BAHAN DAN METODE. terbesar. Keseluruhan hasil yang didapat ditampilkan pada Tabel 1.

Transkripsi

1 4 Tabel 1 Hasil analisis oligosakarida madu menggunakan GC-MS (Ruiz-Matute et al. 2010) Oligosakarida Sampel madu (mg/ 100g) maksimum minimum Rafinosa kestosa kestosa+neo-kestosa Erlosa Planteosa Melezitosa Teanderosa Glc-(1 1)-Glc-(1 x)-glc (x=3 atau 4) Glc-Glc-Glc Glc-Glc-Glc Glc-(1 x)-glc-(1 2)-Glc+Fru-(2 x)-glc-(1 3)-Fru 58.9 Tr Fru-(2 x)-glc-(1 3)-Fru Fru-(2 x)-glc-(1 3)-Fru Maltotriosa Glc-Glc-Glc α-3 -Glukosil-isomaltosa α-glc-(1 x)-α-glc-(1 1)-Fru,1+α-Glc-(1 6)-α-Glc-(1 2)-Glc E α-glc-(1 x)-α-glc-(1 1)-Fru, Cincin pereduksi tersubtitusi pada C6 turunan dari isomaltosa Panosa Glc-(1 x)-glc-(1 6)-Glc (x=3 atau 4) Glc-Glc-Glc α-glc-(1 6)-α-Glc-(1 2)-Glc Z Isomaltotriosa Nistosa Turunan sukrosa Turunan sukrosa Turunan sukrosa Turunan sukrosa Tetrasakarida Turunan sukrosa Tetrasakarida Turunan sukrosa Kromatografi gas (GC) memberikan hasil yang paling baik untuk analisis kualitatif. Pada kromatografi gas, oligosakarida yang akan dianalis dibuat senyawa turunannya. Dua jenis cara membuat senyawa turunan oligosakarida, yang pertama yaitu dengan trimetilsilil (TMS). Senyawa turunannya berasal langsung dari senyawa oligosakarida. Metode yang kedua adalah alditol asetat. Semua karbohidrat direduksi menjadi alditol dengan natrium borohidrida (Wetzel & Charalombous 1998). Perkembangan penggunaan GC dalam analisis madu dilakukan oleh Ruiz-Matute et al.(2010). Dalam studinya dilakukan analisis kandungan enam madu asal Spanyol dan enam madu asal Selandia Baru menggunakan Kromatografi Gas-Spektroskopi Massa (GC- MS. Hasil analisis ditemukan bahwa erlosa dan panosa sebagai komponen trisakarida terbesar. Keseluruhan hasil yang didapat ditampilkan pada Tabel 1. BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain adalah sampel madu yang berasal dari Hutan Kampung Bukit Gunung Tambora, Bima, Pulau Sumbawa. Bahan yang digunakan dalam isolasi dan deteksi oligosakarida adalah arang aktif, etanol 10%, 50%, dan 80%, air deioinisasi, millipore 0.22 μm, lempeng KLT Whatman K6F silika 250μm (Merck), lempeng KLT PLC silika gel 60 F 254r 0.5mm (Merck), akuades, N*(1-naftil) etilendiamina dihidroklorida (Merck), metanol, n-butanol, asam sulfat, piridin, asam asetat, glukosa, fruktosa, dan standar

