadap aktivitas antibakteri metabolit Lb. plantarum kik Diameter penghambatan (mm) L. monocytogenes B. cereus (vegetatif) B. cereus (spora) S. Typhimurium 0 K 75/10 75/20 75/30 100/10 100/20 100/30 121/10 Suhu ( o C) dan lama pemanasan (menit) Gambar 7.2c. Pengaruh suhu dan lama pemanasan terhadap aktivitas antibakteri MAG minyak kelapa Hasil penelitian ini sejalan dengan temuan Mappiratu et al. (2000) yang melaporkan bahwa pada penggunaan MAG minyak kelapa pada konsentrasi 1,25% selama penyimpanan 24 jam pada santan yang dikombinasi dengan perlakuan pasteurisasi diperoleh total koloni mikroba sebesar 2,34, sedangkan pada perlakuan kontrol jumlah koloni mikroba sebesar 9,21 dan jika hanya monoasilgliserol tanpa

125 113 pasteurisasi jumlah koloni mikroba yang diperoleh sebesar 5,34. Ketika dikombinasikan dengan suhu sterilisasi jumlah koloni mikroba yang diperoleh sebesar 3,69. Menurut Tsuchido et al. (1981) aktivitas antibakteri dari monolaurin lebih efektif pada perlakuan suhu rendah dengan waktu yang lebih lama dibandingkan perlakuan suhu tinggi dengan waktu kontak yang relatif singkat. Hal ini disebabkan karena pada suhu rendah terjadi perubahan komposisi fosfolipida membran sitoplasma, yang akan mengubah sifat fluiditas membran. Perubahan fluiditas tersebut meningkatkan daya penetrasi MAG masuk ke dalam sel yang akan menghambat aktivitas enzimenzim yang berperan dalam produksi energi dan transport nutrient (Wang dan Johnson 1992). Penghambatan antibakteri dari metabolit Lb. plantarum kik dan MAG minyak kelapa secara tunggal maupun campuran keduanya terhadap sel spora berbeda dengan sel vegetatif dari B. cereus, yaitu diperoleh penghambatan yang lebih kecil pada sel spora. Hal ini disebabkan pada spora terdapat lapisan terluar yang tipis dan lembut yang disebut eksosporium, di bawah eksosporium terdapat suatu lapisan lagi yang disebut bungkus spora (kor spora) yang terdiri dari satu lapisan atau berlapislapis yang membentuk struktur yang mirip dengan dinding sel yang mengandung asam dipikolinat, yang terbentuk dari kompleks kalsium dipikolinat yang memiliki sifat seperti gel serta kaya akan ion kalsium (Jay 1997). Hal inilah akan menghambat penetrasi senyawa campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa. Aplikasi metabolit BALMAG pada produk tahu Aplikasi antimikroba metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa pada tahu dilakukan dengan tujuan untuk melihat daya simpan tahu selama penyimpanan pada suhu ruang dengan dosis 0 (kontrol), 2 dan 4 MIC. Nilai MIC yang dipilih adalah nilai MIC yang terendah dari aktivitas campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa terhadap bakteri Gram positif, yakni sebesar 1,2%. Tahu merupakan salah satu jenis bahan pangan yang memiliki nilai nutrisi yang tinggi dan dapat dimanfaatkan oleh mikroorganisme untuk tumbuh dan

126 Kontrol 2 MIC 4 MIC Log CFU/g Lama penyimpanan (hari) berkembangbiak. Untuk mengetahui pengaruh metabolit BALMAG minyak kelapa terhadap daya tahan tahu, maka digunakan beberapa dosis MIC. Gambar 7.3. Pengaruh konsentrasi campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa pada berbagai MIC terhadap penurunan total mikroba (log CFU/g) pada tahu yang disimpan sampai hari ke6

127 115 Hasil pengukuran jumlah total mikroba campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa yang direndam pada berbagai MIC selama penyimpanan 6 hari dapat dilihat pada Gambar 7.3 dan Lampiran 18. Pada gambar tersebut terlihat pada saat awal (0 hari) nilai log jumlah total mikroba tahu tanpa perlakuan mikroba awal 5,7 x Campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa dengan dosis 2 MIC setelah penyimpanan 2 hari mampu menekan koloni sebesar 1,29 unit log, sedangkan pada penyimpanan 4 hari penurunan jumlah koloni sebesar 1,64 unit log, dan setelah penyimpanan 6 hari penurunan jumlah koloni menjadi 0,86 unit log. Campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa pada konsentrasi 4 MIC setelah 2 hari penyimpanan menunjukkan penurunan jumlah koloni sebesar 1,40 unit log, sedangkan pada penyimpanan 4 hari penurunan jumlah koloni sebesar 2,25 unit log dan setelah penyimpanan hari ke 6 penurunan jumlah koloni sebesar 1,71 unit log. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa dapat mempertahankan masa simpan tahu hingga hari ke 6 pada suhu kamar. Pengujian Organoleptik Tahu Hasil uji hedonik terhadap parameter warna, bau dan tekstur tahu (lampiran 20 20c). Gambar 7.4a menunjukkan perbedaan pada masingmasing dosis perlakuan. Penilaian perbedaan tingkat kesukaan panelis menggunakan nilai ratarata sampel. Nilai ratarata warna yang diperoleh untuk kontrol 5,8 3,5 (dari suka hingga agak tidak suka) pada penyimpanan 06 hari. Pada perlakuan 2 dan 4 MIC diperoleh nilai masingmasing sebesar 5,7 4,0 (dari suka hingga biasa ) dan 5,9 4,9 (dari suka hingga agak suka) pada waktu penyimpanan yang sama. Dari data tersebut diketahui bahwa tahu yang diberi campuran metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa dengan dosis 4 MIC lebih disukai dari pada dosis 2 MIC maupun kontrol. Pada uji hedonik terhadap parameter bau tahu (Gambar 7.4b) menunjukkan bahwa campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa berpengaruh terhadap bau. Pada penyimpanan hari ke 4 dengan dosis 2 MIC dan 4 MIC umumnya panelis masih memberikan penilaian agak suka (4,3) untuk dosis 2 MIC dan suka (5,6) untuk dosis 4 MIC, tetapi pada penyimpanan hari ke 6 panelis memberikan penilaian agak tidak suka (3,8) untuk dosis 2 MIC dan penilian suka

128 116 (4,5) untuk dosis 4 MIC. Dengan demikian jika dibandingkan dengan kontrol, penggunaan antibakteri dari campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak memberikan bau yang dapat diterima panelis hingga penyimpanan hari ke6 untuk perlakuan 4 MIC. Perlakuan kontrol pada penyimpanan hari ke 4 menunjukkan adanya bau busuk, sedangkan pada perlakuan dengan dosis 2 MIC dan 4 MIC belum terbentuk lendir dan bau, sehingga masih diterima panelis. Penyimpanan hari ke 6 pada perlakuan kontrol menunjukkan tahu sudah berlendir dan tercium bau busuk, sementara pada perlakuan 2 MIC agak berlendir dan sedikit agak berbau asam. Untuk perlakuan 4 MIC lendir dan bau belum terbentuk hingga penyimpanan hari ke 6. Skor penerimaan panelis MIC 2 MIC 4 MIC Lama penyimpanan (hari) Gambar 7.4a. Pengaruh konsentrasi campuran metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa pada berbagai MIC terhadap skor panelis terhadap warna tahu yang di simpan sampai hari ke6 Skor penerimaan panelis MIC 2 MIC 4 MIC Lama penyimpanan (hari)

