METODE Lokasi dan Waktu Materi Rancangan Yijk = + αi + βj + (αβ) ij + ijk

Transkripsi

1 METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di bagian Laboratorium Ilmu Produksi Ternak Ruminansia Besar Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan Fakultas Peternakan dan Laboratorium Mikrobiologi, Seafast Centre pada bulan September 2008 hingga Oktober Materi Bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan bakso adalah daging sapi segar bagian gandik yang dibeli di pasar tradisional (Pasar Anyar Bogor), tepung tapioka, STPP, garam, es batu, bawang putih, dan merica. Media yang digunakan untuk penyegaran kultur starter yaitu de Man Rogosa Sharp Broth (MRS-B) lalu untuk pembuatan kultur induk bahan yang digunakan adalah Yeast Extract (YE) 3%, Vogel Johnson Agar (VJA), Eosyn Methylene Blue (EMBA) dan larutan pengencer Buffer Peptone Water (BPW) 1%, kalium tellurit 1% dan aquades. Peralatan yang digunakan untuk membuat kultur kerja adalah tabung reaksi, cawan petri, ose, inkubator. Alat yang digunakan untuk membuat bakso adalah food proccessor, peralatan dapur (talenan, pisau, baskom kecil, panci dan pengaduk). Alat yang digunakan untuk analisa mikrobiologi adalah cawan Petri, pipet volumetrik, pipet 5 ml, mikro pipet 1 ml, milipore 0.22 µm, tabung reaksi,tabung Schott, kertas saring, autoclave, bunsen, alumunium foil, tabung Corning 15 ml, alat sentrifugasi Hettich Zentrifugen 6000 rpm, kapas, kantong plastik HDPE tahan panas dan inkubator. Rancangan Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian ini adalah rancangan acak lengkap (RAL) faktorial 2x3 dengan dua faktor perlakuan yaitu pemberian substrat antimikroba dan dengan lama penyimpanan 0, 9 dan 18 jam pada suhu ruang menggunakan 3 kali ulangan terhadap kualitas mikrobiologis bakso (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella spp., dan total mikroba). Model matematis yang digunakan berdasarkan Steel dan Torrie (1995) : Yijk = µ + αi + βj + (αβ) ij + ijk 22

2 Keterangan : Yijk : variabel respon akibat pengaruh substrat antimikroba ke-i dan lama penyimpanan ke-j pada ulangan ke-k µ : nilai tengah populasi αi : pengaruh substrat antimikroba ke-i terhadap kualitas bakso βj : pengaruh lama penyimpanan ke-j terhadap kualitas bakso (αβ)ij : pengaruh interaksi antara substrat antimikroba ke-i dengan lama penyimpanan ke-j ijk : pengaruh galat percobaan pada unit percobaan ke-k dalam kombinasi perlakuan ke-ij Data yang diperoleh diuji dengan uji asumsi. Data yang memenuhi keempat asumsi yaitu kehomogenan, kebebasan galat, kenormalan dan keaditifan lalu diolah menggunakan analisis ragam dan bila terdapat perbedaan yang nyata antar perlakuan dilanjutkan dengan Uji Tukey. Prosedur Bakteri Pertumbuhan Berdasarkan penelitian Permanasari (2008) bakteri asam laktat yang mampu menghasilkan substrat antimikroba yang memiliki daya penghambatan terbaik terhadap suatu bakteri patogen adalah Lactobacillus plantarum dengan kode isolat 1A5. Ekstraksi Substrat Antimikroba Bakteri asam laktat yang telah disegarkan dihomogenisasi kemudian diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml MRSB yang diperkaya YE 3%. Kemudian dihomogenisasi dan diinkubasi selama 20 jam. Setelah 20 jam, bakteri asam laktat Lactobacillus plantarum 1A5 dimasukkan ke dalam tabung Corning kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 20 menit. Setelah itu, supernatan tersebut disaring dengan penyaring millipore 0,22 µm kedalam wadah tabung Schott steril. Supernatan bebas sel yang sudah disaring dinamakan substrat antimikroba. 23