2 5 karbohidrat DP 3 maltotriosa (AppliChem) dan DP 4 maltotetraosa (AppliChem). Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah peralatan gelas, oven, neraca analitik OHAUS GA 200, vakum, kertas alumunium, pengering rambut, chamber KLT, botol semprot, pipet mikro, pipet kapiler, pengaduk magnetik, kertas saring Whatman No.1, dan instrumen Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS) Waters di PT Omega Farma Medika Jakarta. Metode Preparasi oligosakarida madu hutan Gunung Tambora Sumbawa melalui adsorpsi arang aktif dan pengadukan dalam etanol (Morales et al. 2006) Preparasi Oligosakarida. Preparasi karbohidrat dengan perlakuan arang aktif terbagi ke dalam dua proses yaitu pemisahan mono- dan disakarida serta perolehan kembali oligosakarida dengan menggunakan pelarut etanol-air yang memiliki konsentrasi 50%. Seluruh perlakuan dilakukan dengan dua kali ulangan. Eliminasi monosakarida. Sebanyak 5 g sampel madu dilarutkan dalam 1000 ml etanol 10% (v/v). Ke dalam larutan tersebut ditambahkan 30 g arang aktif 100 mesh. Larutan selanjutnya diaduk menggunakan pengaduk magnetik dengan kecepatan 800 rpm selama 30 menit. Setelah itu, larutan disaring menggunakan kertas saring Whatman No.1 dalam kondisi vakum. Kemudian residu dibilas menggunakan 250 ml pelarut yang sama. Pemulihan oligosakarida. Residu hasil pemisahan mono- dan disakarida dilarutkan kembali dengan 1000 ml pelarut etanol dengan konsentrasi 50% (Morales et al. 2006) dan 80% (Wichiencot et al. 2010). Larutan diaduk menggunakan pengaduk magnetik selama 30 menit dengan kecepatan 800 rpm. Setelah itu larutan disaring menggunakan kertas Whatman No.1 dalam keadaan vakum. Filtrat yang didapatkan kemudian dievaporasi dalam keadaan vakum pada suhu 40 0 C. Efektivitas konsentrasi etanol 50% dan 80% diuji secara kualitatif dengan KLT selanjutnya. Proses preparasi dilakukan sebanyak dua kali ulangan. Deteksi dan isolasi oligosakarida dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) modifikasi metode Vergara et al. (2010) serta Optimasi Eluen yang Digunakan. Hasil preparasi sampel madu yang diperoleh dideteksi dengan KLT Whatman K6F lempeng silika dengan ketebalan 250μm. Jumlah spot yang terbentuk dapat digunakan untuk membandingkan konsentrasi etanol yang lebih baik dalam proses perolehan kembali oligosakarida pada saat preparasi sampel sebelumnya. Untuk proses deteksi digunakan lempeng KLT ukuran panjang x lebar 10 x 5 cm. Sebanyak 10μL ditotolkan ke lempeng KLT dengan jarak 0.5 cm dari bagian bawah lempeng. Lempeng dielusi dengan campuran pelarut yang terdiri atas butanol: asam asetat: air (3:1:1 v/v) (Kim et al. 1995) dan butanol: etanol: air (4:3:3 v/v) (Schneider et al. 1993) (Campuran eluen yang menghasilkan spot dengan keterpisahan yang lebih baik yang akan digunakan pada tahap KLT preparatif). Lempeng kemudian disemprot dengan larutan indikator yang berisi 0.3g/100 ml N*(1-naftil) etilendiamina dihidroklorida pada suatu sistem pelarut yang terdiri atas metanol: H 2 SO 4 (97:3 v/v). Lempeng dipanaskan pada oven dengan suhu C hingga spot dapat terlihat yakni sekitar 8-10 menit. KLT juga dilakukan terhadap sampel madu yang belum mengalami isolasi. Isolasi oligosakarida selanjutnya dilakukan terhadap sampel yang menghasilkan spot terbaik pada saat deteksi oligosakarida. Urutan kerja yang dilakukan sama seperti pada saat deteksi, namun mengikuti kaidah teknik KLT preparatif, dilakukan dengan plat berukuran 20 x 20 cm dan aplikasi sampel dilakukan pada jarak 2 cm dari bawah lempeng. Setelah lempeng KLT dipanaskan dalam oven, pita yang terbentuk diukur Rf-nya. Pita yang memiliki Rf> dari standar DP 2 dikerok. Selanjutnya, silika hasil pengerokan di larutkan dalam 40 ml etanol dengan konsentrasi yang sama pada saat pemulihan oligosakarida yang menghasilkan keterpisahan spot terbaik, dan kemudian larutan diaduk dengan kecepatan 600 rpm selama 10 menit. Selanjutnya, larutan disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 30 menit. Supernatan dipisahkan dengan penyaringan menggunakan millipore 0.22 μm kemudian dievaporasikan dalam keadaan vakum pada suhu 40 0 C. Identifikasi oligosakarida menggunakan LC-MS (modifikasi HPLC Astwood et al. 1998) Madu murni dan isolat oligosakarida yang didapatkan dilarutkan dalam air nanofiltrasi dan sebanyak 20µL (20 mg/ml) diinjeksikan ke dalam sistem LC-MS yang memiliki