129 117 Gambar 7.4b. Pengaruh konsentrasi campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa pada berbagai MIC terhadap skor penerimaan panelis bau tahu yang di simpan sampai hari ke 6 Penggunaan campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa sangat mempengaruhi penerimaan panelis terhadap tekstur (Gambar 7.4c). Panelis memberikan nilai tekstur pada tahu yang direndam campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa dengan dosis 4 MIC sampai penyimpanan hari ke 6 dengan nilai (5,3 4,3) atau dari agak lebih keras hingga biasa. Skor penerimaan panelis MIC 2 MIC 4 MIC Lama penyimpanan (hari) Gambar 7.4c. Pengaruh konsentrasi campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa pada berbagai MIC terhadap skor penerimaan panelis tekstur tahu yang di simpan sampai hari ke 6 Pada perlakuan 2 MIC diperoleh nilai (5,3 3,8) atau dari agak lebih keras hingga agak lunak. Nilai ratarata tekstur pada perlakuan kontrol adalah (5,2 2,0) atau dari agak lebih keras hingga lebih lunak. Secara keseluruhan tahu yang direndam campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa lebih disukai panelis. Hal ini diperlihatkan dengan lebih tingginya ratarata penilaian panelis terhadap warna, bau dan tekstur dibandingkan

130 118 kontrol. Terbentuknya lendir dan bau busuk pada perlakuan kontrol disebabkan tercemarnya produk pangan (tahu) oleh berbagai bakteri perusak atau pembusuk pangan seperti Achromobacter, Leuconostoc, pseudomonas, dan Micrococcus. Menurut Frazier dan Westhoff (1988) timbulnya bau yang tidak enak pada bahanbahan pangan merupakan hasil pertumbuhan bakteri pada permukaan yang merupakan tanda awal sebelum terjadi kebusukan. Jay (1996) menyatakan bahwa lendir akibat pertumbuhan bakteri dapat menyebabkan terjadinya pelunakan atau melonggarnya struktur protein bahan pangan. Hasil pengamatan di atas membuktikan bahwa campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa mampu menghambat pertumbuhan bakteribakteri perusak pangan yang pada gilirannya masa simpan dari tahu dapat di perpanjang. Diduga pertumbuhan bakteri pembusuk ini mampu dihambat dengan mekanisme yang sama seperti pada kemampuannya dalam menghambat bakteri patogen pangan. Meskipun demikian penggunaan bahan pengawet untuk mempertahankan masa simpan bahan pangan sebaiknya dikombinasi dengan bahan pengawet lainnya, misalnya penyimpanan suhu rendah, pengemasan vakum serta pengontrolan RH atau a w produk. KESIMPULAN Stabilitas campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa dipengaruhi oleh ph dan pemanasan. Pada ph rendah (45) aktivitas campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa lebih besar bila dibandingkan dengan ph tinggi (67). Campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa masih menunjukkan aktivitas antibakteri pada pemanasan 75 o C dan 100 o C selama 10, 20 dan 30 menit, sedangkan pada suhu 121 o C aktivitas antibakteri hanya diperlihatkan selama pemanasan 10 menit baik terhadap penggunaan tunggal antibakteri metabolit Lb.plantarum kik, MAG maupun campuran dari keduanya. Penggunaan campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa pada konsentrasi 2 MIC hingga hari ke 4 penyimpanan masih dapat diterima secara baik oleh panelis, namun pada hari ke 6 sebagian panelis menyatakan agak tidak suka dan sebagian menyatakan biasa, sedangkan pada perlakuan 4 MIC dapat dipertahankan hingga 6 hari pada suhu ruang dan secara organoleptik (warna,bau dan aroma) masih dapat diterima oleh panelis.

131 119 DAFTAR PUSTAKA Alakomi HL, Skytta E, Saarela M, MattilaSandholm T Lactic acid permeabilizes Gramnegatif bacteria by distrupting the outer membrane. Appl. Environ. Microbiol. 66: Beuchat LR Comparison of antivibrio activities of potassium sorbate, sodium benzoate, and glycerol and sucrose esters of fatty acid. Appl. Environ. Microbiol.: Davidson PM, Branen AL Antimicrobial in Food. Marcel Dekker. New York Elida M Profil Bakteri Asam Laktat dari Dadih yang Difermentasi dalam Berbagai Jenis Bambu dan Potensinya sebagai Probiotik (Thesis). Institut Pertanian Bogor: Program Studi Ilmu Pangan. Ewald C, FjelknerModig S, Johansson K, Sjoholm I, Ekens B Effects of processing on major flavonoids in processed onion, green beans, and peas. J. Food Chem. 64: Fardiaz S, Jenie BSL Mikrobiologi Pangan II. Laboratorium Mikrobiologi Pangan Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi Institut Pertanian Bogor. Fardiaz S Mikrobiologi Pangan I. Gramedia. Jakarta. Frazier WC, Westhoff DC Food Microbiology. 4 th ed. Mc GrawHill Book Co., New York. Garburtt J Essentials of Food Microbiology. Arnold, London Sydney, Auckland. Gino CN Aktivitas Ekstrak Etanol Sereh (Cymbopogon citratus (DC.) Stapf) terhadap Pertumbuhan dan Produksi Verotoksin oleh Escherichia coli Verotoksigenik. Thesis Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Haughton PJ, Rahman Laboratory Handbook for the Fractionation of Natural Extract. Chapman dan Hall. London. Jin LZ, Ho YW, Abdullah N, Ali MA, Jalaludin S Antagonistic effect of intestinal Lactobacillus isolated on pathogenes of chicken. Lett. in Appl. Microbiol. 23: Kabara JJ Antimicrobial agents derived from fatty acids. J. Am.Oil Chem. Soc. 61: Lambert RJ, Stratford M Weakacid preservatives: modelling microbial inhibition and response. J. Appl. Microbiol. 86: Mappiratu Penggunaan Biokatalis Dedak Kasar dalam Biosintesis Antimikroba Monoasilgliserol dari Minyak Kelapa. Disertasi program pascasarjana Institut Pertanian Bogor.