3 Pembuatan Bakso Daging segar dipotong-potong. Daging kemudian digiling dalam food proccessor bersama garam 3%, STPP 0,5%, dan es batu 20%. Bumbu-bumbu seperti merica 0,2%, penyedap 0,2%, bawang putih 2%, tepung tapioka 20%, dan es batu 20% ditambahkan ke dalam adonan. Persentase bahan tambahan pembuatan bakso didasarkan berat daging sapi yang digunakan. Adonan kembali digiling sampai tercampur rata dan adonan menjadi kalis. Adonan tersebut lalu dibentuk bulat-bulat dan dimasukkan ke dalam air hangat dengan suhu C. Setelah mulai mengambang, bakso direbus dalam air mendidih (100 0 C) sampai matang (kira-kira menit). Bakso yang telah matang sebagian diambil sebagai kontrol dan sebagian diberikan perlakuan pengawetan dengan substrat antimikroba. Pengawetan Bakso dengan Substrat Antimikroba Bakso yang diberi perlakuan pengawetan dimasukkan ke dalam plastik tahan panas yang telah disterilkan sebelumnya lalu ditambahkan substrat antimikroba Lactobacillus plantarum 1A5 yang telah didapat dari hasil ekstraksi dengan perbandingan 1 bagian berat bakso: 1 bagian volume substrat antimikroba. Kemudian plastik ditutup dan dibiarkan selama 30 menit. Setelah itu bakso dipisahkan untuk masing-masing disimpan selama 0, 9, dan 18 jam pada suhu ruang dengan 3 ulangan untuk dilakukan analisis kuantitatif bakteri (Escherichia coli, Staphylococcus aureus dan total mikroba) dan analisis pendugaan bakteri Salmonella spp. Prosedur pembuatan bakso dengan penambahan substrat antimikroba Lactobacillus plantarum 1A5 dapat dilihat pada Gambar 6. 24

4 Daging Garam+1/2 bagian es+ STPP Digiling ke dalam bowl cutter selama 10 menit (I) Es ½ bagian Suhu adonan <20 ºC Digiling kembali ke dalam bowl cutter (II) Dimasukkan bumbu dan tepung Homogenisasi, pembuatan adonan, pencetakan dan dimasukkan dalam air hangat ( C) Direbus selama 15 menit dengan suhu 100ºC bakso matang Perendaman dengan subtrat antimikroba (30 menit) Tanpa perendaman Disimpan pada suhu ruang selama 0,9 dan 18 jam Analisis Mikrobiologi Gambar 6. Alur Proses Pembuatan Bakso dengan Penambahan Substrat Antimikroba Lactobacillus plantarum 1A5 25

5 Pengujian Kualitas Mikrobiologis pada Daging Segar dan Bakso Total Mikroba Pengukuran total mikroba dilakukan dengan metode Total Plate Count yaitu dengan mencampurkan 10 g sampel bakso dan daging segar bersama larutan pengencer sebanyak 90 ml sampai larutan menjadi homogen. Pengenceran dilakukan dengan mengambil 1 ml larutan sampel yang sudah homogen tersebut dengan menggunakan pipet steril kemudian dimasukkan kedalam tabung reaksi berisi 9 ml larutan pengencer sehingga terbentuk pengenceran 10-1 kemudian larutan tersebut dikocok sampai homogen. Pemipetan dilakukan dari masing-masing tabung pengenceran sebanyak 1 ml larutan sampel dan dipindahkan ke dalam cawan Petri steril secara duplo dengan menggunakan pipet steril. Media agar ditambahkan ke dalam cawan Petri dengan metode tuang sebanyak 20 ml dan digoyangkan sampai merata. Cawan Petri (agar yang sudah membeku) diinkubasi dengan posisi terbalik dalam inkubator bersuhu 37 C selama 48 jam. Perhitungan koloni bakteri pada cawan yang telah diinkubasi dihitung berdasarkan jumlah yang layak dihitung ( koloni) (APHA,1992). Analisis Kuantitatif Total Staphylococcus aureus Sebanyak 10 g sampel daging segar dan bakso diencerkan dengan larutan pengencer (BPW) sebanyak 90 ml sampai larutan menjadi homogen (pengenceran 10-1 ). Sebanyak 1 ml dari larutan pengenceran 10-1 yang sudah homogen dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 9 ml larutan pengencer sehingga terbentuk pengenceran 10-2 kemudian larutan tersebut dikocok sampai homogen. Lakukan pengenceran sampai Setelah pengenceran, dilakukan pemupukan dengan cara mengambil sebanyak 1 ml pengencer dari tiga pengenceran terakhir yaitu 10-3, 10-4, dan 10-5 dipindahkan ke dalam cawan Petri steril secara duplo. Media agar Vogel Johnson Agar (VJA) yang ditambah dengan kalium tellurit 1% dimasukkan ke dalam cawan Petri tersebut. Pemupukan ini dilakukan dengan metode tuang sebanyak ±20 ml dan digoyangkan membentuk angka 8. Cawan Petri (agar yang sudah membeku) diinkubasi dengan posisi terbalik dalam inkubator bersuhu 37 0 C selama 24 jam. Koloni S. aureus berwarna hitam dikelilingi kuning (APHA,1992). 26