3 Pelarut % rendemen Etanol 50% 2,09 Etanol 80% 7,62

4 G M 0,65 0,61 0,63 0,63 G M 0,65 0, ,62 0,55 0, ,55 0,48 Std S5 S8 Std S8 S5

5 , Rt = 2.26 Rt = 2.24 Rt = 2.23

6 9 Rt = 2.24 Rt = 2.31 Standar Standar Rt = 2.22 Rt = 2.40 Madu Madu Rt = 2.24 Rt = 2.29 Isolat Oligosakarida Gambar 6 Kromatogram LC-MS maltotetraosa dari senyawa standar, madu murni, dan isolat oligosakarida. Isolat Oligosakarida Gambar 7 Kromatogram LC-MS glukosa dari senyawa standar, madu murni, dan isolat oligosakarida. Konsentrasi maltotetraosa pada isolat yang lebih tinggi dibanding pada madu murni tersebut menunjukkan bahwa proses yang dilakukan berhasil mengisolasi oligosakarida dengan DP 4 pada konsentrasi yang signifikan. Hasil yang berbeda terjadi pada maltotriosa dengan DP 3, dimana konsentrasi oligosakarida tersebut menurun setelah proses isolasi dilakukan. Penurunan konsentrasi DP 3 tidak mendukung sebagaimana yang disebutkan dalam Karimah (2010) bahwa konsentrasi oligosakarida dengan DP>2 berada pada konsentrasi yang lebih signifikan setelah madu mengalami proses isolasi. Penurunan konsentrasi perolehan oligosakarida DP 3 setelah isolasi memberikan alasan tambahan perlunya dilakukan optimasi metode isolasi yang digunakan. Tabel 3 Hasil identifikasi kandungan oligosakarida madu murni dan isolat oligosakarida menggunakan LC-MS Standar Konsentrasi (µg/ml) Kadar senyawa isolat/madu murni (%) Madu murni Isolat Glukosa (DP 1) 2182,96 278,34 12,75 Maltotriosa (DP 3) 246,94 95,03 38,48 Maltotetraosa (DP 4) 23,27 118,71 510,23