132 120 Mappiratu, Fardiaz D, Hasanuddin A Produksi dan aplikasi produk monoasilgliserol dari minyak kelapa dalam pengolahan santan awet. Laporan Penelitian Hibah Bersaing VII/2, Fakultas Pertanian Universitas Tadulako, Palu. Naidu AS, Clemens RA Probiotics. Di dalam: Naidu AS (Ed). Natural Food Antimicrobial Systems. CRC Press, New York. Oh DH, Marshall DL Enhanced inhibition of Listeria monocytogenes by glycerol monolaurat with organic acid. J. Food Sci. 59 (6) : Ray B Fundamental Food Microbiology 2 nd edition. CRC Press New York. Shashikant KN, Basappa SC, Srinivasa VM Studies on the antimicrobial and stimulatory factor of garlic (Allium sativum L.). J.Food Sci Tech India 18 (2): Surono I Probiotik Susu Fermentasi dan Kesehatan. Yayasan Pengusaha Makanan dan Minuman Seluruh Indonesia, Jakarta. Tsuchido T, Saeki T, Shibasaki I Death kinetics of Escherichia coli in a combined treatmen of health and monolaurin. J. Food Safety 3:5763. Ultee A. Gorris LGM, Smid Ej Bacterial activity of carvacrol towards the food borne pathogen Bacillus cereus. J. Appl. Microbiol. 85: Wang LL, Yang BK, Parkin KL, Johnson EA Inhibition of Listeria monocytogenes by monoacylglycerols synthesized from coconut oil and milk fat by lipase catalyzed glycerolysis. J. Agric. Food Chem. 41: Wirawati CU Potensi Bakteri Asam Laktat yang Diisolasi dari Tempoyak sebagai Probiotik. Thesis Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.

133 8. PEMBAHASAN UMUM Berbagai bahan pengawet yang dikenal umumnya hanya spesifik terhadap bakteri atau kapang saja, tidak untuk keduanya dengan kekuatan yang sama. Seperti asam benzoat dan propionat hanya efektif terhadap kapang dan khamir namun tidak efektif terhadap bakteri (Fardiaz dan jenie, 1989). Campuran metabolit Lb. plantarum kik MAG dapat memberikan sifat antimikroba terhadap bakteri maupun terhadap kapang dengan aktivitas yang tinggi terutama terhadap bakteri. Keunggulan lain adalah bahwa senyawa antimikroba ini termasuk senyawa alami yang sudah lama dikenal aman bagi kesehatan. Efek sinergi dari campuran metabolit BAL dan MAG minyak kelapa terhadap beberapa mikroba pangan ditunjukkan oleh meningkatnya penghambatan sekitar 2 3 kali lipat lebih tinggi dari pada penggunaan secara tunggal (9,19 13,12 mm penggunaan tunggal dan 23,2031,12 mm penggunaan campuran) Tingginya aktivitas penghambatan dari campuran metabolit Lb.plantarum kik MAG minyak kelapa ini berpeluang untuk dijadikan sebagai pengawet alami pada berbagai bahan pangan. Pada analisis kandungan asam organik dari metabolit BAL dan asam lemak dari MAG minyak kelapa ditemukan berbagai komponen yang telah dilaporkan oleh berbagai peneliti bahwa metabolit tersebut memiliki aktivitas antimikroba yang kuat. Senyawa yang berperan sebagai antimikroba yang ditemukan diantaranya adalah asam laktat, asam sitrat, asam asetat, dan asam propionat (Rahman, 1999, Naidu 2000) serta asam lemak berupa kaprilat, kaprat, laurat, dan meristat (Wang et al. 1993; Mappiratu 2002). Jenie et al. (2000) menyatakan bahwa bakteri asam laktat berpotensi digunakan sebagai antimikroba karena adanya sejumlah komponen yang bersifat antimikroba terutama asamasam organik, seperti asam laktat, asetat, sitrat maupun komponen lain di dalam metabolit BAL. Sementara Wang et al. (1993) dan Mappiratu et al. (2002) menemukan berbagai komponen pada MAG minyak kelapa, berupa asam lemak jenuh rantai pendek dan sedang, diantaranya asam kaprat, asam kaprilat dan asam laurat, yang terbukti dapat menghambat pertumbuhan bakteri, khamir dan kapang. Untuk menemukan isolat BAL yang menghasilkan metabolit yang bersinergi tinggi dengan MAG minyak kelapa, maka telah dilakukan seleksi

134 122 terhadap 6 jenis isolat BAL, yaitu Lb. plantarum pi28a, Lb. plantarum Sa 28k, Lb. plantarum kik, Lb. coryneformis, Lb. brevis dan Lb. acidophilus. Bakteri uji yang digunakan adalah L. monocytogenes Isolat BAL yang memberikan diameter penghambatan terbesar dinyatakan sebagai isolat terpilih. Hasil seleksi menunjukkan metabolit ke enam jenis BAL yang dicampur dengan MAG minyak kelapa dengan perbandingan 1:1 memperlihatkan peningkatan diameter penghambatan sekitar 2 3 kali lebih besar dibandingkan dengan penggunaan secara tunggal. Isolat BAL yang memberikan diameter penghambatan tertinggi bersama MAG minyak kelapa adalah Lb. plantarum kik yakni sebesar 31,12 mm, sedangkan isolatisolat lainnya menunjukkan diameter penghambatan sebesar 26,1 mm; 25,8 mm; 24,6 mm; 23,9 mm dan 23,2 mm masingmasing untuk Lb. acidophilus, Lb. brevis, Lb. plantarum Sa 28k, Lb. plantarum pi28a dan Lb. coryneformis. Jika digunakan secara tunggal, baik metabolit BAL maupun MAG hanya diperoleh diameter penghambatan sekitar 9,19 mm13,45 mm. Dari hasil analisis terhadap asamasam organik dalam metabolit yang dihasilkan dari keenam isolat BAL, isolat Lb. plantarum kik mengandung asam organik yang lebih tinggi dibanding isolatisolat lainnya, terutama kandungan asam laktat dan asam sitrat. Asam organik berfungsi sebagai antimikroba yang disebabkan oleh kemampuan dari asam tersebut dalam menurunkan ph sitoplasma. Di dalam sitoplasma dengan ph lebih tinggi (ph netral) menyebabkan asam organik melepaskan ion H +, semakin banyak ion H + semakin rendah ph sitoplasma (Ray 2001). Untuk mengembalikan ph internal sel ke ph normal, sel berusaha memompa kelebihan ion H + yang ada keluar sel. Aktivitas ini akan menguras energi dalam sel, sehingga sel akan kekurangan energi, sebagai akibatnya pertumbuhan sel terhambat dan dapat menyebabkan kematian sel (Benyamin dan Datta, 1995). MAG minyak kelapa dilaporkan memiliki aktivitas antimikroba karena dalam bentuk yang tidak terdisosiasi dan juga bersifat lipofilik menyebabkannya mudah berdifusi ke dalam sel, dan menembus membran plasma (Kabara, 1994). Gugus ester dari asam lemak MAG minyak kelapa mempengaruhi reaksi enzimatis pada membran seperti transpor elektron pada sistim respirasi, transpor proton maupun transpor nutrisi ke dalam sel yang akan mengurangi regenerasi ATP dan

