AKTIVITAS SUBSTRAT ANTIMIKROBA BAKTERI ASAM LAKTAT YANG DIISOLASI DARI DAGING SAPI TERHADAP BAKTERI PATOGEN DAN KONSENTRASI MINIMUM PENGHAMBATANNYA

Transkripsi

1 AKTIVITAS SUBSTRAT ANTIMIKROBA BAKTERI ASAM LAKTAT YANG DIISOLASI DARI DAGING SAPI TERHADAP BAKTERI PATOGEN DAN KONSENTRASI MINIMUM PENGHAMBATANNYA SKRIPSI TRIANI WIDIASIH PROGRAM STUDI TEKNOLOGI HASIL TERNAK FAKULTAS PETERNAKAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2008

2 RINGKASAN TRIANI WIDIASIH. D Aktivitas Substrat Antimikroba Bakteri Asam Laktat yang Diisolasi dari Daging Sapi terhadap Bakteri Patogen dan Konsentrasi Minimum Penghambatannya. Skripsi. Program Studi Teknologi Hasil Ternak, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Pembimbing Utama : Irma Isnafia Arief, S. Pt., M. Si. Pembimbing Anggota : Dr. Ir. Rarah Ratih Adjie Maheswari, DEA Daging sebagai salah satu bahan pangan hasil ternak memiliki sifat mudah rusak atau mempunyai umur simpan yang pendek. Kerusakan bahan pangan dapat disebabkan oleh beberapa faktor, diantaranya secara biologis oleh mikroorganisme, walaupun tidak semua dari mikroorganisme tersebut memiliki efek yang negatif. Sebagian bakteri contohnya yaitu bakteri asam laktat (BAL) dapat dimanfaatkan sebagai biopreservatif (bahan pengawet alami), karena BAL dapat menghasilkan produk metabolit yang bersifat antimikroba seperti asam organik, hidrogen peroksida, karbon dioksida, diasetil, dan bakteriosin. Bakteri asam laktat sering ditemukan secara alamiah dalam bahan pangan, diantaranya dalam daging dan produk olahannya. Penggunaan BAL sebagai bahan pengawet alami dapat dilakukan melalui dua cara yaitu penambahan kultur BAL sebagai kultur starter pada produk pangan atau pemanfaatan metabolit antimikroba BAL sebagai pengawet alami. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari dan mendapatkan informasi tentang kemampuan BAL hasil isolasi dari daging sapi dalam menghasilkan substrat antimikroba serta karakteristik dari substrat yang dihasilkan meliputi aktivitas penghambatannya terhadap bakteri patogen Gram negatif dan Gram positif. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Bagian Ilmu Produksi Ternak Perah dan Laboratorium Bagian IPT Ruminansia Besar Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilaksanakan selama empat bulan dari bulan Januari hingga April Penelitian ini menggunakan 12 isolat BAL hasil isolasi dari daging sapi (Arief et al., 2006) serta tiga bakteri uji (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Escherichia coli ATCC 25922) dengan metode difusi agar. Peubah yang diamati adalah diameter zona hambat yang terbentuk serta konsentrasi minimum penghambatan (MIC) terhadap bakteri uji. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa 12 isolat BAL yang diujikan mempunyai kemampuan penghambatan yang berbeda terhadap bakteri uji. Isolat 2B4 memiliki diameter zona hambat terbesar terhadap tiga bakteri uji. Nilai MIC yang dibutuhkan oleh isolat 2B4 dalam menghambat E. coli, S. aureus dan S. typhimurium berturut-turut 80%, 90 % dan 90 %. Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa substrat antimikroba yang bekerja dominan dalam menghambat bakteri uji adalah asam organik. Bakteri uji yang memiliki sensitifitas paling tinggi terhadap substrat antimikroba yang dihasilkan adalah E. coli dengan nilai MIC sebesar 80%. Kata kunci : Bakteri asam laktat, antimikroba, zona hambat, MIC

3 ABSTRACT Antimicrobial Substrate Activities of Lactic Acid Bacteria Isolated from Beef foward Pathogenic Bacteria and Its Minimum Inhibitory Consentration Widiasih, T., I. I. Arief and R. R. A. Maheswari Lactic acid bacteria (LAB) can occur naturally in several raw materials, such as beef. Some of LAB commonly used as starter cultures in food are known to have antimicrobial activity. One important attribute of LAB is their ability to produce antimicrobial substance. The objective of the research was to study the effect of antimicrobial substrate activities of LAB strains isolated from beef foward pathogenic bacteria. The antimicrobial substrate exhibited antibacterial activity against. Twelve LAB (2D2, 1D3, 2A3, 2C12, 1B2, 2D41, 1A4, 1C1, 1D42, 2B2, 1A2, 2B4) showed the best antimicrobial activities against pathogenic bacteria Staphylococcus aureus ATCC 25923, Salmonella typhimurium ATCC 14028, and Escherichia coli ATCC as indicator strains. Lactic acid bacteria 2B4 showed the highest inhibitor activity to Salmonella typhimurium ATCC and Escherichia coli ATCC Minimum inhibitory concentrations (MIC) antimicrobial substrate of LAB 2B4 were 80%, 90 %, and 90% for E. coli, S. aureus, and S. typhimurium respectively. Keywords: lactic acid bacteria, antimicrobial, inhibitory zone, MIC

4 AKTIVITAS SUBSTRAT ANTIMIKROBA BAKTERI ASAM LAKTAT YANG DIISOLASI DARI DAGING SAPI TERHADAP BAKTERI PATOGEN DAN KONSENTRASI MINIMUM PENGHAMBATANNYA Triani Widiasih D Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Peternakan pada Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor PROGRAM STUDI TEKNOLOGI HASIL TERNAK FAKULTAS PETERNAKAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2008

5 AKTIVITAS SUBSTRAT ANTIMIKROBA BAKTERI ASAM LAKTAT YANG DIISOLASI DARI DAGING SAPI TERHADAP BAKTERI PATOGEN DAN KONSENTRASI MINIMUM PENGHAMBATANNYA Oleh: Triani Widiasih D Skripsi ini telah disetujui dan disidangkan di hadapan Komisi Ujian Lisan pada tanggal 21 Juli 2008 Pembimbing Utama Pembimbing Anggota Irma Isnafia Arief, S.Pt, M.Si. NIP Dr. Ir. Rarah R. A. Maheswari, DEA NIP Dekan Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor Dr. Ir. Luki Abdullah, M.Agr.Sc. NIP

6 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan pada tanggal 23 Oktober 1986 di Bogor. Penulis adalah anak ketiga dari tiga bersaudara, pasangan Ishak Patamargana dan Munigar. Riwayat pendidikan penulis dimulai dari Taman Kanak-Kanak Kartini Bogor ( ), Sekolah Dasar Yayasan Pendidikan Islam ( ), Sekolah Menengah Pertama Negeri 2 Bogor ( ), dan dilanjutkan ke Sekolah Menengah Umum Negeri 2 Bogor ( ). Penulis kemudian masuk Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur USMI (Ujian Seleksi Masuk IPB) pada tahun 2004 dan terdaftar sebagai mahasiswa pada Program Studi Teknologi Hasil Ternak, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan. Selama menjadi mahasiswa IPB, penulis aktif dalam organisasi kemahasiswaan Badan Eksekutif Mahasiswa Fakultas Peternakan periode serta kepanitiaan kegiatan kampus lainnya. Penulis pernah menjadi asisten praktikum untuk mata kuliah Ilmu dan Teknik Pengolahan Susu dan Ilmu dan Teknik Pengolahan Daging tahun ajaran 2007/2008. Sebagi salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana pada Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor, penulis melakukan penelitian selama empat bulan dengan judul Aktivitas Substrat Antimikroba Bakteri Asam Laktat yang Diisolasi dari Daging Sapi terhadap Bakteri Patogen dan Konsentrasi Minimum Penghambatannya, di bawah bimbingan Irma Isnafia Arief, S.Pt., M.Si. dan Dr. Ir. Rarah R. A. Maheswari, DEA.

7 KATA PENGANTAR Puji dan syukur penulis persembahkan kepada Pemilik dari segala ilmu, Sang Maha Pencipta, Raja dari alam semesta, Allah Subhanahu Wataala karena limpahan nikmat dan rahmatnya yang lebih luas dari lautan di bumi dan langit, akhirnya penulis dapat menyelesaikan karya tulis ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah mendukung baik secara moril maupun materil hingga skripsi dengan judul Aktivitas Substrat Antimikroba Bakteri Asam Laktat yang Diisolasi dari Daging Sapi terhadap Bakteri Patogen dan Konsentrasi Minimum Penghambatannya dapat diselesaikan. Kesadaran konsumen akan bahan pengawet dalam produk pangan lebih memilih bahan pengawet alami. Beberapa tahun ini produk metabolit dari bakteri asam laktat telah dimanfaatkan dalam bidang biopreservatif produk pangan. Bakteri asam laktat yang diisolasi dari daging sapi telah terbukti memiliki aktivitas antimikroba, yang diharapkan mampu menjadi alternatif biopreservatif dalam industri pangan. Penelitian ini juga berupaya memberikan informasi tentang karakteristik antimikroba dan konsentrasi minimum penghambatan terhadap bakteri patogen. Semoga tulisan ini dapat menjadi sumber ilmu dan digunakan sebagai bahan tafakur atas ciptaan Allah SWT. Bogor, Juli 2008 Penulis

8 DAFTAR ISI RINGKASAN... ABSTRACT... RIWAYAT HIDUP... KATA PENGANTAR... DAFTAR ISI... Halaman DAFTAR TABEL... vii DAFTAR GAMBAR... viii DAFTAR LAMPIRAN... PENDAHULUAN... 1 Latar Belakang... 1 Tujuan... 2 TINJAUAN PUSTAKA... 3 Bakteri Asam Laktat... 3 Antimikroba... 4 Asam Organik... 4 Hidrogen Peroksida... 5 Bakteriosin... 6 Mikrobiologi Daging... 7 Bakteri Patogen... 8 Staphylococcus aureus... 8 Salmonella typhimurium... 9 Escherichia coli... 9 Minimum Inhibitory Concentration METODE Lokasi dan Waktu Materi Bahan Alat Rancangan Prosedur Penelitian Pendahuluan Pewarnaan Gram Uji katalase Penelitian Utama Uji Antagonistik Pengukuran ph Karakterisasi Substrat Antimikroba Pengukuran Total Asam Tertitrasi i ii iii iv v ix

9 MIC HASIL DAN PEMBAHASAN Penelitian Pendahuluan Karakteristik Morfologis Isolat BAL Populasi Awal Bakteri Uji Penelitian Utama Identifikasi Keberadaan Substrat Antimikroba Identifikasi Jenis Antimikroba Penyusun Supernatan Penghambatan S. aureus oleh Asam Organik BAL Penghambatan S. typhimurium oleh Asam Organik BAL Penghambatan E. coli Asam Organik BAL Minimum Inhibitory Concentration (MIC) KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Saran UCAPAN TERIMA KASIH DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN... 38

10 Nomor DAFTAR TABEL Halaman 1. Batas Maksimum Cemaran Mikroba pada Daging (cfu/g) Karakteristik Isolat Bakteri yang Diisolasi dari Daging Sapi Total Populasi Awal Bakteri Uji Rataan Diameter Zona Hambat* 12 Isolat BAL terhadap Bakteri Uji Rataan Diameter Zona Hambat* Supernatan Bebas Sel Isolat BAL terhadap Bakteri Uji Nilai TAT Supernatan Bebas Sel Isolat 2B Nilai MIC Substrat Antimikroba Isolat 2B4 terhadap Bakteri Uji

11 DAFTAR GAMBAR Nomor Halaman 1. Metode Pengukuran Zona Hambat Persiapan Media MIC dan Penentuan Nilai MIC Kemampuan Antagonistik Isolat BAL terhadap Bakteri Uji E. coli.. 22