7 10 Tabel 4 Jenis-jenis trisakarida (C 18 H 32 O 16, BM = 504.4) dalam madu (Ruiz-Matute et. al 2010) Nama Senyawa Rumus Molekul Centosa α-d-glcp-(1 4)-α-D-Glcp-(1 2)-D-Glcp Erlosa α-d-glcp-(1 4)-α-D-Glcp-(1 2)-β-D-Fruf Isomaotriosa α-d-glcp-(1 6)-α-D-Glcp-(1 6)-D-Glcp Isomelezitosa α-d-glcp-(1 6)-β-D-Fruf-(2 1)-α-D-Glcp Isopanosa α-d-glcp-(1 4)-α-D-Glcp-(1 6)-D-Glcp 1-Kestosa β-d-fruf-(2 1)-β-D-Fruf-(2 1)-α-D-Glcp 6-Kestosa β-d-fruf-(2 6)-β-D-Fruf-(2 1)-α-D-Glcp Laminaritriosa β-d-glcp-(1 3)-β-D-Glcp-(1 3)-D-Glcp Maltotriosa α-d-glcp-(1 4)-α-D-Glcp-(1 4)-D-Glcp Melezitosa α-d-glcp-(1 3)-β-D-Fruf-(2 1)-α-D-Glcp Neokestosa β-d-fruf-(2 6)-α-D-Glcp-(1 2)-β-D-Fruf Panosa α-d-glcp-(1 6)-α-D-Glcp-(1 4)-D-Glcp Planteosa α-d-galp-(1 6)-β-D-Fruf-(2 1)-α-D-Glcp Raffinosa α-d-galp-(1 6)-α-D-Glcp-(1 2)-β-D-Fruf Theanderosa α-d-glcp-(1 6)-α-D-Glcp-(1 2)-β-D-Fruf Isomaltosylglukosa α-d-glcp-(1 6)-α-D-Glcp-(1 3)-D-Glcp 4-α-Gentobiosilglukosa (sorborosa) β-d-glcp-(1 6)-α-D-Glcp-(1 4)-D-Glcp Tabel 5 Jenis-jenis tetrasakarida (C 24 H 42 O 21, BM = 666.6) dalam madu (Astwood et al. 1998; Rittig 2001; Ruiz Matute et al 2010). Nama Senyawa Rumus Molekul α-4 -glukosilerlosa α-d-glcp-(1 4)-α-D-Glcp-(1 4)-α-D-Glcp-(1 2)-β-D-Fruf α-6 -glukosilerlosa α-d-glcp-(1 6)-α-D-Glcp-(1 4)-α-DGlcp-(1 2)-β-D-Fruf Fruktosilisomelezitosa Fru-(??)-α-D-Glcp-(1 6)-β-D-Fruf-(2 1)-α-D-Glcp Isomaltotetraosa α-d-glcp-(1 6)-α-D-Glcp-(1 6)-α-DGlcp-(1 6)-D-Glcp Maltotetraosa α-d-glcp-(1 4)-α-D-Glcp-(1 4)-α-DGlcp-(1 4)-D-Glcp Nistosa β-d-fruf-(2 1)-β-D-Fruf-(2 1)-β-D-Fruf-(2 1)-α-D-Glcp Stakiosa α-d-galp-(1 6)-α-D-Galp-(1 6)-α-DGlcp-(1 2)-β-D-Fruf Metode identifikasi oligoskarida menggunakan LC-MS pada studi ini belum cukup untuk menentukan jenis oligosakarida DP 3 & DP 4 yang terkandung dalam madu hutan Gunung Tambora Sumbawa secara spesifik. Modifikasi metode lain diperlukan seperti GC-MS dalam Ruiz-Matute et al (2010) ataupun instrumen tambahan seperti Matrix Assisted Laser Desoprtion Ionisatian- Time of flight Mass Spectrometry (MALDI- TOF-MS). Tabel 4 dan 5 memperlihatkan jenis-jenis DP 3 dan DP 4 dari madu mancanegara yang telah berhasil diidentifikasi sampai saat ini. Komposisi Oligosakarida, Pembentukannya, serta Potensinya sebagai Prebiotik Komposisi kimia madu, termasuk kandungan oligosakarida di dalamnya dapat bervariasi bergantung pada tanaman sumber nektar, pengaruh musim dan iklim, serta letak geografis dari sumber nektar. Senyawa senyawa dalam madu berasal dari: pematangan dari madu, penambahan dari lebah, dan lainnya merupakan derivat dari tanaman (Bogdanov 2009). Lebih dari 95% padatan di dalam madu merupakan karbohidrat di alam dan 85-95% nya adalah fruktosa dan glukosa sebagai pembentuk oligosakarida (Bogdanov 2009). Oligosakarida pada madu merupakan produk proses enzimatik yang dilakukan oleh beberapa enzim, yaitu: α-glukosidase, β- Glukosidase, dan Invertase ragi ( Pontoh 2001,Pontoh & Low 2002, Balasubramanyam 2011). Enzim α-glukosidase merupakan enzim yang bertanggung jawab pada proses hidrolisis nektar hingga menjadi glukosa dan sukrosa. Enzim α-glukosidase ini merupakan enzim yang ditambahkan oleh lebah madu ke dalam madu, yang bertanggung jawab atas hidrolisis sukrosa (DP 2) pada nektar menjadi glukosa dan fruktosa. Enzim ini juga memiliki fungsi transglikosilasi (Pontoh 2001). Transglikosilasi merupakan proses pemindahan gugus α-d-glukosil dari molekul sukrosa baik menuju molekul air membentuk glukosa bebas, ataupun menuju molekul gula lain untuk membentuk oligosakarida yang lebih kompleks di dalam madu seperti maltulosa, nigerosa, maltosa, kojibiosa, turanosa, ataupun isomaltosa. Erlosa sebagai