135 123 pertumbuhan sel terhambat yang akhirnya menyebabkan kematian sel (Davidson dan Branen 1994). Efek sinergi dari asam organik dari metabolit Lb. plantarum kik dengan MAG minyak kelapa ini diduga karena kedua senyawa tersebut memiliki kesamaan dalam sifatnya sebagai antimikroba, yaitu dalam bentuk tidak terdisosiasi, sehingga saling menguatkan untuk berdifusi ke dalam sel, akibatnya poripori membran membesar. Makin besar poripori membran semakin banyak senyawa antimikroba yang masuk ke dalam sitoplasma, sehingga kemampuannya dalam mengganggu aktivitas enzimenzim yang terdapat pada sitoplasma terutama enzim yang berfungsi dalam pembentukan energi dan transpor nutrien lebih besar pula. Akibatnya isi sel keluar dan akhirnya mempercepat kematian sel bakteri. Hal inilah yang menyebabkan penghambatan yang lebih tinggi dari campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa bila dibandingkan dengan penggunaan tunggalnya.efek sinergi dari dua senyawa antimikroba juga dilaporkan oleh Ultee et al. (1999) dari karvakrol sebagai asam lemah yang tidak terdisosiasi dengan cymene yang bersifat hidrofobik terhadap B. cereus. Dilaporkan bahwa kedua senyawa tersebut secara bersamasama meningkatkan porositas membran, akibatnya membran menjadi tidak stabil dan komponen yang ada dalam membran sitoplasma terutama ion K + akan keluar, sehingga ATP tidak terbentuk yang diikuti dengan kematian sel. Untuk mempreroleh informasi rasio penggunaan campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa yang memberikan diameter penghambatan maksimum, maka dilakukan penelitian terhadap berbagai rasio, yakni rasio campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa masingmasing 40:1; 20:1; 10:1; 5:1; 5:2; 5:3; 5:4 dan 5:5. Dari hasil pengujian tersebut diperoleh rasio campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa yang optimum pada rasio 5:3 dengan diameter penghambatan sebesar 30,7 mm. Pada rasio 5:3, diduga antimikroba dapat bekerja lebih baik dalam menghambat sel bakteri yang disebabkan oleh kemampuannya dalam berdifusi ke dalam media agar dan memiliki polaritas yang optimum dibandingkan dengan rasio campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa yang lain. Menurut Kanazawa et al. (1995) bahwa suatu senyawa yang memiliki polaritas optimum akan mempunyai aktivitas antibakteri yang maksimum, karena interaksi suatu

136 124 senyawa antibakteri dengan sel bakteri memerlukan keseimbangan hidrofiliklipofilik (HLB). Polaritas senyawa antibakteri merupakan sifat fisik penting, sifat hidrofilik diperlukan untuk menjamin senyawa antimikroba larut dalam fase cair yang merupakan tempat hidup mikroba. Akan tetapi senyawa yang bekerja pada membran sel yang sifatnya hidrofobik memerlukan pula sifat lipofilik. Campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa dapat menghambat pertumbuhan sel bakteri Gram positif (L. monocytogenes dan B. cereus) maupun bakteri Gram negatif (S. Typhimurium dan E. coli), dengan aktivitas penghambatan terhadap bakteri Gram positif lebih tinggi. Hal ini disebabkan adanya perbedaan pada struktur dinding sel bakteri Gram positif dan negatif. Bakteri Gram positif mengandung 90% peptidoglikan yang banyak mengandung asam amino alanin dan cenderung bersifat hidrofobik, sehingga memudahkan senyawa antimikroba campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa masuk ke dalam sel dan menemukan sasaran untuk bekerja. Pada bakteri Gram negatif lapisan luar dinding sel hanya mengandung 510% peptidoglikan, selebihnya terdiri dari protein, lipopolisakarida dan lipoprotein (Fardiaz 1992). Adanya sifat antimikroba dari campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa baik pada Gram positif maupun Gram negatif berkaitan dengan komponenkomponen yang terkandung dalam senyawa antimikroba tersebut. Asam laktat, asam asetat, asam propionat dan asam malat merupakan komponen dalam metabolit Lb. plantarum kik yang dilaporkan oleh Jenie et al. (2000) maupun Salminen dan Von Wright (2004) bersifat sebagai antimikroba. Sejumlah senyawa komponen yang terkandung dalam MAG minyak kelapa yang bersifat antimikroba adalah berupa asam lemak rantai pendek dan menengah (kaprilin, kaprat, laurat maupun meristin). Hal ini sesuai dengan yang dilaporkan oleh Wang et al. (1993 ) dan Mappiratu et al. (2002). Kabara (1994) melaporkan bahwa ester monoasilgliserol dalam bentuk monolaurin, monokaprilin, dan monokaprin memiliki daya antimikroba yang kuat terutama terhadap B. cereus, S. aureus dan B. subtilis. Lebih lanjut dinyatakan bahwa mekanisme penghambatan diduga dengan cara bereaksinya monolaurin, monokaprilin, dan monokaprin dari minyak kelapa dengan membran sel bakteri

137 125 atau komponenkomponen dalam sitoplasma, sehingga mengganggu proses transport asam amino, dan pada konsentrasi tinggi dapat menyebabkan koagulasi komponen sitoplasma sel, serta menganggu sistem proton motive force yang berperan dalam produksi energi pada sel. Campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa dapat menghambat bakteri patogen dengan nilai MIC 1,23%. Bila dibandingkan dengan nilai MIC yang ditemukan Wang et al. (1993) pada asam lemak monokaprilin minyak kelapa sebesar 10%, Lee et al. (2002) pada gliserol monolaurat sebesar 5%, maka campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa yang digunakan dalam penelitian ini memiliki nilai MIC yang jauh lebih rendah. Demikian halnya bila dibandingkan dengan beberapa senyawa antimikroba alami lainnya, seperti pada ekstrak daun beluntas (Ardinsyah, 2002) sekitar 2,23,19%; daun salam (Nuraida dan Dewanti, 2001) sekitar 1,493,97% maupun pada biji picung (Nuraida et al. 1999) sekitar 3,366,25%. Hal ini membuktikan bahwa terbentuknya efek sinergi dari campuran metabolit BALMAG minyak kelapa sekitar 2 3 kali lebih kuat. L. monocytogenes merupakan bakteri yang paling sensitif terhadap campuran BALMAG dibandingkan dengan bakteri uji lainnya (B. cereus, S. Typhimurium dan E. coli) sedangkan yang paling tahan adalah E. coli dengan nilai MIC masingmasing 1,2% dan 3%. Selain bersifat sebagai antibakteri, campuran metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa juga bersifat sebagai antikapang. Dalam penelitian uji antikapang dilakukan terhadap A. flavus pada konsentrasi 020%. Hasil pengkuran masa sel kapang menunjukkan campuran metabolit Lb. plantarum kikmag dapat mereduksi berat miselia kapang sebesar (0,862,75 mg/ml) pada konsentrasi 0 20%, sedangkan pada penggunaan tunggal dari metabolit Lb. plantarum kik maupun MAG minyak kelapa hanya dapat mereduksi berat miselia kapang sebesar ( 0,351,54 mg/ml). Berkaitan dengan aktivitas antibakteri dan antikapang dari campuran metabolit di atas, maka campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa lebih kuat sebagai antibakteri dari pada sebagai antikapang, yaitu campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa lebih tinggi aktivitas antibakterinya dibandingkan aktivitas antikapangnya. Mappiratu (1999) melaporkan efek antikapang dari MAG minyak kelapa tidak hanya berasal dari monolaurat tapi juga berasal dari monokaprilin, monokaprin dan monomeristin,