12 Nomor DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. Analisis Ragam Rataan Diameter Zona Hambat 12 Isolat BAL terhadap S. aureus Analisis Ragam Rataan Diameter Zona Hambat 12 Isolat BAL terhadap S. typhimiruum Analisis Ragam Rataan Diameter Zona Hambat 12 Isolat BAL terhadap E. coli Analisis Ragam Rataan Diameter Zona Hambat Supernatan Bebas Sel Isolat BAL terhadap S. aureus Analisis Ragam Rataan Diameter Zona Hambat Supernatan Bebas Sel Isolat BAL terhadap S. typhimurium Analisis Ragam Rataan Diameter Zona Hambat Supernatan Bebas Sel Isolat BAL terhadap E. coli Analisis Ragam Nilai ph substrat Antimikroba 12 Bakteri Asam Laktat Morfologi dan Pewarnaan Gram Isolat Bakteri Asam Laktat yang Diisolasi dari Daging Sapi Gambar Uji Antagonistik Isolat BAL yang Diisolasi dari Daging Sapi terhadap Bakteri Patogen Gambar Konsentrasi Penghambatan Minimum (MIC)... 42

13 PENDAHULUAN Latar Belakang Bahan pangan hasil ternak, salah satunya yaitu daging memiliki sifat mudah rusak atau memiliki umur simpan yang pendek. Kerusakan bahan pangan dapat disebabkan oleh beberapa faktor, diantaranya oleh bakteri, walaupun tidak semua bakteri memiliki efek yang negatif. Sebagian bakteri dapat dimanfaatkan sebagai biopreservatif (bahan pengawet alami). Salah satu kultur bakteri yang sering dimanfaatkan sebagai biopreservatif yaitu bakteri asam laktat (BAL). Hal ini dimungkinkan karena BAL dapat menghasilkan produk metabolit yang bersifat antimikroba seperti asam organik, hidrogen peroksida, karbon dioksida, diasetil, bakteriosin serta mampu menghambat pertumbuhan bakteri patogen dan mikroorganisme yang mengkontaminasi makanan. Konsumen yang menyadari akan pentingnya kesehatan lebih tertarik pada makanan yang tidak mengandung bahan pengawet terutama yang berasal dari bahan non pangan. Oleh karena itu orientasi pencarian bahan pengawet alami adalah yang dapat diterima konsumen. Bahan-bahan pengawet tersebut terdapat di dalam bahan pangan, misalnya berasal dari tumbuhan, hewan atau dihasilkan oleh mikroorganisme yang disebut biopreservatif. Penggunaan BAL sebagai bahan pengawet alami dapat dilakukan melalui dua cara yaitu penambahan kultur BAL sebagai starter pada produk pangan atau hanya menggunakan metabolit antimikroba BAL sebagai pengawet alami. Penambahan kultur BAL sebagai starter telah banyak dikenal masyarakat dalam pembuatan produk fermentasi seperti yogurt, dadih, salami (sosis fermentasi), serta produk fermentasi lainnya, sedangkan pemanfaatan metabolit BAL yang bersifat antimikroba telah lama digunakan dalam industri pengolahan pangan yang kemudian dikembangkan secara komersil. Keberadaan BAL sering ditemukan secara alamiah dalam bahan pangan. Bakteri ini hidup pada susu, daging segar dan sayur sayuran dalam jumlah yang terbatas. Penelitian terdahulu (Hidayati, 2006) telah berhasil melakukan isolasi kultur BAL dari daging sapi, namun belum dilakukan karakterisasi BAL tersebut. Karakterisasi dan pemanfaatan produk metabolit dari BAL sebagai biopreservatif menarik untuk dilakukan, sehingga seleksi BAL berdasarkan aktivitas antimikroba

14 BAL dapat memperkaya koleksi isolat asli Indonesia (IAI) yang secara bersamaan dapat dipelajari aplikasinya sebagai biopreservatif. Penggunaan antimikroba alami dalam pengawetan daging, memerlukan informasi besarnya konsentrasi minimum yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen. Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari dan mendapatkan informasi tentang kemampuan BAL hasil isolasi dari daging sapi untuk menghasilkan substrat antimikroba serta mengetahui karakteristik dari substrat antimikroba yang dihasilkan, meliputi aktivitas dan konsentrasi minimum dari substrat antimikroba tersebut yang dapat menghambat bakteri patogen.

15 TINJAUAN PUSTAKA Bakteri Asam Laktat Pemanfaatan bakteri asam laktat (BAL) dalam industri pangan telah dikenal secara luas. Menurut Fardiaz (1992) bakteri asam laktat secara umum dibagi menjadi dua kelompok, homofermentatif dan heterofermentatif. Kelompok homofermentatif hanya menghasilkan asam laktat selama proses fermentasi gula sedangkan heterofermentatif dapat membentuk sejumlah karbon dioksida, etil alkohol, asam asetat, dan gliserol bersamaan dengan sejumlah besar asam laktat. Sifat yang terpenting dari BAL adalah kemampuannya dalam memfermentasi gula manjadi asam laktat. Bakteri asam laktat sangat cepat dalam memproduksi asam laktat sehingga dapat menghambat pertumbuhan mikroba lain yang tidak diinginkan. Menurut Ray (1996) salah satu faktor yang mempengaruhi pertumbuhan BAL ialah faktor lingkungan (suhu dan aerasi). Bakteri asam laktat merupakan bakteri Gram positif, tidak berspora, berbentuk batang maupun coccus, tidak memiliki sitokrom, dan bersifat anaerobik tetapi toleran terhadap O 2 (Fardiaz, 1992). Bakteri asam laktat terdiri atas beberapa genus. Kelompok genus Lactococcus (dalam bentuk Streptococcus), Lactobacillus, Pediococcus, dan Leuconostoc sering digunakan dalam proses fermentasi bahan pangan hasil ternak, sayur sayuran, buah buahan, daging dan produk sereal (Davidson dan Hoover, 1993). Beberapa spesies dari bakteri ini dapat digunakan dalam proses fermentasi makanan (Ray, 1996). Tujuan awal dari penambahan mikroorganisme dalam bahan pangan adalah untuk proses pengawetan. Pengawetan produk fermentasi dengan bakteri asam laktat adalah dengan mengubah gula menjadi asam organik. Hal ini menyebabkan penurunan ph dan mengubah karbohidrat menjadi sumber nutrient. Bakteri asam laktat menghasilkan hidrogen peroksida, diasetil, dan bakteriosin sebagai inhibitor yang potensial dalam menghambat mikroorganisme lain (Davidson dan Hoover, 1993). Selain itu BAL dapat digunakan sebagai probiotik untuk meningkatkan mikroflora dalam saluran pencernaan (Ouwehand, 1998). Bakteri asam laktat yang berasal dari bahan mentah atau lingkungan, dalam proses fermentasi daging secara spontan menyebabkan terbentuknya asam laktat dari

16 penggunaan karbohidrat dan menurunkan nilai ph 5,9-4,6 (Hugas dan Monfort, 1997). Bakteri asam laktat memproduksi sistem antimikroba seperti bakteriosin, sehingga BAL digunakan sebagai pengawet makanan yang alami untuk meningkatkan keamanan pangan. Antimikroba ini dapat dimanfaatkan dengan cara penambahan langsung BAL sebagai starter atau melalui metabolit antimikroba seperti asam organik atau bakteriosin yang berasal dari BAL (Earnshaw, 1999). Zat Antimikroba Zat antimikroba merupakan senyawa biologis atau kimia yang dapat menghambat pertumbuhan dan aktivitas mikroba. Menurut Fardiaz (1992), zat antimikroba dapat bersifat bakterisidal (membunuh bakteri), bakteristatik (menghambat pertumbuhan bakteri), fungisidal (membunuh kapang), fungistatik (menghambat pertumbuhan kapang), dan germisidal (menghambat germinasi spora bakteri). Kemampuan suatu zat antimikroba dalam menghambat pertumbuhan bakteri dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu (1) konsentrasi zat pengawet, (2) waktu penyimpanan, (3) suhu lingkungan, (4) sifat-sifat mikroba (jenis, umur, konsentrasi serta keadaan mikroba), (5) sifat-sifat fisik dan kimia makanan termasuk kadar air, ph, jenis senyawa didalamnya (Davidson dan Branen, 1993). Fardiaz (1992) menyatakan, bahwa makanan mungkin mengandung komponen yang dapat menghambat pertumbuhan jasad renik. Komponen antimikroba tersebut terdapat dalam makanan dapat melalui beberapa cara antara lain: (1) terdapat secara alamiah di dalam bahan pangan, (2) sengaja ditambahkan ke dalam makanan tersebut dan (3) terbentuk selama pengolahan atau jasad renik yang tumbuh selama fermentasi makanan. Frazier dan Westhoff (1988) menyebutkan zat zat yang digunakan sebagai antimikroba harus mempunyai beberapa kriteria seperti tidak bersifat racun bagi bahan pangan, ekonomis, tidak menyebabkan perubahan cita rasa dan aroma makanan, tidak mengalami penurunan aktivitas karena komponen makanan, tidak menyebabkan timbulnya resisten dan sebaliknya dapat menghambat pertumbuhan mikroba lain (mikroba pembusuk). Asam Organik Asam organik dalam bahan pangan dapat berfungsi sebagai asidulan atau pengawet, sementara garamnya atau ester dapat menjadi antimikroba yang efektif

17 pada ph yang mendekati netral (Roller, 2003). Hasil utama metabolit BAL berupa asam laktat dapat menyebabkan perubahan ph secara signifikan (Earnshaw, 1999). Terbentuknya asam laktat dan asam organik oleh bakteri asama laktat dapat menyebabkan penurunan ph dan mengakibatkan mikroba yang tidak tahan terhadap kondisi ph yang relatif rendah akan terhambat (Fardiaz 1992). Aktivitas asam-asam lipofilik seperti asam laktat dan asetat dalam bentuk tidak terdisosiasi dapat menembus sel mikroba dan pada ph intraseluler yang lebih tinggi, berdisosiasi menghasilkan ion-ion hidrogen dan mengganggu fungsi metabolik esensial seperti translokasi substrat dan fosforilasi oksidatif dengan demikian mereduksi ph intraseluler (Cabo et al., 2000). Stratford (2000) menyatakan, bahwa asam lemah dapat menurunkan ph sitoplasma, mempengaruhi struktur membran dan fluiditasnya, serta mengkelat ionion dinding sel bakteri. Penurunan ph sitoplasma akan mempengaruhi protein struktural sel, enzim-enzim, asam nukleat dan fosfolipid membran (Davidson dan Branen, 1993). Molekul asam lemah yang tidak bermuatan (HA) dapat masuk melalui membran plasma. Anion (A - ) dan proton (H + ) akan terbentuk di dalam sel, selanjutnya proton yang berlebih di dalam sitoplasma akan dikeluarkan oleh enzim ATP-ase yang terdapat pada membran (Garbutt, 1997). Hidrogen Peroksida Hidrogen peroksida (H 2 O 2 ) merupakan salah satu substrat antimikroba yang dihasilkan oleh bakteri. Hidrogen peroksida murni tidak berwarna, berbentuk cairan seperti sirup dan memiliki bau menusuk (Branen et al., 1990). Hidrogen peroksida secara umum memiliki spektrum penghambatan luas, meliputi bakteri, kapang, khamir, virus, dan mikroorganisme penghasil spora. Hidrogen peroksida lebih efektif dalam menghambat bakteri anaerobik karena kekurangan enzim katalase, yang mampu merusak peroksida (Davidson dan Branen, 1993). Reaksi pembentukan H 2 O 2 akan mengikat oksigen sehingga membentuk suasana anaerob yang akan membuat tidak nyaman bakteri aerob (Surono, 2004). Kemampuan bakterisidal dari H 2 O 2 beragam tergantung ph, konsentrasi, suhu, waktu dan tipe serta jumlah mikroorganisme. Bakteri yang paling sensitif terhadap H 2 O 2 adalah bakteri Gram negatif terutama koliform (Branen et al., 1990).