6 Analisis Kuantitatif Escherichia coli Pengukuran E. coli dilakukan dengan mencampurkan 10 g sampel daging segar dan bakso dengan larutan pengencer (BPW) sebanyak 90 ml sampai larutan menjadi homogen (pengenceran 10-1 ). Sebanyak 1 ml dari larutan pengencer pertama yang sudah homogen dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 9 ml larutan pengencer sehingga terbentuk pengenceran 10-2 kemudian larutan tersebut dikocok sampai homogen. Lakukan pengenceran sampai Setelah pengenceran, dilakukan pemupukan dengan cara mengambil sebanyak 1 ml pengencer dari 3 pengenceran terakhir yaitu 10-3, 10-4, dan 10-5 dipindahkan ke dalam cawan Petri steril secara duplo. Media agar Eosyn Methylen Blue Agar (EMBA) ditambahkan ke dalam cawan Petri tersebut. Pemupukan ini dilakukan dengan metode tuang sebanyak ±20 ml dan digoyangkan membentuk angka 8. Cawan Petri (agar yang sudah membeku) diinkubasi dengan posisi terbalik dalam inkubator bersuhu 37 0 C selama 24 jam. Koloni E. coli berwarna kehijauan jika diletakkan di bawah sinar matahari atau sinar lampu (APHA,1992). Analisis Pendugaan Salmonella spp. Prinsip analisis Salmonella spp. (BAM,2007) adalah dengan menumbuhkannya pada media selektif dengan pra pengayaan (pre enrichment), dan pengayaan (enrichment) yang dilanjutkan dengan isolasi dan identifikasi. Uji kualitatif ini diperlukan beberapa tahap untuk dapat memperbanyak jumlah bakteribakteri patogen tersebut sehingga memudahkan untuk mendeteksi dan mengisolasinya. Tahap-tahap tersebut terdiri dari : Pra-Pengayaan. Sampel dagign segar dan bakso ditimbang sebanyak 25 gram atau ukur sebanyak 25 ml sampel secara aseptis kemudian dimasukkan kedalam wadah steril. 225 ml larutan LB (Lactose Broth) ke dalam kantong steril yang berisi sampel dihomogenkan dengan stomacher selama 1 menit sampai dengan 2 menit. Suspensi dipindahkan kedalam labu erlenmeyer atau wadah steril. Diinkubasi pada temperatur 35 0 C selama 24 jam ± 2 jam. Pengayaan. Biakan pra-pengayaan diaduk perlahan kemudian diambil dan dipindahkan berturut-turut kedalam media 10 ml SCB kemudian diinkubasi pada temperatur 35 0 C selama 24 jam. 27

7 Isolasi dan identifikasi. Suspensi diambil dari jarum ose dari masing-masing media pengayaan yang telah diinkubasi dan diinokulasikan pada media BSA. Diinkubasikan pada temperatur 35 0 C selama 24 jam ± 2 jam. Kemudian koloni diamati, pada media BSA koloni Salmonella terlihat keabu-abuan atau kehitaman, kadang metalik, media disekitar koloni berwarna colat dan semakin lama waktu inkubasi akan berubah menjadi hitam. Identifikasi dilakukan dengan mengambil koloni yang diduga sebagai Salmonella dari ketiga media tersebut dan diinokulasikan koloni ke TSIA dan LIA dengan cara menusuk kedalam bagian tegak agar miring, selanjutnya digores pada permukaan agar miring. Diinkubasikan pada temperatur 35 0 C selama 24 jam ± 2 jam. Koloni spesifik Salmonella spp. diamati dengan merujuk pada hasil reaksi seperti tercantum pada Tabel 3. Tabel 3. Hasil Uji Salmonella spp. pada TSIA dan LIA Media Agar Miring Dasar Agar H2S Gas TSIA Alkalin/K Asam/A Positif Negatif (merah) (kuning) (hitam) positif LIA Alkalin/K Asam/A Positif Negatif (ungu) (ungu) (hitam) positif Salmonella spp. termasuk dalam kelompok batang anaerobik fakultatif gram negatif. Morfologi sel-nya adalah batang pendek (0,5-1,0 x 1,0-3,0 µm), sel-nya memiliki peritrikus yakni flagella yang secara merata tersebar di seluruh permukaan sel. Ciri-ciri biokimia adalah banyak sekali terjadi perubahan pada substrat, dan keterangan ini memberikan cara-cara dasar untuk pembedaan dan identifikasi spesies (Pelczar et al, 2005). 28