138 126 sedangkan dalam metabolit BAL yang berperan sebagai antikapang selain karena asamasam organik juga karena adanya substansi dengan berat molekul rendah yang antara lain asam fenil laktat, asam phydroksi fenil laktat, asam benzoat, dan metil hidantoin (Sjogren et al. 2003). Hal yang sama juga dilaporkan oleh Roy et al. (1996) bahwa efek antikapang dari metabolit BAL tidak hanya disebabkan oleh asam organik tetapi juga karena adanya senyawa protein. Perbedaan antara membran sitoplasma sel prokariotik (bakteri) dan sel eukariotik (kapang) adalah pada fosfolipid dan protein yang menyusun membran tersebut. Adanya perbedaan kemampuan campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa dalam menghambat bakteri dan kapang disebabkan oleh membran eukariotik yang mengandung sterol, sedangkan pada prokariotik tidak mengandung sterol. Komposisi membran sel prokariotik yang tidak mengandung sterol kirakira terdiri dari 60% dan 40% fosfolipid (Fardiaz 1992). Kemungkinan lainnya adalah adanya perbedaan struktur dinding sel antara sel prokariotik dan sel eukariotik yang menyebabkan perbedaan pada kemampuan penetrasi campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa melalui dinding sel. Dinding sel eukariotik umumnya lebih tebal dibandingkan dengan dinding sel prokariotik, pada eukariotik tidak terdapat lapisan peptidoglikan. Dinding sel eukariotik terdiri dari polimer glukosa dengan ikatan beta 1,3, sedangkan dinding sel prokariotik tidak mengandung khitin atau polimer glukosa dengan ikatan beta 1,3 (Fardiaz 1992). Dengan demikian untuk dapat menghambat pertumbuhan kapang, maka campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa memerlukan konsentrasi yang lebih tinggi dibanding terhadap bakteri. Mekanisme antibakteri dari campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa terhadap L. monocytogenes dan S. Typhimurium umumnya diawali dengan kemampuannya dalam merusak dinding sel, selanjutnya menembus dan merusak bagian membran sitoplasma. Kerusakan pada membran sitoplasma menimbulkan gangguan pada permeabilitas membran yang berakibat pada keluarnya isi sel, serta mengganggu pembentukan protein maupun asam nukleat. Berdasarkan analisis kebocoran sel yang diakibatkan oleh campuran metabolit Lb. plantarum kikmag terhadap L. monocytogenes, B. cereus dan S. Typhimurium, terlihat bahwa jumlah protein yang dikeluarkan dari sel lebih besar

139 127 dibandingkan dengan asam nukleat. Kemungkinan campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa yang digunakan langsung dengan cepat mencapai dan bereaksi dengan membran sel serta mengganggu sistem transpor elektron, yang mengakibatkan gangguan pada proses transpor keluar masuknya cairan intraseluler sel yang berakibat bocornya sel bakteri. Hasil penelitian ini sejalan dengan temuan Davidson dan Branen (1994), yang membuktikan bahwa kebocoran sel bakteri Pseudomonas spp. yang diberi perlakuan dengan butylated hydroxyanisole (BHA) terdeteksi lebih banyak pada panjang gelombang 280 nm dibanding pada 260 nm. Selanjutnya dinyatakan bahwa senyawa antimikroba dapat bereaksi dengan komponen fosfolipid dari membran, sehingga mengakibatkan kebocoran sel yang menyebabkan sel lisis karena tidak mampu menahan tekanan intraseluler. Untuk menganalisis kebocoran sel selain mengamati kebocoran protein dan asam nukleat dalam penelitian ini juga diamati kebocoran ion logam Ca 2+ dan ion K +. Dari pola kebocoran ionion Ca 2+ dan K +, ditemukan bahwa jumlah ion Ca 2+ dan ion K + yang dilepaskan lebih besar terhadap L. monocytogenes dan B. cereus dibandingkan terhadap S. Typhimurium. Hal ini menunjukkan bahwa kebocoran ion sel awalnya terjadi pada bagian dinding sel kemudian ke membran sel. Makin tinggi dosis MIC yang diaplikasikan, maka jumlah ion K + dan Ca 2+ yang dilepaskan oleh sel L. monocytogenes, B. cereus maupun S.Typhimurium lebih tinggi pula. Meningkatnya jumlah ion Ca 2+ dan ion K + yang dikeluarkan oleh sel ke lingkungan luar menunjukkan bahwa sel telah mengalami lisis yang diakibatkan oleh adanya kerusakan pada membran sitoplasma. Perbedaan struktur, sifat dan komposisi kimia dinding dan membran sel bakteri menyebabkan perbedaan kerusakan oleh metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa terhadap bakteri uji. Perbedaan ini dapat diamati dengan melihat perubahanperubahan bentuk sel di bawah SEM. Pada sel L. monocytogenes perubahan yang terlihat adalah terjadinya perubahan ukuran sel membesar, sel lisis dan mengkerut dibanding kontrol. Hal ini membuktikan bahwa campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa dapat merusak dinding sel, mengubah permeabilitas membran, menyebabkan kebocoran protein dan asam nukleat. Menurut Davidson dan Branen (1994) pada keadaan membran tidak dapat menahan tekanan dari sitoplasma maka akan terjadi kebocoran membran dan aliran

140 128 sitoplasma keluar sel bila jumlah sitoplasma yang keluar dalam jumlah besar, maka sel menjadi mengkerut dan akhirnya menyebabkan kematian sel. Hasil pengamatan terhadap S. Typhimurium menunjukkan bahwa mekanisme kerja dari campuran metabolit Lb. plantarum kikmag adalah dengan cara merusak dinding sel yang berlanjut ke kerusakan membran sitoplasma serta menghambat proses pembentukan dan pemisahan septa. Septa dibutuhkan oleh sel untuk memperbanyak diri dengan cara pembelahan sel. Bila proses pembentukan dan pemisahan septa terganggu, maka proses pertumbuhan terhambat. Septa yang tidak normal bila membelah menyebabkan sel berbentuk tidak normal, sebagian berukuran kecil dan sebagian besar. Bila konsentrasi ditingkatkan dari 1 MIC menjadi 2 MIC terlihat kerusakan pada permukaan sel yang lebih besar. Pengujian stabilitas antibakteri campuran metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa menunjukkan bahwa campuran metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa dipengaruhi oleh ph. Campuran metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa masih menunjukkan aktivitas antibakteri sampai dengan ph 7, demikian halnya penggunaan MAG minyak kelapa secara tunggal namun penggunaan metabolit Lb. plantarum kik secara tunggal, tidak menunjukkan aktivitasnya pada ph 7. Penggunaan campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa pada ph rendah (45) menghasilkan diameter penghambatan yang lebih besar dari pada ph tinggi (67), demikian halnya penggunaan tunggal MAG minyak kelapa. Hal ini diduga pada campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa pada ph rendah bentuk tidak terdisosiasi lebih banyak metabolit Lb.plantarum kik maupun MAG minyak kelapa lebih kuat dibandingkan dengan ph tinggi, sehingga kemampuannya dalam menghambat aktivitas bakteri juga tinggi. Penggunaan tunggal dari metabolit Lb. plantarum kik pada ph 7 tidak menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap semua bakteri uji yang diduga disebabkan karena asam organik yang terdapat dalam metabolit Lb. plantarum kik berada dalam bentuk terdisosiasi sehingga senyawa antimikroba sukar masuk ke dalam membran sel (Yuk et al. 2005). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa masih stabil meskipun ph ditingkatkan hingga ph 7. Hal ini menguntungkan untuk aplikasinya pada berbagai jenis bahan pangan dengan kisaran ph yang beragam.