18 Bakteriosin Bahan alami yang telah digunakan dan diuji aman untuk bahan pengawet alami yaitu bakteriosin yang berasal dari berbagai bakteri asam laktat (Ray, 1996). Definisi bakteriosin merupakan protein atau peptida antimikroba yang dapat menghambat bakteri lain (Earnshaw, 1999). Bakteriosin yang diproduksi oleh bakteri asam laktat biasanya digunakan sebagai biopreservatif makanan. Beberapa bakteriosin stabil terhadap panas, sehingga membuat bakteriosin tersebut aplikatif terhadap perlakuan panas. Bakteriosin bersifat irreversible, mudah dicerna, berpengaruh positif terhadap kesehatan dan aktif pada konsentrasi rendah (Vuyst dan Vandamme, 1993). Tagg et al. (1976) menyatakan bahwa bakteriosin memiliki beberapa kriteria sebagai berikut: (1) mempunyai spektrum aktivitas yang relatif sempit, terpusat disekitar spesies penghasil (secara philogenik dekat), (2) senyawa aktif terutama terdiri dari fraksi protein, (3) bersifat bakterisidal, (4) mempunyai reseptor spesifik pada sel sasaran, dan (5) gen determinan terdapat pada plasmid yang berperan pada produksi dan imunitas. Beberapa genus bakteri dapat menghasilkan peptida yang bersifat antimikroba yang kemudian lebih dikenal dengan nama bakteriosin. Bakteriosin sering diartikan sebagai protein dengan efek antagonistik sebagai bakterisidal atau bakteriostatik terhadap pertumbuhan bakteri. Berbagai genus bakteri Gram positif dan Gram negatif telah dilaporkan menghasilkan bakteriosin diantaranya genus Lactobacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas, dan Carnobakterium. Bakteriosin bersifat tahan panas pada ph rendah, sedangkan pada ph alkalis bakteriosin menjadi inaktif (Suarsana, 2003). Menurut Schnell et al. (1988) sintesis bakteriosin oleh sel galur produsen terjadi selama pertumbuhan fase eksponensial, biasanya mengikuti pola klasik sintesis protein. Beberapa bakteriosin disintesis dalam bentuk lengkap secara langsung melalui jalur ribosom, sedangkan antibiotik disintesis secara ribosomal sebagai prepeptida kemudian mengalami modifikasi. Mekanisme penyerangan bakteriosin pada bakteri indikator dikarenakan bakteriosin terikat pada reseptor spesifik. Efek hambat selanjutnya disebabkan oleh terjadinya perubahan

19 permeabilitas dan integritas membran sehingga tidak terjadi pembelahan sel karena keluarnya beberapa material seluler atau sel mengalami lisis (Bhunia et al., 1988). Mikrobiologi Daging Mutu mikrobiologis dari suatu produk pangan ditentukan oleh jumlah dan jenis mikroorganisme yang terdapat dalam bahan pangan. Kontaminasi mikroorganisme yang terdapat dalam bahan pangan seperti daging dapat berasal dari sumber di luar ternak yang dipotong yaitu selama pemotongan, penanganan dan proses pengolahannya. Kontaminasi yang berasal dari pekerja antara lain Salmonella, Shigella, Escherichia coli, Bacillus proteus, Staphylococcus albus, Staphylococcus aureus (Lawrie, 1995). Bakteri lain seperti Clostridium botulinum yang berasal dari tanah juga dapat mengkontaminasi daging (Soeparno, 1994). Lawrie (1995) menyatakan bahwa faktor faktor yang mempengaruhi pertumbuhan mikroorganisme pada daging dibagi dua kelompok, yaitu (1) faktor intrinsik antara lain nilai nutrisi daging, kadar air, nilai ph, potensi oksidasi reduksi dan ada tidaknya substansi penghambat dan (2) faktor ekstrinsik meliputi: suhu, kelembaban relatif, oksigen dan kondisi daging. SNI mensyaratkan batas maksimum cemaran mikroba seperti tercantum pada Tabel 1. Tabel 1. Batas maksimum Cemaran Mikroba pada Daging (CFU/g) SNI No (BSN, 2000) No Jenis cemaran mikroba Batas maksimum cemaran mikroba Daging segar/beku Daging tanpa tulang 1 Angka lempeng total bakteri 1x10 4 1x Keterangan (ALTB) Escherichia coli* Staphylococcus aureus Clostridium sp Salmonella sp** Coliform Enterococci Campylobacter sp Listeria sp : (*) dalam satuan MPN/gram (**) dalam satuan kualitatif 5x10 1 1x Negatif 1x10 2 1x x10 1 1x Negatif 1x10 2 1x

20 Bakteri Patogen Bakteri patogen merupakan mikroorganisme indikator keamanan pangan. Beberapa mikroba yang diamati sebagai bakteri pembusuk dan patogen pada produk fermentasi terdiri atas famili Enterobakteriaceae seperti Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Citobacter, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serattia, Shigella, dan Yersinia (Fardiaz, 1992). Bakteri ini dapat dibedakan atas penyebab intoksikasi dan penyebab infeksi. Intoksikasi terjadi bila makanan yang dimakan telah mengandung toksin yang dihasilkan oleh bakteri yang tumbuh pada makanan tersebut. Infeksi disebabkan oleh masuknya bakteri ke dalam tubuh melalui makanan yang telah terkontaminasi dan adanya reaksi dari tubuh terhadap keberadaan atau metabolit metabolit yang dihasilkan bakteri selama tumbuh dalam tubuh. Berdasarkan sifat pewarnaan bakteri, bakteri patogen dapat dibedakan menjadi dua yaitu kelompok bakteri Gram positif dan Gram negatif. Kelompok bakteri patogen Gram positif diantaranya Staphylococcus aureus, dan kelompok bakteri patogen Gram negatif diantaranya Escherichia coli dan Salmonella typhimurium (Fardiaz, 1992). Staphylococcus aureus Menurut Fardiaz (1992) S. aureus berbentuk bulat dengan diameter 0,8 1,0 mm dan termasuk dalam famili micrococcaceae. Bakteri ini merupakan bakteri Gram positif yang tidak memiliki spora dan katalase positif. Staphylococcus aureus bersifat anaerob fakultatif, dengan bentuk tunggal, berpasangan, rantai pendek atau bergerombol seperti anggur serta bersifat non motil. Suhu optimum dari S. aureus adalah 37 0 C sedangkan suhu minimum dan maksimumnya berturut turut 6,7 0 C 45,5 0 C. Bakteri ini dapat tumbuh dengan baik pada ph 4,0 8,0 dan ph optimum pada 7 7,5. Waktu generasi yang dimiliki oleh S. aureus adalah menit. Staphylococcus masih dapat hidup pada media dengan konsentrasi NaCl 7,5%. Sebagian dari galur S. aureus bersifat koagulasi positif (mampu mengkoagulasi plasma darah) dan dapat memproduksi enterotoksin yang dapat menimbulkan keracunan makanan. Sumber penyebaran S. aureus dapat berasal dari manusia dan hewan. Penyebaran yang berasal dari manusia berasal dari infeksi saluran pernapasan pada kulit. Udara bukan salah satu faktor yang penting untuk tumbuhnya bakteri, kecuali jika berasal dari manusia sebagai sumber pembawa. Cara

21 untuk menginaktifkan S. aureus dapat dilakukan dengan pemanasan hingga 60 0 C selama kurang lebih 12 menit (Frazier dan Westhoff, 1988). Salmonella typhimurium Salmonella sp. merupakan bakteri patogen yang berbahaya. Selain menyebabkan gejala kelainan gastrointestinal, Salmonella sp. juga dapat menyebabkan demam tifus dan paratifus (Fardiaz, 1992), dan salmonellosis (Varnam dan Sutherland, 1995). Salmonella merupakan salah satu mikroorganisme yang dapat ditemui pada daging (Frazier dan Westhoff, 1988). Salmonella typhimurium merupakan bakteri Gram negatif, dan patogen dalam saluran pencernaan karena dapat menyebabkan enteric fever, gastro enteric atau keracunan makanan (Duerden et al, 1993). Salmonella sp. dapat memproduksi asam hasil fermentasi dan H 2 S, tumbuh pada suhu optimum 37 0 C dengan ph 4 9 serta memiliki a w minimum 0,94 (Varnam dan Sutherland, 1995). Salmonella sp. termasuk dalam famili Enterobactericeae, memiliki bentuk batang, anaerob fakultatif dan memiliki flagella peritrikat. Bakteri ini sangat sensitif terhadap panas sehingga dapat dimusnahkan dengan proses pasteurisasi (Fardiaz, 1989). Escherichia coli Bakteri ini memiliki bentuk batang dan tergolong dalam bakteri Gram negatif. Escherichia coli tumbuh pada suhu optimum 37 0 C dan pada kisaran suhu 10 0 C 40 0 C. Nilai ph optimum pertumbuhannya 7,0 7,5. Bakteri ini memiliki ukuran panjang 2,0 6,0 mikron, sering terdapat dalam bentuk tunggal atau berpasangan, bersifat motil atau non motil dengan flagella peritrikat, bersifat anarobik fakultatif, dan tergolong dalam famili Enterobactericeae (Fardiaz, 1992). Escherichia coli merupakan pengkatalisa karbohidrat dengan formasi asam dan gas (Holt et al., 1994). Escherichia coli termasuk mikroorganisme tidak menguntungkan pada keadaan normal (Gaman dan Sherrington, 1992). Escherichia coli disebut juga koliform fekal karena ditemukan dalam saluran usus hewan dan manusia. Selain itu E. coli juga sering dijadikan indikator kontaminasi kotoran (Fardiaz, 1992).

22 Minimum Inhibitory Concentration (MIC) Penghambatan mikroba oleh suatu senyawa antimikroba dapat dinyatakan dalam nilai MIC. Consentino (1999) mendefinisikan MIC sebagai konsentrasi terendah yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba sebanyak 90% dari inokulum asal selama inkubasi 24 jam. Nilai MIC senyawa antimikroba yang lebih rendah menunjukkan bakteri lebih sensitif terhadap senyawa tersebut (Naufalin, 2005). Fase pertumbuhan berpengaruh terhadap sensitifitas bakteri terhadap senyawa antimikroba. Bakteri pada fase stasioner lebih sensitif terhadap antimikroba asam lemah rantai pendek pada fase pertumbuhan. Hal ini disebabkan penambahan asam rantai pendek seperti propionat pada fase pertumbuhan (Thompson dan Hintom, 1996),.

23 METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan selama enam bulan yaitu bulan November 2007 sampai April Lokasi penelitian dilakukan di Laboratorium Bagian Ilmu Produksi Ternak Perah dan Laboratorium Bagian Ilmu Produksi Ternak Ruminansia Besar, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Materi Bahan bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah 12 isolat bakteri asam laktat yang berasal dari daging sapi (Arief et al., 2006). Bakteri uji yang digunakan adalah tiga bakteri patogen: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, dan Salmonella typhimurium ATCC Media yang digunakan adalah deman Rogosa Sharp Agar (MRSA), deman Rogosa Sharp Broth (MRSB), Muller Hilton Agar (MHA), Nutrient Broth (NB), Yeast Extrax (YE), Nutrient Agar (NA), Bacteriological Agar (BA), larutan pengencer Buffer Peptone Water (BPW) 1 %, NaOH 1 N, aquadest, kristal violet, iodium, etanol 95%, safranin, dan phenophtalein 1%. Alat alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah cawan Petri, pipet volumetrik, pipet 5 ml, pipet Pasteur, mikro pipet, tabung reaksi, inkubator, ph meter, jarum Ose, gelas objek, labu Erlenmeyer, mikroskop, kamera digital, kertas saring, pemanas Bunsen, jangka sorong, autoclaf, alumunium foil, oven, spektrofotometer, refrigerator, membran filter (0,22 µm) dan alat sentrifugasi. Rancangan Percobaan Rancangan percobaan yang digunakan untuk mempelajari aktivitas antimikroba pada bakteri uji adalah rancangan acak lengkap (RAL) pola searah dengan 3 kali ulangan. Model analisis yang digunakan sebagai berikut: Y ij = µ + A i + ε ij

24 Keterangan: Y ij = respon pengaruh perlakuan sifat antimikroba bakteri asam laktat µ = rata rata A i ε ij = pengaruh sifat antimikroba = galat percobaan Peubah yang diamati adalah parameter zona hambat yang terbentuk. Data yang didapatkan dianalisis dengan menggunakan Anova. Jika berbeda nyata dilakukan uji lanjut Tukey (Steel dan Torrie, 1995). Prosedur Penelitian Pendahuluan Penelitian ini meliputi pemeriksaan kembali 12 isolat bakteri yang diduga bakteri asam laktat hasil isolasi dari daging sapi melalui pewarnaan Gram dan uji katalase. Pewarnaan Gram (Hadioetomo, 1990). Sampel bakteri dari koloni yang homogen dioleskan pada kaca objek kemudian difiksasi panas. Olesan bakteri diteteskan dengan kristal violet selama satu menit, diratakan, dibilas dengan aquadest, dan dikering udarakan. Olesan bakteri selanjutnya diteteskan iodium Gram selama dua menit, kemudian dibilas aquadest dan ditiriskan. Preparat dicuci dengan pemucat warna yaitu etanol 95%, tetes demi tetes selama 30 detik, dicuci segera dengan aquadest dan ditiriskan. Preparat selanjutnya diteteskan safranin selama 30 detik, dibilas dengan aquadest dan ditiriskan. Setelah kering preparat di amati dibawah mikroskop dengan perbesaran 100 kali. Bakteri yang termasuk dalam kelompok Gram positif akan menunjukkan warna biru keunguan sedangkan kelompok bakteri Gram negatif adalah berwarna merah safranin. Hasil pengamatan preparat didokumentasikan dalam bentuk fotografik. Uji Katalase. Sampel bakteri dari koloni yang homogen dioleskan pada kaca objek. Olesan bakteri diteteskan H 2 O 2. Uji katalase didapat dengan melihat gelenbung udara yang terbentuk. Terbentuknya gelembung udara (+) menyatakan bahwa bakteri memiliki katalase positif, sebaliknya bila hasil yang didapatkan tidak menunjukkan adanya gelembung (-) maka bakteri yang diujikan termasuk dalam kelompok bakteri katalase negatif.