141 129 Pemanasan yang dilakukan pada metabolit Lb. plantarum kik, MAG minyak kelapa maupun campuran keduanya pada suhu 75 dan 100 o C selama 10, 20 dan 30 menit serta 121 o C selama 10 menit masih memiliki aktivitas antibakteri yang cukup tinggi tanpa mengalami perubahan yang berarti dibanding tanpa pemanasan. Hal ini mengindikasikan metabolit Lb. plantarum kik dan MAG minyak kelapa maupun campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa dapat diaplikasikan pada bahanbahan pangan sebelum proses pemanasan. Hasil penelitian ini sejalan dengan temuan Hurst dan Hoover (1993) yang menyatakan bahwa antibakteri nisin tidak kehilangan aktivitasnya ketika diaplikasikan menggunakan autoklaf pada suhu 121 o C. Nisin umumnya ditambahkan pada bahan pangan yang dikalengkan karena dapat menginaktifkan spora bakteri melalui perusakan protein spora. Stabilitas aktivitas campuran metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa masih efektif hingga ph 7 maupun pada suhu tinggi. Oleh sebab itu dalam aplikasinya sebagai bahan pengawet memungkinkan untuk digunakan pada proses pengolahan pangan yang menggunakan suhu tinggi maupun pada bahanbahan pangan yang ber ph 7. Aplikasi pada bahan pangan tahu sebagai model sistem pangan konsentrasi 2 dan 4 MIC mampu mempertahankan masa simpan tahu. Pada konsentrasi 2 MIC mampu mempertahankan masa simpan tahu selama 4 hari dan 6 hari pada pada konsentrasi 4 MIC selama penyimpanan suhu kamar, dan secara organoleptik masih dalam kisaran yang dapat diterima. Tahu tanpa bahan pengawet hanya dapat bertahan selama 1 hari pada suhu kamar.

142 9. KESIMPULAN DAN SARAN UMUM Hasil seleksi 6 (enam) jenis isolat bakteri asam laktat yang bersinergi dengan monoasilgliserol semuanya memperlihatkan adanya efek sinergi, namun efek sinergi yang paling besar adalah isolat dari Lb. plantarum kik dan yang paling rendah adalah isolat dari Lb. coryneformis. Efek sinergi yang optimim diperoleh pada rasio campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa sebesar 5:3. Campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa mempunyai spektrum penghambatan yang cukup luas, yakni mencakup bakteri Gram positif, bakteri Gram negatif, bakteri pembentuk spora dan kapang. Pengujian terhadap nilai MIC campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa pada bakteri L. monocytogenes, B. cereus, E. coli dan S. Typhimurium menunjukkan nilai MIC terendah pada bakteri L. monocytogenes dan yang tertinggi pada E. coli. Pengujian terhadap berat miselia kapang A. flavus menunjukkan perlakuan campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa pada konsentrasi 5 20% mampu mereduksi berat miselia kapang sebesar (0,862,75 mg/ml), kemudian diikuti oleh perlakuan tunggal dari MAG minyak kelapa (0,76 1,88 mg/ml), dan metabolit Lb. plantarum kik (0,351,33 mg/ml) serta yang terkecil adalah perlakuan tanpa penggunaan antikapang (kontrol). Pengujian stabilitas aktivitas antibakteri dari campuran metabolit Lb. plantarum kikmag pada berbagai ph dan suhu yang berbeda menunjukkan bahwa campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa masih mempunyai penghambatan pada kisaran ph 47. Walaupun demikian penghambatan yang besar diperoleh pada ph 45, sedangkan pada ph 7 menunjukkan penghambatan yang rendah. Aktivitas antibakteri campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa terhadap berbagai suhu pemanasan menunjukkan kondisi yang tetap stabil pada suhu 75 dan 100 o C selama pemanasan 10, 20 dan 30 menit serta pada suhu 121 o C selama pemanasan 10 menit. Dan sebagai pengujian awal pada sistem pangan, aplikasi perendaman tahu dalam campuran metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa pada konsentrasi 4 MIC mampu memperpanjang masa simpan tahu selama 6 hari pada suhu ruang.

143 131 Mekanisme kerja dari campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa terhadap L. monocytogenes, B. cereus dan S. Typhimurium memperlihatkan pola yang berbeda. Pada L. monocytogenes dan B. cereus kebocoran protein, asam nukleat dan ion logam lebih besar bila dibandingkan dengan kebocoran yang terjadi pada S. Typhimurium. Selanjutnya diketahui bahwa campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa mampu mengubah morfologi sel L. monocytogenes, antara lain dengan merusak dinding sel dan membran sel, serta mengganggu material genetik sel bakteri yang diperlihatkan dengan pembengkakan dan pemanjangan, lalu diikuti dengan pengkerutan dan pengecilan sel (sel mengalami lisis), sedangkan untuk S. Typhimurium terjadi gangguan pada pembelahan sel, yakni pada pembentukan septa sehingga diperoleh sel yang berukuran tidak sama dan pada konsentrasi yang lebih tinggi memperlihatkan kerusakan yang lebih parah. SARAN Perlu dilakukan skrining penentuan jenisjenis isolat BAL yang bersinergi kuat dengan MAG minyak kelapa agar dapat diperoleh informasi genetik dari isolat BAL tersebut. Selain itu untuk memastikan apakah mekanisme kerja zat antibakteri dari campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa seperti yang telah dibuktikan dalam penelitian ini, maka perlu dilakukan penelitian ulangan dengan menggunakan TEM (Transmition Electron Microscope) agar terlihat jelas bagian bagian dari bakteri yang dirusak. Hasil dari penelitian awal aplikasi senyawa antibakteri campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa pada tahu, perlu ditingkatkan dengan rancangan percobaan dan metodologi untuk scaleup agar dapat diaplikasikan dalam industri pangan, diantaranya teknik pencampuran zat antibakteri ke dalam bahan pangan, dosis, serta stabilitas penyimpanan dalam kemasan yang berbedabeda. Disampping itu, campuran metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa yang memiliki aktivitas penghambatan cukup baik terhadap bakteri L. monocytogenes maupun terhadap Salmonella Typhimurim, dan telah diketahui kedua jenis bakteri ini sering ditemukan pada bahan pangan susu, ikan maupun produk unggas, maka perlu dilakukan penelitian untuk aplikasi campuran

144 132 metabolit Lb. plantarum kikmag minyak kelapa bahan pangan susu, ikan maupun produk unggas. DAFTAR PUSTAKA Ardiansyah Aktivitas antimikroba ekstrak daun beluntas (Plucea indica L.) dan stabilitas aktivitasnya pada berbagai konsentrasi garam dan tingkat ph. Jurnal Teknologi dan Industri Pangan. Vol. XIV (2): Blaszyk M, Holley RA Interaction of monolaurin, eugenol and sodium citrate on growth of common meat spoilage and pathogenic organisms. J. of Food Microbiol. 39: Davidson, PM, Branen AL Antimicrobial in Food. Mercel Dekker, New York. Fardiaz S Mikrobiologi Pengolahan Pangan Lanjut. Bogor PAU Pangan dan Gizi Institut Pertanian Bogor. Garburtt J Essentials of Food Microbiology. Arnold, London, Sydney, Auckland. Hust A, Hoover DG Nisin. Di dalam: Davidson PM, Branen AL (Ed). Antimicrobials in Foods. 2 nd Ed. Marcel Dekker. New York. Jenie BSL, Suliantari, Andjaya N Pengembangan Produk Makanan Tradisional Rendah Garam Berbasis Ikan Melalui Aplikasi Bakteri Asam Laktat Penghasil Bakteriosin. Laporan Hibah Bersaing Tahun 1999/2000. Kabara JJ Antimicrobial agents derived from fatty acids. J. Am. Oil Chem. Soc. 61: Kanazawa AT, Ikeda T, Endo A novel approach to made of action on cationic biocides morphological effect on antibacterial activity. J. Appl Bacteriol 78: Lee JY, Kim YS, Shin DH Antimicrobial synergistic effect of linolenic acid and monoglyceride against Bacillus cereus and Staphylococcus aureus. J. of Agric. and Food Chem. 50: Mappiratu Penggunaan Biokatalis Dedak Kasar Dalam Biosintesis Antimikroba Monoasilgliserol dari Minyak kelapa. Disertasi Program Pascasarjana IPB, Bogor. Mappiratu, Umrah dan Ijirana Pemanfaatan Sabun Hasil Samping Pengolahan Minyak Kelapa dalam Pembuatan Monoasilgliserol Menggunakan Lipase Apergillus niger Amobil Isolat Kapang Kopra. Laporan Penelitian RUT VIII/2 Fakultas Pertanian, UNTAD. Naufalin R Kajian Sifat Antimikroba Ekstrak Bunga Kecombarang (Nicolaia speciosa Horan) Terhadap Berbagai Mikroba Patogen Dan Perusak Pangan. Disertasi Sekolah Pascasarjana Intitut Pertanian Bogor. Bogor.

145 133 Oh DH, Marshall DL Enhanced inhibition of Listeria monocytogenes by glycerol monolaurin with organic acid. J. Food Science, 59 (6): Paster N, Zhou L, Menashrov M, Shapira R Posibble synergistic effect of nisin and propionic acid on the growth of the mycotoxigenetic fungi Aspergillus parasiticus, Aspergillus ochraceus, and Fusarium moniliforme. Journal of Food Protec. 62: Ray B Probiotic of Lactic Acid Bacteria Science or Myth. Di dalam NATO ASI Series, editor. Lactic Acid Bacteria. Current Advance in Metabolism, Genetic, and Application. Volume V (98). SpringerVerlag, Germany. Salminen S, von Wright A Lactic Acid Bacteria. Marcel Dekker Inc. New York. Sjogren J, Jesper M, Anders B, Johan S and Lennart K Antifungal 3 Hydroxy Fatty Acids from Lactobacillus plantarum MiLAB. Appl and Env. Vol.69: Ultee A, Bennil MHJ, Moezelaar R The phenolik hydroxyl group of carvacrol is essential for action against the foodborne pathogen Bacillus cereus. Appl and Environ Microbiol, Vol 68, No. 4: Wang LL, Yang BK, Parkin KL, Johnson EA Inhibition of Listeria monocytogenes by monoacylglycerols synthesized from coconut oil and milk fat by lipasecatalyzed glycerolysis. J. Agric Food Chem. 41:

146 134 Lampiran 1. Konsentrasi MAG minyak kelapa dalam larutan etanol % MAG minyak kelapa Diameter penghambatan (mm) ,0 9,65 11,94 12,34 13,0 13,69 13,88 Lampiran 2. Data aktivitas antibakteri dari kultur BAL dan MAG minyak kelapa secara tunggal Jenis mikroba Diameter penghambatan (mm) Ulangan 1 Ulangan 2 Simplo Duplo Simplo Duplo Rataan Lb.plantarum kik 13,10 13,13 12,84 12,85 12,98 ± 0,14 Lb.brevis 1,6 13,35 13,15 13,85 13,13 13,12 ± 0.29 Lb.plantarum pi28a 9,30 9,29 9,02 9,15 9,19 ± 0,11 Lb.plantarum sa28k 9,25 9,45 9,15 9,12 9,24 ± 0,13 Lb.acidophilus 13,65 13,45 13,50 13,20 13,45 ± 0,16 Lb.coryneformis 9,60 10,30 9,78 10,52 10,05 ± 0,37 Monoasilgliserol 12,0 11,85 11,95 11,96 11,94 ± 0,07 Lampiran 3. Data aktivitas antimikroba gabungan metabolit BALMAG terhadap bakteri uji Diameter penghambatan (mm) Jenis antimikroba Ulangan 1 Ulangan 2 Rataan Simplo Duplo Simplo Duplo Lb.plantarumkik + monoasilgliserol 31,24 31,17 31,28 31,76 31,12 ± 0,23 Lb.brevis 1,6 + monoasilgliserol 26,10 25,89 25,85 25,52 25,84 ± 0,21 Lb.plantarum pi28a + monoasilgliserol 23,65 23,85 23,90 24,16 23,89 ± 0,18 Lb.plantarum sa28k + monoasilgliserol 24,32 24,52 24,88 24,60 24,58 ± 0,20 Lb.acidophilus + monoasilgliserol 25,94 26,03 27,12 26,27 26,09 ± 0,47 Lb.coryneformis + monoasilgliserol 24,89 23,30 23,38 23,23 23,20 ± 0,69

147 135 Lampiran 4. Data rasio metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa terhadap L.monocytogenes Diameter penghambatan (mm) Rasio metabolit BALMAG Ulangan 1 Ulangan 2 Rataan Simplo Duplo Simplo Duplo 40:1 13,14 13,97 13,10 13,39 13,40 ± 0,35 20:1 13,12 13,56 13,78 13,34 13,70 ± 0,25 10:1 15,31 15,72 15,12 15,35 15,20 ± 0,22 5:1 18,27 19,02 18,19 18,04 18,38 ± 0,37 5:2 22,13 22,27 22,00 21,88 22,07 ± 0,15 5:3 30,67 30, ,78 30,68 ± 0,06 5:4 30,95 30,65 30,58 31,14 30,83 ± 0,29 5:5 30,85 30,16 31,18 32,21 31,10 ± 0,74 Lampiran 5. Data aktivitas antimikroba metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa terhadap beberapa bakteri uji Jenis bakteri patogen Diameter penghambatan (mm) Ulangan 1 Ulangan 2 Simplo Duplo Simplo Duplo Rataan L.monocytogenes 30,66 29,55 30,84 30,45 30,66 ± 0,49 B.cereus 28,36 28,55 27,95 28,14 28,25 ± 0,23 S.Typhimurium 22,32 22,44 22,19 21,53 22,12 ± 0,35 Escherichia coli 19,55 21,10 20,30 19,85 20,20 ± 0,58 Lampiran 6. Diameter penghambatan (mm) dari beberapa jenis asam organik Jenis asam 1. Asam Laktat (komersial) 2. Asam asetat (komersial) 3. Kultur Lb. plantarum kik 4. Asam sitrat (komersial) 5. Asam asetat (komersial + MAG) 6. Asam laktat (komersial + MAG) 7. Asam sitrat (komersial + MAG) 8. Kik + MAG Diameter penghambatan (mm) 10,39 13,81 12,98 10,89 32,16 27,25 25,21 31,12