25 Penelitian Utama Penelitian ini meliputi uji antagonistik, pengukuran ph dari supernatan bebas sel 12 isolat bakteri yang diisolasi dari daging sapi, karakterisasi senyawa antimikroba, pengukuran total asam tertitrasi (TAT), serta konsentrasi minimum penghambatan terhadap bakteri uji oleh isolat bakteri yang memiliki diameter zona hambat terbesar. Uji Antagonistik Pembuatan Media MHA. Pembuatan media Muller Hinton Agar (MHA) adalah dengan cara melarutkan 34 gram bubuk MHA ke dalam satu liter aquadest, larutan yang terbentuk dimasukkan ke dalam botol scott kemudian dipanaskan hingga homogen. Media MHA disterilkan dalam autoclaf selama 15 menit pada suhu C. Pembuatan Media MRSB. Pembuatan media deman Rogosa Sharp Broth (MRSB) adalah dengan cara melarutkan 52 gram bubuk MRSB dan 2,6 gram Yeast Extrax (YE) ke dalam satu liter aquadest, larutan yang terbentuk dimasukkan ke dalam botol scott kemudian dipanaskan hingga homogen. Media MRSB disterilkan dalam autoclaf selama 15 menit pada suhu C. Pembuatan Media MRSA. Pembuatan media deman Rogosa Sharp Agar (MRSA) adalah dengan cara melarutkan 52 gram bubuk MRSB dan 20 gram Bacteriological Agar (BA) ke dalam satu liter aquadest, larutan yang terbentuk dimasukkan ke dalam botol scott kemudian dipanaskan hingga homogen. Media MRSA disterilkan dalam autoclaf selama 15 menit pada suhu C. Pembuatan Media NA. Pembuatan media Nutrient Agar (NA) adalah dengan cara melarutkan 23 gram bubuk NA ke dalam satu liter aquadest, larutan yang terbentuk dimasukkan ke dalam botol scott kemudian dipanaskan hingga homogen. Media NA disterilkan dalam autoclaf selama 15 menit pada suhu C. Pembuatan Media NB. Pembuatan media Nutrient Broth (NB) adalah dengan cara melarutkan 8 gram bubuk NB ke dalam satu liter aquadest, larutan yang terbentuk dimasukkan ke dalam botol scott kemudian dipanaskan hingga homogen. Media NB disterilkan dalam autoclaf selama 15 menit pada suhu C.

26 Pembuatan Larutan Pengencer BPW. Pembuatan larutan pengencer Buffer Peptone Water (BPW) adalah dengan cara melarutkan 20 gram bubuk BPW ke dalam satu liter aquadest, larutan yang terbentuk dimasukkan ke dalam tabung reaksi tertutup. Media BPW disterilkan dalam autoclaf selama 15 menit pada suhu C. Persiapan Bakteri Uji. Bakteri uji yang digunakan adalah Staphylococcus aureus ATCC sebagai bakteri patogen Gram positif, serta Escherichia coli ATCC 25922, dan Salmonella typhimurium ATCC sebagai bakteri patogen Gram negatif. Bakteri uji dibiakkan pada media NA selama 24 jam pada suhu 37 o C, untuk memperoleh kultur kerja. Sebanyak satu ose kultur kerja tersebut diperbanyak dengan cara dibiakkan ke dalam tabung berisi media NB sebanyak 5 ml dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Standardisasi kultur bakteri uji umur 24 jam dilakukan dengan cara penyetaraan kekeruhannya sesuai standar Mc. Farland no. 2, untuk menghasilkan populasi bakteri setara 6 x 10 8 sel bakteri/ml. Konfrontasi bakteri uji dengan substrat antimikroba menggunakan konsentrasi bakteri 6 x10 6 sel bakteri/ml yang diperoleh dengan cara mengencerkannya dalam BPW steril. Persiapan Supernatan Bebas Sel dari Isolat Bakteri Asam Laktat. Sebanyak 12 spesies bakteri asam laktat yang diisolasi dari daging sapi lokal masing-masing diinokulasikan ke media deman Rogosa Sharp Broth (MRSB) dan diinkubasikan pada suhu 37 o C selama 24 jam. Supernatan bebas sel dipanen melalui sentrifugasi. Supernatan bebas sel selanjutnya disebut supernatan. Kondisi sentrifugasi yang digunakan yaitu (a) kecepatan rpm pada suhu 4 o C selama 15 menit tanpa filtrasi dan (b) kecepatan rpm pada suhu 4 o C selama 20 menit dengan filtrasi (0,22 µm). Supernatan yang diperoleh siap diuji aktivitas antimikrobanya dengan menggunakan metode agar well diffusion (difusi agar). Persiapan Media dan Metode Konfrontasi Difusi Agar (Bromberg et al., 2004). Suspensi bakteri uji yang telah diencerkan dengan populasi 6 x10 6 sel bakteri/ml diambil sebanyak satu ml dengan pipet steril ke dalam cawan Petri steril. Media Muller Hinton Agar (MHA) steril bersuhu ±50 o C sebanyak 20 ml dituangkan ke dalamnya. Campuran dihomogenkan dengan cara cawan Petri digerakkan membentuk angka delapan di atas bidang datar. Setelah media agar mengeras dibuat

27 sumur berdiameter lima mm dengan menggunakan ujung pipet Pasteur steril sebanyak jumlah isolat yang diuji yaitu delapan buah yang merupakan duplo untuk setiap bakteri uji. Di dasar sumur ditutup dengan Bacteriological Agar (BA) dengan tujuan supernatan tidak meresap di dasar media agar. Konfrontasi dilakukan dengan menambahkan sebanyak 50 µl supernatan ke dalam sumur yang telah disiapkan. Cawan Petri beserta isinya diletakkan selama dua jam dalam refrigerator agar supernatan meresap ke dalam media agar. Selanjutnya cawan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam untuk memberikan kesempatan supernatan beraktivitas terhadap bakteri uji. Zona bening (zona hambat) yang terbentuk menunjukkan adanya hambatan terhadap pertumbuhan bakteri uji oleh supernatan. Diameter zona hambat (mm) diukur dengan jangka sorong sebanyak tiga kali pada posisi yang berbeda dan dirata-ratakan (Gambar 1). C B A Keterangan: A: Sumur untuk supernatan bebas sel (5 mm) B : Zona hambat (zona bening) C : Cawan Petri (media MHA) Garis / / : Pengukuran diameter zona bening Gambar 1. Metode Pengukuran Zona Hambat Pengukuran ph (DSN, 1992). Sebelum persiapan karakterisasi substrat antimikroba dilakukan pengukuran nilai ph supernatan menggunakan ph meter yang terlebih dulu dikalibrasi dengan buffer untuk ph 4 dan 7. Kalibrasi dilakukan setiap akan melakukan pengukuran. Pengukuran dilakukan dengan mencelupkan elektroda ke dalam supernatan bebas sel setelah terlebih dahulu elektroda dibersihkan dengan aquadest. Skala nilai ph dibaca pada saat muncul kata ready atau angka penunjuk telah berada pada posisi tetap.

28 Karakterisasi Substrat Antimikroba Bakteriosin. Supernatan bebas sel hasil sentrifugasi dikondisikan pada ph 7,0 dengan penambahan NaOH 1 N dan disaring dengan membran filter 0,22 μm. Selanjutnya supernatan yang merupakan ekstrak kasar bakteriosin tersebut siap untuk diuji aktivitasnya dengan metode difusi agar (Bromberg et al., 2004). Setiap pengujian dilakukan sebanyak tiga kali ulangan, masing-masing ulangan dilakukan secara duplo. Bila dihasilkan zona hambat berarti terdapat substrat bakteriosin di dalam supernatan. Aktivitas penghambatan senyawa antimikroba yang dihasilkan dinyatakan dalam satuan Arbitrary Unit (AU), satu AU = satu mm 2 /ml. Isolat bakteri yang memiliki penghambatan terbaik pada uji antagonistik ini akan diteliti lanjut untuk penentuan nilai minimum inhibitory concentration (MIC). AU = Luas zona bening-luas sumur Volume substrat Pengukuran Total Asam Tertitrasi (DSN, 1992). Supernatan bebas sel dipipet sebanyak sepuluh ml ke dalam labu Erlenmeyer, kemudian ditambahkan tiga tetes larutan indikator phenophtalein 1%. Selanjutnya supernatan dititrasi dengan larutan NaOH 0,1 N sampai terbentuk warna merah muda. Perhitungan : % Jumlah Asam = b x c x 90,08 x 100% a x 1000 Keterangan : a = bobot/volume sampel, dinyatakan dalam ml b = volume larutan NaOH, dinyatakan dalam ml c = normalitas larutan NaOH Minimum Inhibitory Concentration (MIC) (Kubo, 1993). Minimum Inhibitory Concentration (MIC) adalah konsentrasi terendah senyawa antimikroba yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri uji pada kondisi yang telah ditentukan. Konsentrasi terendah yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji dilihat dari tingkat kekeruhan setelah waktu inkubasi. Tahapan penentuan MIC meliputi : Persiapan Bakteri Uji. Media untuk pertumbuhan bakteri uji yang digunakan adalah Nutrient Broth (NB) steril dengan ph 7,0 yang didistribusikan ke dalam tabung

29 reaksi masing-masing sebanyak 9 ml. Selanjutnya ditambahkan 1 ml inokulum bakteri uji (Staphylococcus aureus, Escherichia coli dan Salmonella typhimurium) hingga diperoleh konsentrasi log 7 cfu/ml. Penentuan Minimum Inhibitory Concentration Substrat Antimikroba. Bakteri uji yang digunakan untuk penentuan MIC substrat antimikroba adalah Staphylococcus aureus, Escherichia coli dan Salmonella typhimurium. Penentuan MIC bertujuan untuk mendapatkan konsentrasi minimum dari substrat antimikroba untuk dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji yang termasuk bakteri patogen. Prosedur penentuan MIC substrat antimikroba dilakukan sebagai berikut: supernatan bebas sel (substrat antimikroba) yang telah difilter, dipipet sebanyak 10 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml, 60 ml, 70 ml, 80 ml, 90 ml, dan 100 ml ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan deman Rogosa Sharp Broth (MRSB) masing-masing sebanyak 90 ml, 80 ml, 70 ml, 60 ml, 50 ml, 40 ml, 30ml, 20 ml, 10 ml dan 0 ml secara berurutan. Campuran media tersebut didistribusikan masing-masing konsentrasi ke dalam tabung reaksi sebanyak sembilan ml, kemudian ditambahkan masing-masing bakteri uji yang berumur 24 jam dengan konsentrasi log 7 cfu/ml. Media yang telah berisi bakteri uji diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 24 jam. Pertumbuhan bakteri uji diamati secara visual untuk menentukan tidak terjadinya pertumbuhan pada bakteri tersebut. Bakteri uji yang tidak tumbuh akan menunjukkan tingkat kekeruhan yang sama dengan media awal sebelum waktu inkubasi. Selanjutnya tingkat kekeruhan yang menunjukkan pertumbuhan bakteri uji diukur dengan spektrofotometer untuk menentukan nilai optical density (OD) pada panjang gelombang 520 nm (Gambar 2). Perhitungan : % Penghambatan = 100% - (Nt / No x 100%) Keterangan: No = Populasi awal Nt = Populasi akhir