148 136 Lampiran 6a. Nilai MIC campuran metabolit Lb.plantarum kikmag terhadap L.monocytogenes Konsentrasi metabolit BALMAG Jumlah Listeria monocytogenes per ml (inkubasi 24 jam 30 o C) Ulangan 1 Ulangan 2 Rataan Nilai log 0 5,5 X ,6 X ,55 X ,75 0,25 3,74 X ,49 X ,62X ,56 0,50 3,54 X ,75 X ,27 X ,51 0,75 4,0 X ,72 X ,86 X 106 6,59 1,0 3,23 X ,39 X ,31 X ,52 1,25* 2,84 X 5 2,68 X 5 2,76 X 5 5,44 1,50 2,23 X 5 2,23 X 5 2,23 X 5 5,35 1,75 9,3 X ,4 X ,85 X ,95 2,0 8,0 X ,7 X ,85 X ,89 Jumlah mikroba awal L. monocytogenes 5,3 X 10 6 (1) dan 3,7 X 10 6 (2) Lampiran 7. Nilai MIC campuran metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa terhadap berbagai jenis bakteri MANA

149 137 7b. Nilai MIC campuran metabolit Lb.plantarum kik MAG terhadap B.cereus Konsentrasi metabolit BALMAG Jumlah B.cereus per ml (inkubasi 24 jam 37 o C) Ulangan 1 Ulangan 2 Rataan Nilai log 0 3,03 X ,36 X ,19 X ,51 0,2 3,12 X ,35 X ,24X ,49 0,4 2,55 X ,93 X ,74 X ,44 0,6 3,15 X ,23 X ,19 X ,49 0,8 2,93 X ,0 X ,97 X ,47 1,0 2,51 X 6 2,72 X10 6 2,62 X10 6 6,41 1,20 1,78 X 6 2,5 X ,14 X ,4* 4,92 X ,66 X ,29 X ,72 1,6 2,55 X ,26 X ,41 X ,38 1,8 8,0 X ,7 X ,35 X ,92 Jumlah mikroba awal B.cereus 8,1 X 10 6 (1) dan 5,2 X 10 6 (2)

150 138 7c. Nilai MIC campuran metabolit Lb.plantarum kik MAG terhadap S.Typhimurium Konsentrasi metabolit BALMAG Jumlah S.Typhimurium per ml (inkubasi 24 jam 37 o C) Ulangan 1 Ulangan 2 Rataan Nilai log 0 3,12 X ,99 X ,05 X ,48 0,5 2,91 X ,07 X ,99X ,47 1,0 6,39 X ,41 X ,89 X ,77 1,5 2,87 X ,13 X ,99 X ,48 2,0 1,89 X ,43 X ,16 X ,33 2,5* 1,57 X10 5 1,51 X10 5 1,54 X10 5 5,19 3,0 7,9 X ,2 X ,05 X ,91 Jumlah mikroba awal S.Typhimurium 2,1 X 10 6 (1) dan 4,2 X 10 6 (2)

151 139 7d. Nilai MIC campuran metabolit Lb.plantarum kik MAG minyak kelapa terhadap E.coli Konsentrasi metabolit BALMAG Jumlah S.Typhimurium per ml (inkubasi 24 jam 37 o C) Ulangan 1 Ulangan 2 Rataan Nilai log 0 3,51 X ,34 X ,43 X ,53 0,5 3,19 X ,21 X ,2 X ,51 1,0 3,04 X ,22 X ,13 X ,49 1,5 2,81 X ,94 X ,88 X ,46 2,0 5,25 X ,39 X ,32 X ,73 2,5 3,25 X10 6 3,09 X10 5 3,17 X10 6 6,50 3,0* 3,85 X ,11 X ,985 X ,59 3,5 9,9 X ,3 X ,6 X ,98 Jumlah mikroba awal E.coli 5,7 X 10 6 (1) dan 6,9 X 10 6 (2)

152 140 Lampiran 9 a. Pengaruh metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa terhadap kebocoran sel L. monocytogenes Dosis MIC Ulangan 1 260?nm Ulangan 2 Rataan Ulangan 1 280?nm Ulangan 2 Rataan 0 0,05 0,04 0,045 0,03 0,03 0,03 1 0,49 0,39 0,44 0,55 0,63 0,59 2 0,71 0,81 0,76 0,79 0,95 0,87 Lampiran 9 b. Pengaruh metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa terhadap kebocoran sel B. cereus Dosis MIC 260?nm 280?nm Ulangan 1 Ulangan 2 Rataan Ulangan 1 Ulangan 2 Rataan 0 0,03 0,06 0,04 0,04 0,03 0, ,47 0,35 0,41 0,48 0,52 0,50 2 0,65 0,69 0,67 0,77 0,71 0,74 Lampiran 9c. Pengaruh metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa terhadap kebocoran sel S. Typhimurium Dosis MIC 260?nm 280?nm Ulangan 1 Ulangan 2 Rataan Ulangan 1 Ulangan 2 Rataan 0 0,04 0,03 0,035 0,05 0,03 0,04 1 0,31 0,35 0,33 0,39 0,43 0,41 2 0,40 0,48 0,44 0,51 0,53 0,52

153 141 Lampiran 10 a. Pengaruh metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa terhadap kebocoran ion logam L. monocytogenes Dosis MIC Ion Ca ++ Ion K + Ulangan 1 Ulangan 2 Rataan Ulangan 1 Ulangan 2 Rataan 0 0,033 0,035 0,034 0,02 0,03 0, ,21 40,39 42,30 30,83 32,37 31,6 2 77,29 75,77 76,53 44,98 44,14 44,56 Lampiran 10b. Pengaruh metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa terhadap kebocoran ion logam B. cereus Dosis MIC Ion Ca ++ Ion K + Ulangan 1 Ulangan 2 Rataan Ulangan 1 Ulangan 2 Rataan 0 0,033 0,031 0,032 0,024 0,020 0, ,96 36,52 37,24 29,40 29,30 29, ,68 65,30 65,49 39,95 40,43 40,19 Lampiran 10 c. Pengaruh metabolit Lb. plantarum kik MAG minyak kelapa terhadap kebocoran ion logam S. Typhimurium Dosis MIC Ion Ca ++ Ion K + Ulangan 1 Ulangan 2 Rataan Ulangan 1 Ulangan 2 Rataan 0 0,025 0,031 0,028 0,02 0,01 0, ,86 26,66 26,26 2,43 22,51 22, ,12 47,12 46,12 32,66 23,0 32,83

154 142 Lampiran 10. Metabolit dari beberapa isolat bakteri asam laktat (a) (b) (c) a) Lb. acidophilus b) Lb. brevis dan c) Lb.plantarum kik (a) (b) (c) a) Lb.plantarum Sa 28; b) Lb. plantarum pi 28 dan c) Lb. coryneformis

155 Lampiran 11. Monoasilgliserol minyak kelapa 143

156 144