30 supernatan bebas sel 10 ml 20 ml 30 ml 40 ml 50 ml 60 m 70 ml 80 ml 90 ml 100 ml 11100ml + Media MRSB 90 ml 80 ml 70 ml 60 ml 50 ml 40 m 30 ml 20 ml 10 ml 0 ml Media MRSB + Supernatan Bebas Sel 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 m 9 ml 9 ml 9 ml 9ml + Bakteri uji (Log 7 cfu/ml) 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 m 1 ml 1 ml 1 ml 1ml Inkubasi 24 Jam pada suhu 37 C Spektrofotometer (Nilai OD) Gambar 2. Persiapan Media MIC dan Penentuan Nilai MIC

31 HASIL DAN PEMBAHASAN Penelitian Pendahuluan Penelitian pendahuluan meliputi persiapan kultur bakteri asam laktat (BAL) asal daging sapi, dan persiapan bakteri uji. Tujuan dari penelitian pendahuluan adalah untuk memeriksa karakteristik morfologis dan kemurnian isolat bakteri yang akan digunakan. Isolat bakteri yang akan digunakan berjumlah 12 isolat yang berasal dari daging sapi. Karakterisktik morfologis yang diamati meliputi respon terhadap pewarnaan Gram, bentuk dan susunan sel serta uji katalase. Kelompok genus Lactobacillus adalah bakteri Gram positif, katalase negatif, dan memiliki bentuk batang (Fradiaz, 1992). Isolat 2B4, 1D3, 2A3, 1B2, 2D41, 1C1, 2B2, dan 1A2 tergolong dalam Gram positif yang mempunyai bentuk batang dengan susunan tunggal atau rantai serta hasil uji katalase yang negatif. Berdasarkan hasil uji fermentasi gula menunjukkan bahwa isolat 1D3 dan 2B4 merupakan spesies bakteri Lactobacillus fermentum dengan tingkat akurasi 96% dan 99% (Tribowo, 2006). Isolat BAL yang tergolong dalam kelompok bakteri Gram positif yang berbentuk coccus (bulat) dengan rantai panjang maupun pendek yaitu 2D2, 2D42, 1A4 dan 2C12, jenis bakteri yang tergolong dalam kelompok ini adalah famili Streptococcaceae. Kelompok famili Streptococcaceae merupakan bakteri berbentuk bulat yang membentuk rantai pendek dan panjang (Fardiaz, 1992). Hal ini sesuai dengan penelitian terdahulu yang menyatakan bahwa isolat bakteri tersebut tergolong dalam kelompok bakteri genus Lactobacillus sp. dan Streptococcaceae. Perbedaan kemampuan isolat dalam memfermentasi beberapa gula menunjukkan bahwa isolatisolat tersebut adalah isolat yang berbeda (Hidayati, 2006). Kultur asal daging sapi lokal yang digunakan merupakan kelompok BAL. Dua belas isolat BAL yang diisolasi dari daging sapi merupakan Gram positif dengan hasil uji katalase negatif. Hasil tersebut menunjukkan bahwa kultur tidak tercemar dan masih homogen seperti yang diperoleh pada penelitian sebelumnya (Hidayati, 2006). Hasil pengamatan karakteristik morfologi isolat BAL disajikan pada Tabel 2.

32 Tabel 2. Karakteristik Isolat BAL yang Diisolasi dari Daging Sapi Isolat BAL Pewarnaan Gram Uji Katalase Morfologi Gambar Morfologi 2D2 Gram Positif Negatif Berbentuk bulat, susunan tunggal maupun rantai pendek 1A4 Gram Positif Negatif Berbentuk bulat, susunan tunggal maupun rantai pendek 2D42 Gram Positif Negatif Berbentuk bulat, susunan tunggal maupun rantai pendek 2C12 Gram Positif Negatif Berbentuk bulat, susunan tungal maupun rantai pendek 1B2 Gram Positif Negatif Berbentuk batang, susunan tunggal maupun rantai pendek 2D41 Gram Positif Negatif Berbentuk batang, susunan tunggal maupun rantai pendek 2A3 Gram Positif Negatif Berbentuk batang, susunan tunggal maupun rantai pendek 1C1 Gram Positif Negatif Berbentuk batang, susunan tunggal maupun rantai pendek 1D3 Gram Positif Negatif Berbentuk batang, susunan tunggal maupun rantai pendek 2B2 Gram Positif Negatif Berbentuk batang, susunan tunggal maupun rantai pendek 1A2 Gram Positif Negatif Berbentuk batang, susunan tunggal maupun rantai pendek 2B4 Gram Positif Negatif Berbentuk batang, susunan tunggal maupun rantai pendek

33 Populasi Awal Bakteri Uji Keberadaan bakteri uji (S. aureus, S. typhimurium, dan E.coli) dalam daging menjadi standar cemaran dalam SNI seperti yang tertera pada Tabel 1. Bakteri uji yang digunakan untuk uji konfrontasi antara lain Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC dan Salmonella typhimurium ATCC Pemilihan ketiga bakteri uji ini mengacu pada ketentuan SNI tentang cemaran mikrobiologis pada daging yang menyatakan bahwa ketiga bakteri patogen tersebut perlu mendapatkan perhatian khusus sebagai cemaran mikroba pada daging. Persiapan bakteri uji bertujuan untuk mengetahui jumlah populasi awal dari bakteri uji. Total populasi awal bakteri uji dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3. Total Populasi Awal Bakteri Uji Jenis Bakteri Uji Populasi awal Nilai OD (cfu/ml) Escherichia coli ATCC ,2 x ,307 Staphylococcus aureus ATCC ,6 x ,283 Salmonella typhimurium ATCC ,4 x ,314 Penelitian Utama Penelitian utama adalah identifikasai keberadaan substrat antimikroba serta jenis antimikroba yang menyusun supernatan bebas sel dan nilai konsentrasi minimum yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji. Identifikasi substrat antimikroba dilakukan dengan uji antagonistik antara supernatan dengan bakteri uji. Identifikasi Keberadaan Substrat Antimikroba yang Dihasilkan Isolat BAL Asal Daging Sapi Isolat BAL yang telah berhasil diisolasi dari daging sapi memiliki kemampuan mensekresikan substrat tertentu yang bersifat antimikroba. Substrat antimikroba diperoleh dengan cara melakukan sentrifugasi terhadap kultur untuk memisahkan sel dan supernatan bebas sel pada kecepatan rpm. Aktivitas substrat antimikroba dapat dibuktikan dengan uji antagonistik. Pengujian ini dilakukan untuk melihat kemampuan suatu isolat bakteri menghambat bakteri lain yang patogen. Hasil uji antagonistik menunjukkan bahwa 12 jenis isolat

34 BAL yang diisolasi dari daging sapi dapat memproduksi senyawa antimikroba yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji (bakteri patogen). Masing-masing jenis isolat mempunyai kemampuan yang tidak berbeda nyata dalam menghambat pertumbuhan bakteri uji. Zona hambat yang terbentuk pada uji antagonistik dapat dilihat pada Tabel 4. Tabel 4. Rataan Diameter Zona Hambat* 12 Isolat BAL terhadap Bakteri Uji Jenis Isolat Bakteri Uji Bakteri S. aureus S. typhimurium E.coli (mm) D2 11,29 ± 6,35 10,36 ± 3,53 5,89 ± 0,79 1D3 8,21 ± 5,56 11,55 ± 5,67 6,50 ± 2,60 2A3 11,06 ± 5,60 7,31 ± 1,01 6,60 ± 1,69 2C12 9,6 ± 4,23 13,62 ± 1,27 5,00 ± 0,00 1B2 10,08 ± 4,56 12,19 ± 1,12 5,00 ± 0,00 2D41 10,97 ± 6,06 10,08 ± 1,19 5,00 ± 0,00 1A4 7,85 ± 4,94 10,42 ± 4,84 7,3 ± 2,00 1C1 9,62 ± 6,41 10,57 ± 3,50 6,72 ± 1,67 2D42 12,07 ± 6,73 9,07 ± 3,66 5,00 ± 0,00 2B2 8,64 ± 5,07 10,6 ± 5,61 7,37 ± 2,90 1A2 10,52 ± 5,28 9,89 ± 4,32 6,31 ± 1,15 2B4 11,58 ± 5,76 8,86 ± 3,35 8,97 ± 0,44 Keterangan : * Besarnya diameter zona hambat termasuk diameter lubang sumur (5 mm) Penghambatan terhadap bakteri uji S. aureus oleh 12 jenis substrat isolat BAL yang diisolasi dari daging sapi menunjukkan hasil yang tidak berbeda nyata (P>0,05). Hal ini membuktikan bahwa 12 jenis isolat BAL tersebut memiliki daya hambat yang sama terhadap S. aureus. Penghambatan lainnya yaitu terhadap bakteri uji S. typhimurium. Penghitungan secara statistik, perbedaan isolat tidak berpengaruh nyata (P>0,05) terhadap penghambatan S. typhimurium. Hasil ini menunjukkan bahwa bakteri uji S. typhimurium memiliki sensitivitas yang sama terhadap senyawa antimikroba yang dihasilkan oleh 12 jenis isolat BAL tersebut. Penghambatan terhadap pertumbuhan bakteri uji E. coli tidak ditunjukkan oleh isolat 2C12, 1B2, 2D41, dan 2D42. Walaupun demikian, secara hitungan statistik penghambatan

35 terhadap pertumbuhan bakteri uji tidak berbeda nyata (P>0,05) pada jenis isolat BAL yang berbeda. Aktivitas substrat antimikroba yang dihasilkan oleh isolat BAL ditunjukkan dengan terbentuknya daerah yang lebih bening di sekitar lubang sumur. Hal tersebut membuktikan adanya aktivitas penghambatan pertumbuhan bakteri uji oleh isolat BAL. Aktivitas penghambatan pertumbuhan bakteri uji disebabkan oleh senyawa antimikroba yang dihasilkan oleh isolat BAL asal daging sapi. Pembentukan zona hambat oleh isolat BAL dapat dilihat pada Gambar 2. Gambar 2. Kemampuan Antagonistik Isolat BAL terhadap Bakteri Uji E. coli Dua belas isolat dapat menghasilkan antimikroba yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri uji (Tabel 4). Bakteri asam laktat dapat menghasilkan substansi antimikroba seperti asam-asam organik, hidrogen peroksida, dan bakteriosin. Mekanisme dari masing-masing antimikroba yang dihasilkan berbeda-beda dalam menghambat bakteri uji. Identifikasi Jenis Antimikroba Penyusun Supernatan Bebas Sel Hasil identifikasi substrat antimikroba yang diperoleh dengan cara melakukan sentrifugasi terhadap kultur untuk memisahkan sel dan supernatan bebas sel pada kecepatan rpm selama 15 menit menunjukkan bahwa isolat BAL asal daging sapi menghasilkan senyawa antimikroba. Pengujian dilanjutkan dengan mengidentifikasi jenis substrat antimikroba yang dihasilkan. Tahap identifikasi jenis substrat antimikroba, supernatan diperoleh dengan cara sentrifugasi kecepatan rpm selama 20 menit pada suhu 4 0 C (Savadogo et al., 2004). Tujuan dari peningkatan kecepatan sentrifugasi yang lebih tinggi untuk mendapatkan supernatan yang betul-betul bebas sel. Kecepatan sentrifugasi rpm masih menunjukkan zona hambat yang bersifat parsial diduga karena terdapat sel BAL yang belum

36 mengendap secara sempurna. Hasil pengamatan supernatan yang diperoleh dengan kecepatan rpm menghasilkan zona hambat yang bening seperti yang dapat dilihat pada Tabel 5. Isolat BAL Tabel 5. Rataan Diameter Zona Hambat* Supernatan Bebas Sel Isolat BAL terhadap Bakteri Uji Bakteri Uji Nilai ph S. aureus S. typhimurium E.coli (mm) D2 3,93 f ±0,05 9,76 a ±2,58 8,93 abcde ±0,23 7,56 a ±0,65 1D3 4,07 def ±0,06 5,00 b ±0,00 7,27 e ±1,22 6,78 a ±0,53 2A3 4,27 c ±0,06 5,43 b ±0,74 7,43 de ±0,43 6,86 a ±0,42 2C12 4,70 a ±0,00 6,44 ab ±1,57 7,77 bcde ±0,66 8,37 a ±2,28 1B2 3,93 f ±0,06 8,47 ab ±1,76 9,71 ab ±1,23 9,37 a ±2,44 2D41 4,03 def ±0,05 7,07 ab ±1,22 8,47 abcde ±0,54 10,52 a ±2,89 1A4 4,50 b ±0,00 5,54 b ±0,93 8,47 abcde ±1,41 8,07 a ±1.46 1C1 4,10 de ±0,00 8,40 ab ±1,58 10,08 a ±1,64 9,5 a ±0,96 2D42 4,13 cde ±0,06 5,40 b ±0,70 9,42 abcd ±1,51 7,38 a ±0,63 2B2 4,00 ef ±0,10 9,72 a ±0,96 9,64 abc ±1,51 10,49 a ±2,17 1A2 4,03 def ±0,06 5,42 b ±0,45 7,69 cde ±1,74 8,81 a ±1,91 2B4 4,17 cd ±0,06 7,63 ab ±0,73 10,24 a ±1,16 12,61 a ±4,05 Keterangan : * Diameter zona hambat termasuk diameter lubang sumur (5 mm) Huruf superskrip yang berbeda pada kolom yang sama berbeda nyata (P < 0,05) Bakteriosin merupakan substrat antimikroba yang paling penting dihasilkan oleh BAL. Keberadaan bakteriosin sebagai penyusun supernatan dapat diketahui melalui beberapa pengujian diantaranya yaitu (a) netralisasi pengaruh asam dalam supernatan dengan penambahan buffer ph 7,0; (b) penambahan enzim proteolitik; (c) pengujian melalui proses pemanasan. Netralisasi pengaruh keasaman dapat dilakukan dengan penambahan NaOH 1 N pada supernatan hingga diperoleh ph supernatan yang netral. Supernatan yang telah dinetralisasi, disterilkan melalui filter 0,22 µm. Hasil konfrontasi antara supernatan yang telah dinetralkan dengan bakteri uji tidak menunjukkan bahwa terdapat bakteriosin dalam supernatan atau bila terdapat jumlahnya dalam konsentrasi yang terlalu rendah untuk dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji. Fardiaz (1989) menjelaskan bahwa kemampuan suatu zat antimikroba dalam menghambat pertumbuhan dipengaruhi oleh beberapa faktor,

37 antara lain: (1) konsentrasi zat pengawet, (2) waktu penyimpanan, (3) suhu lingkungan, (4) sifat-sifat mikroba seperti jenis, umur, konsentrasi, dan keadaan mikroba, (5) sifat-sifat fisik dan kimia makanan termasuk kadar air, ph, jenis senyawa dan jenis senyawa didalamnya. Supernatan yang sama tanpa penetralan tetap menujukkan adanya zona hambat (Tabel 5). Dua belas jenis isolat BAL yang diisolasi dari daging sapi terbukti memiliki senyawa antimikroba yang dapat menghambat bakteri uji. Komponen utama substrat antimikroba penyusun supernatan yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri uji adalah bentuk asam organik, ditunjukkan oleh nilai ph supernatan yang rendah. Asam organik merupakan salah satu hasil metabolit bakteri asam laktat yang bersifat antimikroba. Pembentukan asam organik terjadi melalui proses fermentasi glukosa yang terdiri dari dua tahap yaitu (1) pemecahan rantai karbon dari glukosa dan pelepasan paling sedikit dua pasang karbon atom hidrogen, menghasilkan senyawa karbon lainnya yang lebih teroksidasi dibandingkan glukosa. Senyawa yang teroksidasi tersebut direduksi kembali oleh atom hidrogen yang dilepaskan dalam tahap pertama hingga membentuk asam piruvat; (2) tahap kedua, asam piruvat bertindak sebagai penerima hidrogen, sehingga asam piruvat yang direduksi oleh NADH 2 menghasilkan asam laktat dan senyawa lain seperti asam asetat, CO 2, dan etanol (Fardiaz, 1992). Asam organik yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat dapat berupa asam lemah seperti asam laktat dan asam asetat. Mekanisme penghambatan bakteri oleh asam-asam organik berhubungan dengan keseimbangan asam-basa, penambahan proton, dan produksi energi oleh sel. Keseimbangan asam-basa pada sel mikroba ditunjukkan dengan ph yang mendekati normal. Interaksi dengan senyawa kimia akan mengganggu keseimbangan asam-basa dan mengakibatkan kerusakan sel. Protein, asam nukleat, dan fosfolipid dapat rusak oleh perubahan ph. Ketersediaan ion-ion logam akan mengganggu permeabilitas membran, karena membran kurang permeabel terhadap ion dibandingkan dengan molekul yang tidak bermuatan. Perubahan permeabilitas membran akan menghasilkan efek ganda, yaitu mengganggu transport nutrisi ke dalam sel dan menyebabkan metabolit internal keluar dari sel (Davidson dan Branen, 1993).

38 Efek penghambatan dari asam organik terutama berasal dari jumlah asam yang tidak terdisosiasi (Jennie, 1996a). Bentuk asam yang tidak terdisosiasi dipengaruhi oleh nilai pka yang berbeda. Asam asetat dan asam propionat memiliki nilai pka yang lebih tinggi yaitu sebesar 4,87 dan 4,75 dibandingkan dengan asam laktat sebesar 3,08. Nilai pka yang tingggi akan menghasilkan asam yang tidak terdisosiasi lebih banyak (Ouwhand dan Vesterlund, 2004). Asam asetat memiliki asam yang tidak terdisosiasi dua atau empat kali lipat pada interval ph 4,0-4,6 dibandingkan dengan asam laktat (Vuys dan Vandamme, 1994). Berdasarkan hasil uji konfrontasi supernatan yang dihasilkan dengan kecepatan sentrifugasi rpm semua isolat BAL dapat menghambat ketiga bakteri uji (S. aureus, S. typhimurium, dan E. coli) hanya isolat 1D3 yang tidak dapat menghambat ketiga bakteri uji. Isolat 1D3 hanya mampu menghambat bakteri uji S. typhimurium dan E. coli. Hasil uji statistik menunjukkan bahwa isolat 2B4 merupakan isolat terbaik yang dapat menghambat ketiga bakteri uji (Tabel 5). Penghambatan pada pertumbuhan bakteri uji S. typhimurium dan E. coli memiliki zona hambat yang terbesar. Besarnya diameter zona hambat yang terbentuk berbeda nyata dengan isolat lainnya. Penghambatan isolat 2B4 terhadap bakteri uji S. aureus tidak berbeda nyata dengan isolat lain yang memiliki diameter zona hambat terbesar. Isolat 2B4 merupakan Lactobacillus fermentum (Tribowo, 2006) yang termasuk dalam spesies golongan heterofermentatif. Bakteri yang tergolong dalam heterofermentatif dapat memecah gula menjadi asam laktat dan produk lainnya seperti asam asetat, alkohol, dan karbon dioksida. Asam laktat dan asam asetat yang dihasilkan oleh isolat BAL 2B4 melalui fermentasi heterofermentatif, akan berinteraksi dengan sel membran dan mengakibatkan asidifikasi intraseluler dan denaturasi protein. Keberadaan asam organik juga dibuktikan dengan nilai TAT untuk isolat 2B4 seperti dapat dilihat pada Tabel 6. Tabel 6. Nilai TAT Supernatan Bebas Sel Isolat Bakteri 2B4 Ulangan Volume NaOH (ml) TAT (%) 1 3,6 0,32 2 4,3 0,39 3 3,1 0,28 rataan 3,7 0,33

39 Nilai TAT menunjukkan tingkat keasaman supernatan dengan menetralkan asam organik yang menjadi penyusun supernatan. Asam organik yang dinetralkan merupakan asam organik yang tidak terdisosiasi, sehingga persentase TAT yang tinggi membuktikan semakin banyaknya asam yang terkandung dalam supernatan. Penghambatan S. aureus oleh Asam Organik yang Dihasilkan Isolat BAL Pengaruh perlakuan isolat yang berbeda terhadap bakteri uji S. aureus menunjukkan hasil yang berbeda nyata (P<0,05) seperti yang ditampilkan pada Tabel 5. Artinya secara hitungan statistik respon S. aureus terhadap antimikroba yang dihasilkan oleh 12 isolat terdapat isolat yang berbeda secara signifikan. Mekanisme penghambatan pertumbuhan mikroba oleh senyawa antimikroba antara lain (1) perusakan dinding sel sehingga mengakibatkan lisis atau menghambat pembentukan dinding sel pada sel yang sedang tumbuh, (2) mengubah permeabilitas membran sitoplasma yang menyebabkan kebocoran nutrien di dalam sel, (3) denaturasi protein sel, (4) perusakan sistem metabolisme dalam sel dengan cara menghambat kerja enzim intraseluler (Pelczar dan Reid, 1979). Bakteri uji S. aureus termasuk dalam kelompok bakteri Gram positif (Fardiaz, 1992). Hal ini membuktikan bahwa substrat antimikroba BAL yang diisolasi dari daging sapi dapat menghambat bakteri Gram positif. Penghambatan terhadap bakteri Gram positif disebabkan oleh senyawa antimikroba yang dihasilkan oleh isolat BAL. Struktur dinding sel bakteri Gram positif memiliki satu lapisan tebal peptidoglikan, sedangkan bakteri Gram negatif relatif lebih kompleks dengan tiga lapisan yaitu, lapisan luar berupa lipoprotein, lapisan tengah yang berupa lipolisakarida, dan lapisan dalam berupa peptidoglikan yang lebih tipis. Perbedaan lapisan peptidoglikan tersebut mempengaruhi penghambatan terhadap baketri uji. Penghambatan tertinggi S. aureus pada Tabel 5 ditunjukkan oleh jenis isolat 2D2 dan 2B2 (9,76±2,58 mm dan 9,72±0,96 mm). Bakteri uji S. aureus memiliki sensitifitas yang lebih tinggi terhadap dua jenis isolat BAL tersebut. Supernatan isolat 1D3 tidak menunjukkan penghambatan terhadap bakteri uji. Hasil ini berbeda dengan konfrontasi supernatan yang dihasilkan dengan kecepatan sentrifugasi rpm. Zona hambat yang terbentuk pada supernatan yang dihasilkan kecepatan sentrifugasi rpm menunjukkan adanya zona hambat pada penghambatan S. aureus. Hal ini dapat disebabkan oleh antimikroba yang bekerja

40 pada supernatan yang dihasilkan dengan kecepatan sentrifugasi rpm ikut mengendap dengan sel pada saat proses pemisahan sel dan supernatan, sehingga saat uji konfrontasi antimikroba tidak lagi bekerja menghambat bakteri uji S. aureus. Penghambatan S. typhimurium oleh Asam Organik yang Dihasilkan Isolat BAL Supernatan dari berbagai isolat daging memberikan penghambatan yang berbeda nyata (P<0,05) terhadap bakteri uji S. typhimurim (Tabel 5). Secara hitungan statistik respon yang dihasilkan oleh bakteri uji melalui pembentukan zona hambat terdapat isolat yang berbeda secara signifikan. Semua jenis isolat dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji S. typhimurium dengan besar penghambatan yang berbedabeda. Isolat bakteri 2B4 menghasilkan penghambatan terbesar pada bakteri uji S. typhimurium (10,24±1,16 mm). Hal ini membuktikan bahwa bakteri uji S. typhimurium lebih sensitif pada antimikroba yang dihasilkan oleh jenis isolat bakteri 2B4. Jenis isolat 1D3 mempunyai penghambatan yang paling kecil (7,27±1,22 mm) terhadap bakteri uji S. typhimurium. Jenis isolat lainnya memiliki keragaman diameter zona hambat sesuai dengan tingkat kepekaan S. typhimurim terhadap antimikroba yang dihasilkan. Antimikroba yang bekerja dalam menghambat pertumbuhan S. typhimurium adalah asam organik. Efek antimikroba dari asam organik merupakan akibat dari penurunan nilai ph dan juga bentuk tidak terdisosiasi dari molekul asam organik. Kondisi ph eksternal yang yang rendah mengakibatkan asidifikasi sel sitoplasma, sementara asam yang tidak terdisosiasi menjadi lipofilik, sehingga dapat berdifusi ke dalam membran. Asam yang tidak terdisosiasi akan melumpuhkan elektrokimia proton gradien atau mengubah permeabilitas sel membran yang akan menggangu sistem transport substrat (Surono, 2000). Bakteri Gram negatif memiliki dinding sel dengan kandungan lipid tinggi yaitu % (Fardiaz, 1992), sehingga asam yang tidak terdisosiasi dapat menembus dinding sel dan bersifat antimikroba untuk pertumbuhan S. typhimurium. Hal ini membuktikan bahwa antimikroba yang dihasilkan efektif dalam menghambat bakteri Gram negatif. Penghambatan E. coli oleh Asam Organik yang Dihasilkan Isolat BAL Bakteri uji E. coli yang tergolong dalam Gram negatif yang dapat dihambat oleh substrat antimikroba yang dihasilkan oleh berbagai isolat BAL asal daging sapi. Penghambatan E. coli terlihat dari zona hambat yang terbentuk. Pengaruh perlakuan

41 isolat yang berbeda terhadap bakteri uji E. coli menunjukkan hasil yang tidak berbeda berbeda nyata (P>0,05) (Tabel 5). Artinya secara hitungan statistik respon E. coli terhadap supernatan jenis isolat BAL yang diisolasi dari daging sapi tidak berbeda secara signifikan. Hal ini membuktikan bahwa bakteri uji memiliki sensitivitas yang sama terhadap 12 isolat BAL yang diisolasi dari daging sapi. Ketahanan E. coli terhadap 12 supernatan isolat BAL tersebut dipengaruhi oleh senyawa antimikroba yang dihasilkan oleh isolat. Supernatan isolat 2C12, 1B2, 2D41, dan 2D42 yang didapat dengan sentrifugasi rpm menunjukkan penghambatan terhadap E. coli. Antimikroba yang terdapat pada supernatan yang dihasilkan dengan kecepatan sentrifugasi rpm merupakan kesatuan antimikroba sehingga pada supernatan yang dihasilkan dengan kecepatan sentrifugasi rpm, antimikroba yang menyatu dapat terpisah dan bekerja lebih spesifik dalam menghambat bakteri uji. Efek yang sama besar terhadap pertumbuhan bakteri uji E. coli ditunjukkan oleh isolat BAL lainnya. Bakteri uji E. coli termasuk dalam kelompok bakteri Gram negatif. Penghambatan pertumbuhan E. coli disebabkan oleh asam organik yang bekerja sebagai antimikroba. Menurut Vuys dan Vandamme (1994), aksi sinergis asam laktat dan asam asetat dapat menghambat pertumbuhan S. typhimurium dan E. coli. Minimum Inhibitory Concentration (MIC) Hasil konfrontasi dari 12 isolat bakteri yang diisolasi dari sapi menunjukkan bahwa isolat bakteri 2B4 memiliki aktivitas antimikroba yang paling baik. Hal ini dibuktikan dengan hasil uji statistik bahwa zona hambat yang terbentuk tidak berbeda nyata dengan zona hambat terbesar pada uji konfrontasi dengan bakteri uji S. aureus. Uji konfrontasi dengan bakteri uji Gram negatif (S. typhimurium, dan E. coli) supernatan isolat bakteri 2B4 memiliki diameter zona hambat terbesar. Antimikroba yang dominan bekerja menghambat bakteri uji adalah asam organik. Hal ini sesuai dengan hasil penghitungan ph dan total asam tertitrasi. Hasil tersebut dilanjutkan dengan mencari konsentrasi minimum penghambatan (MIC). Nilai MIC terhadap tiga bakteri uji dapat dilihat pada Tabel 7.

42 Tabel 7. Nilai MIC Substrat Antimikroba Isolat 2B4 terhadap Bakteri Uji Jenis Bakteri Uji Konsentrasi Substrat Antimikroba (%) Populasi Akhir (Nt) (cfu/ml) % Penghambatan = 100% - (Nt/Nox100%) S. aureus 10 2,8x ,35 Populasi Awal 20 2,7x ,00 (No)=5,6x ,5x ,47 cfu/ml 40 2,4x , x , ,9x , ,5x , ,2x ,89 90* 4,6x , ,2x ,13 S. typhimurium 10 2,2x ,33 Populasi Awal 20 2,1x ,67 (No)=4,4x x ,73 cfu/ml 40 1,9x ,7 50 1,5x , ,4x , ,1x , ,3x ,03 90* 3,5x , ,9x ,50 E. coli 10 1,5x ,00 Populasi Awal 20 1,5x ,60 (No)=3,2x ,4x ,47 cfu/ml 40 1,3x , ,1x , ,6x , ,9x ,41 80* 3,1x , ,2x , ,4x ,77 Keterangan :* Nilai MIC merupakan konsentrasi penghambatan terendah yang dapat menurunkan pertumbuhan bakteri uji lebih dari 90% (Cosentino, 1999). Konsentrasi minimum penghambatan merupakan konsentrasi terendah yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba lebih dari 90%. Nilai MIC terhadap penghambatan pertumbuhan bakteri uji menunjukkan persentase yang berbeda. Nilai MIC substrat antimikroba yang dihasilkan oleh isolat bakteri 2B4 terhadap bakteri uji E. coli memiliki nilai yang lebih rendah dibandingkan dengan nilai MIC terhadap S. aureus dan S. typhimurium yaitu sebesar 90%. Nilai MIC terhadap penghambatan E. coli sebesar 80% artinya dibutuhkan 80% substrat antimikroba isolat bakteri 2B4

43 dalam menghambat pertumbuhan E. coli. Nilai MIC pada penghambatan E. coli yang lebih rendah dibandingkan dengan bakteri uji lain menunjukkan bahwa isolat 2B4 lebih efektif dalam menghambat bakteri uji E. coli. Konsentrasi minimum penghambatan masing-masing bakteri uji berbedabeda. Kosentrasi minimum penghambatan S. aureus adalah sebesar 90%. Artinya konsentrasi yang dibutuhkan untuk dapat menghambat S. aureus lebih dari 90% adalah 90% substrat antimikroba dari isolat bakteri 2B4. Hal yang sama juga terlihat pada konsentrasi terendah penghambatan isolat 2B4 terhadap S. typhimurium. Hal ini membuktikan bahwa antimikroba yang dihasilkan oleh isolat bakteri 2B4 kurang efektif dalam penghambatan bakteri uji S. aureus dan S. typhimurium. Nilai MIC senyawa antimikroba yang lebih rendah menunjukkan bakteri lebih sensitif terhadap senyawa tersebut (Naufalin, 2005). Perbedaan nilai MIC menunjukkan perbedaan besarnya penghambatan terhadap pertumbuhan bakteri uji. Nilai MIC terbaik yaitu pada penghambatan bakteri Gram negatif. Hal ini membuktikan bahwa antimikroba yang dihasilkan lebih efektif menghambat pertumbuhan bakteri Gram negatif (Tabel 7). Bakteri uji E. coli memiliki MIC terbaik yaitu 80% dengan total penghambatan 90,07% serta S. typhimurium yang termasuk dalam kelompok bakteri Gram negatif dengan total penghambatan yaitu 92%. Nilai MIC pada penghambatan bakteri S. aureus menghasilkan penghambatan terkecil yaitu 90% dengan total penghambatan 90%. Hasil ini menunjukkan bahwa isolat 2B4 lebih efektif dalam menghambat Gram negatif. Perbedaan struktur dinding sel bakteri gram negatif dan Gram positif mempengaruhi daya hambat suatu antimikroba. Bakteri Gram positif memiliki satu lapisan tebal peptidoglikan, sedangkan bakteri Gram negatif terdiri dari tiga lapisan. Sensitivitas suatu bakteri terhadap substrat antimikroba dipengaruhi oleh lapisan peptidoglikan yang menyusun dinding sel. Lapisan peptidoglikan pada bakteri Gram negatif lebih tipis dibandingkan dengan bakteri Gram positif. Peptidoglikan bakteri Gram negatif hanya 1% hingga 2% dari berat kering sel sedangkan bakteri Gram negatif mencapai 20% dari berat kering sel (McKane and Kandel, 1985).

44 KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Supernatan bebas sel yang diproduksi oleh 12 isolat BAL asal daging sapi lokal menghasilkan antimikroba yang mampu melakukan penghambatan terhadap pertumbuhan bakteri patogen (bakteri uji) Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, dan Salmonella typhimurium ATCC Antimikroba yang bekerja dominan dalam menghambat pertumbuhan bakteri uji adalah asam organik. Isolat bakteri yang mempunyai penghambatan terbaik adalah isolat bakteri 2B4. Isolat 2B4 lebih efektif dalam menghambat bakteri uji E. coli. Nilai MIC terhadap bakteri uji S. aureus, S. typhimurium, dan E. coli oleh substrat antimikroba 2B4 berturut turut 90%, 90%, dan 80%. Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk identifikasi isolat bakteri asal daging sapi tersebut serta dilakukan penambahan sumber protein pada media yang digunakan sehingga diharapkan dapat menghasilkan antimikroba bakteriosin dengan konsentrasi yang lebih tinggi.

45 UCAPAN TERIMA KASIH Penulis mengucapkan puji dan syukur kepada Allah Subhanahu WaTaala, atas berkat, rahmat, dan izinnya skripsi ini dapat diselesaikan dengan baik. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada dosen pembimbing Ibu Irma Isnafia Arief, S.Pt., M.Si. dan Ibu Dr. Ir. Rarah R. A. Maheswari, DEA yang selalu sabar menuntun dalam proses belajar, kepada dosen penguji Bapak Epi Taufik, S.Pt., MVPH dan Ibu Dr. Ir. Erlyn Evvierni, M.S, M.Si., kepada dosen pembimbing akademik Bapak Epi Taufik, S.Pt., MVPH dan Bapak Dr. Ir Cece Sumantri, M.Agr.Sc yang telah menuntun dan membimbing selama empat tahun masa kuliah serta kepada seluruh dosen yang telah memberikan bekal ilmu yang sangat berguna. Kepada kedua orang tua Ibu dan Bapak, terima kasih atas kasih sayang yang tidak pernah habis untuk memberikan pendidikan, tanpa doa mereka, tiada kesuksesan yang dapat diraih. Kepada kakak-kakakku (Iswan, Sasa, dan Yani) yang selalu memberikan semangat dan dorongan. Serta terima kasih kepada keluarga besar Nenek Umi atas bantuan dan doanya. Kepada teman-teman satu tim penelitian, Ratih Permanasari, Dwi Paramitasari, dan Siti Komariah yang selalu berbagi suka duka bersama. Temanteman yang penelitian bersama di Lab Bag. IPT Perah Dinni P., Ria, Stefani, Maya, Trias, Triana, Mita dan Amalia yang selalu berbagi ilmu. Teman-teman yang penelitian bersama di Lab Bag. IPT Ruminansia Besar Widimartani, Tito, Dudi, Umar, dan Helmi. Teman-teman yang selalu ada Rahma, Puput, Cicilia, Mira serta semua teman-teman THT 41 yang selalu memberikan kecerian dan rasa kekeluargaan. Kepada semua pihak yang telah membantu, tiada pernah cukup ucapan beribu terima kasih hingga karya ini dapat selesai.

46 DAFTAR PUSTAKA Badan Standarisasi Nasional SNI Batas Maksimum Cemaran Mikroba dan Batas Maksimum Residu dalam Bahan Pangan Makanan Asal Ternak Hewan. Badan Standarisasi Nasional Indonesia, Jakarta. Bhunia A. K., M. C Johnson, and B. Ray Purification and characterization antimicrobial spectrum of bacteriocin produced by Pediococcus acidilactici, J. Appl. Bacteriol. 65: Branen, A. L., P. M. Davidson, and S. Salminen Food Additive. Marcel Dekker, Inc., New York. Bromberg R., I. Moreno, C. L. Zagagini, R. R. Delboni and J. de Oliveira Isolation of bacteriocin producing lactic acid bacteria from meat and meat products and its spectrum of inhibitory activity. Braz. J. Microbiol. 35: Buckle, K. A., R. A. Edwards, G. H. Fleet dan M. Wotton Ilmu Pangan. Terjemahan: H. Purnomo dan Adiono. Penerbit Universitas Indonesia, Jakarta. Cabo, M. L., A. F. Braber, and P. M. Koenreaad Apparent antifungal activity of several lactic acid bacteria against penicillium discolor is due to acetic acid in the medium. J. Food Protec. 65 : Corner D. E., R. E. Brackett and L. R. Beuchat Effect of temperature, sodium chlorida and ph on growth of Listeria monocytogenes in cabbage juice. Appl. Environ. Microbiol. 41: Cosentino, S In vitro antimicrobial activity and chemical composition of Sardinian Thymus essential oil. Lett. Appl. Microbiol. 29: Dabrowski W., K. R. Kasztelan, J. Kur, and R. Kotloski Listeria monocytogenes in salted herring. Htpp:// [20 Agustus 2007]. Davidson, P. M. and A. L. Branen Antimicrobial in Food. 2 nd Edition. Revised and Expanded. Marcel Dekker Inc., New York. Davidson, P. M. and D. G. Hoover Antimicrobial components from lactic acid bacteria. In: S. Salminen dan A. V. Wright (Editors). Lactic Acid Bacteria. Marcel Dekker, Inc., New York, Basel and Hongkong. Dewan Standarisasi Nasional Cara Uji Makanan dan Minuman. SNI Badan Standarisasi Nasional, Jakarta.

47 Earnshaw, R. G The antimicrobial action of lactic acid bacteria: natural food preservation system. In: B. J. B. Wood (Editor). The Lactic Acid Bacteria Vol. I: The Lactic Acid Bacteria in Health and Disease. Aspen Publisher, Inc., Gaithersburg, Maryland. Fardiaz, S Analisis Mikrobiologi Pangan. Petunjuk Laboratorium. Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi, Istitut Pertanian Bogor, Bogor. Fardiaz, S Mikrobiologi Pangan. PT Gramedia Pustaka Utama, Jakarta. Frazier, W. H. and D. C. Westhoff Food Microbiology. 4 th Edition. Mc Graw Hill Publishing Company Ltd., New Delhi. Garbutt, J Essentials of Food Microbiology. Arnold, London, Sidney, Auckland. Hadioetomo, R. S Mikrobologi Dasar dalam Praktek. PT Gramedia, Jakarta. Herald, P. J. and E. A. Zottola Attachment of Listeria monocytogenes to stainless stell surface at various temperature and ph value. J. Food Sci Hidayati, N Isolasi, identifikasi, dan karakteristik Lactobacillus plantarum asal daging sapi dan aplikasinya pada kondisi pembuatan sosis fermentasi. Skripsi. Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Holt, J. G., N. R. Krieg, P. H. A. Sneath, J. T. Staley and S. T. Williams Bergey s Manual of Determinative Bacteriology. 9 th Edition. William and Wilkins, Maryland. Hugas, M. and J. M. Monfort Bacterial starter culture for meat fermentation. J. Food Chemist. (59) 4: Jenie, B. S. L. dan S. E. Rini Aktivitas antimikroba dari beberapa spesies Lactobacillus terhadap mikroba patogen dan perusak makanan. Bul. Teknol. Ind. Pangan. 6(2): Jennie, B. S. L. 1996a. Peranan bakteri asam laktat sebagai pengawet hayati makanan. J. Ilmu Teknol. Pangan. 1(2): Kubo, I. H., H. Muroi and M. Himejima Antimicrobial activity against mutan of mute tea flavor component. J. Agric. Food Chem. 42: Lawrie, R. A Ilmu Daging. Terjemahan: A. Parakkasi. Penerbit Universitas Indonesia, Jakarta. McKane, L. and J. Kandel Microbiology: Essential and Application. McGraw- Hill Book Company, New York.

48 Mountney Poultry Product Technology. 2 nd Edition. The AVI Publ. Co. Inc., Wesport, Connecticut. Naufalin, F Kajian sifat antimikroba ekstrak bunga kecombrang (Nicolaia speciosa horan) terhadap berbagai mikroba patogen dan perusak pangan. Disertasi. Institut Pertanian Bogor, Bogor. Ouwehand, A. C Antimicrobial components from lactic acid bacteria. In: S. Salminen and A. V. Wright (Editors). Lactid Acid Bacteria Microbiology and Functional Aspect. Marcell Dekker, Inc., New York dan Basel. Ouwehand, A. and S. Vesterlund Antimicrobial components from lactic acid bacteria. In: S. Salminen, A. V. Wright and A. Ouwehand (Editors). Lactic Acid Bacteria Microbiology and Functional Aspect. 3 rd Edition. Marcell Dekker, Inc., New York dan Basel. Pelczar, M. J. dan E. C. S. Chan Dasar Dasar Mikrobiologi. Terjemahan. Universitas Indonesia Press, Jakarta. Ray, B Fundamental Food Microbiology. Tokyo CRC Press. p Roller, S Natural antimicrobials for the minimal processing of foods. Woodhead Publishing, Ltd. Cambridge, England. Salminen, S. and A. V. Wright Lactic Acid Bacteria. Microbiology and Functional Aspects. 2 nd Edition, Revised and Expanded. Marcell Dekker, Inc., New York. Savadogo, A., C. A. T. Outtara, I. H. N. Bassole, A. S. Traore Antimicrobial activities of lactic acid bacteria strains isolated from Burkina Faso fermented milk. J. Nutr. 3 (3): Schnell, N. K. D. Entian, U. Schneider, F. Gots, H. Zahner, R. Kellner, and G. Jung Prepeptida sequence of epidermin, a ribosomally synthesized antibiotic with four sulphide Ring. Nature. 333: Soeparno Ilmu dan Teknologi Daging. Universitas Gajah Mada Press, Yogyakarta. Suarsana, N Sifat fisikokimia bakteriosin yang dihasilkan oleh bakteri Staphylococcus epidermidis. J. Vet. 4(4) Surono, I Probiotik, Susu Fermentasi dan Kesehatan. PT Tri Cipta Karya, Jakarta. Steel, R. G. D. dan J. H. Torrie Prinsip dan Prosedur Statistika Suatu Pendekatan Biometri. Edisi kedua. Terjemahan. PT Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.

49 Stratford, M Traditional preservatif-organic acids. In: R. K. Robinson, C. A. Batt, and P. D. Patel (Editors). Encyclopedia of Food Microbiology. Vol. 1. Academic Press, London. Tagg, J. M., A. S. Dajani, and L. W. Wannamaker Bacteriocin of Gram positive bacteria. Bacteriol. Rev. 11: Thompson, D. P. and Hintom Inhibition of growth of mycotoxigenic Fusarium sp. by buthylated hydroxyanisole and/or carvacrol. J. Food Protect. 59: Tribowo, E. A., Aktivitas antimikroba Lactobacillus sp. hasil isolasi dari daging sapi terhadap bakteri patogen Gram positif dan Gram negatif. Skripsi. Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Varnam, A. and J. P. Sutherland Meat and Meat Products. Chapman and Hall, London. Vuyst, L. and E. J. Vandemme Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria Microbiology, Genetics and Application. Blackie Academic and Profesional, London.

50 LAMPIRAN

51 Lampiran 1. Analisis Ragam Rataan Diameter Zona Hambat 12 Isolat BAL terhadap S. aureus Sumber Keragaman db JK KT F Hit P Isolat bakteri 11 61,79 5,62 0,18 0,998 Galat ,96 31,66 Total ,75 Lampiran 2. Analisis Ragam Rataan Diameter Zona Hambat 12 Isolat BAL terhadap S. typhimiruum Sumber Keragaman db JK KT F Hit P Isolat bakteri 11 86,98 7,91 0,58 0,824 Galat ,50 13,56 Total ,48 Lampiran 3. Analisis Ragam Rataan Diameter Zona Hambat 12 Isolat BAL terhadap E. coli Perlakuan N Median Ave Rank Z 2D2 3 6,17 18,2 0,06 1D3 3 5,00 18,7 0,03 2A3 3 6,45 20,8 0,40 2C12 3 5,00 10,5 1,37 1B2 3 5,00 10,5 1,37 2D41 3 5,00 10,5 1,37 1A4 3 8,24 23,5 0,86 1C1 3 6,82 21,8 0,57 2D42 3 5,00 10,5 1,37 2B2 3 6,52 23,5 0,86 1A2 3 6,79 20,8 0,40 2B4 3 8,99 32,7 2,43 H = DF = 11 P = Lampiran 4. Analisis Ragam Rataan Diameter Zona Hambat Supernatan Bebas Sel Isolat BAL terhadap S. aureus Sumber Keragaman db JK KT F Hit P Isolat bakteri ,564 9,142 5,55 0,0002* Galat 24 39,522 1,647 Total ,085 Keterangan: *)Perbedaan perlakuan menghasilkan perbedaan yang nyata, dilanjutkan dengan uji lanjut Tukey

52 Lampiran 5. Analisis Ragam Rataan Diameter Zona Hambat Supernatan Bebas Sel Isolat BAL terhadap S. typhimurium Sumber Keragaman db JK KT F Hit P Isolat bakteri 11 37,042 3,367 2,33 0,040* Galat 24 34,667 1,444 Total 35 71,709 Keterangan: *)Perbedaan perlakuan menghasilkan perbedaan yang nyata, dilanjutkan dengan uji lanjut Tukey Lampiran 6. Analisis Ragam Rataan Diameter Zona Hambat Supernatan Bebas Sel Isolat BAL terhadap E. coli Sumber Keragaman db JK KT F Hit P Isolat bakteri ,420 9,129 2,08 0,065 Galat ,568 4,399 Total ,987 Lampiran 7. Analisis Ragam Nilai ph Substrat Antimikroba 12 Jenis Bakteri Asam Laktat Sumber Keragaman db JK KT F Hit P Isolat bakteri 11 1,786 0,161 52,8 0,000* Galat 24 0,073 0,003 Total 35 1,849 Keterangan: *)Perbedaan perlakuan menghasilkan perbedaan yang nyata, dilanjutkan dengan uji lanjut Tukey Lampiran 8. Morfologi dan Pewarnaan Gram Isolat Bakteri Asam Laktat yang Diisolasi dari Daging Sapi a. Isolat 1A2 b. Isolat 1A4

53 c. Isolat 2D41 d. Isolat 2D42 e. Isolat 2B2 f. Isolat 2A3 g. Isolat 2D2 h. Isolat 2C12 i. Isolat 1C1 j. Isolat 1B2

54 k. Isolat 2B4 l. Isolat 1D3 Lampiran 9. Gambar Uji Antagonistik Isolat BAL yang Diisolasi dari Daging Sapi terhadap Bakteri Patogen a. Uji Antagonistik Supernatan Bebas Sel Isolat BAL terhadap S. typhimurium b. Uji Antagonistik Supernatan Bebas Sel Isolat BAL terhadap E. coli c. Uji Antagonistik Supernatan Bebas Sel Isolat BAL terhadap S. aureus d. Uji Antagonistik Perlakuan Kontrol Tanpa Penambahan Supernatan Bebas Sel