TESIS. AKTIVITAS ANTI-Mycobacterium tuberculosis EPIGALLOCATECHIN-GALLATE (EGCG) DAN OBAT ANTITUBERKULOSIS LINI PERTAMA

Transkripsi

1 KOMBINASI (-)- EPIGALLOCATECHIN-GALLATE (EGCG) DAN OBAT ANTITUBERKULOSIS LINI PERTAMA PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI ILMU FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS AIRLANGGA SURABAYA 2016

2 KOMBINASI (-)- EPIGALLOCATECHIN-GALLATE (EGCG) DAN OBAT ANTITUBERKULOSIS LINI PERTAMA PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI ILMU FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS AIRLANGGA SURABAYA 2016

3 Prasyarat Gelar Magister KOMBINASI (-)- EPIGALLOCATECHIN-GALLATE (EGCG) DAN OBAT ANTITUBERKULOSIS LINI PERTAMA Untuk mempeoleh Gelar Magister dalam Program Magister Program Studi Ilmu Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Airlangga Oleh : NIM PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI ILMU FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS AIRLANGGA SURABAYA Tanggal 12 Februari 2016 ii

4 ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

5 Penetapan Panitia Penguji Tesis Telah Diuji pada Tanggal 11 Januari 2016 PANITIA PENGUJI Ketua : Prof. Dr. Noor Erma Nasution, MS., Apt. Anggota : 1. Dr. Isnaeni, MS., Apt. 2. Prof. Dr. Djoko Agus Purwanto, M.Si., Apt. 3. Prof. Dr. Mangestuti Agil, MS., Apt. 4. Dr. Riesta Primaharinastiti, M.Si., Apt. iv

6 ADLN-PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

7 UCAPAN TERIMA KASIH Puji syukur peneliti panjatkan ke hadirat Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat-nya sehingga tesis yang berjudul AKTIVITAS ANTI- Mycobacterium tuberculosis KOMBINASI (-)-EPIGALLOCATECHIN- GALLATE (EGCG) DAN OBAT ANTITUBERKULOSIS LINI PERTAMA dapat terselesaikan. Tersusunnya tesis ini tidak lepas dari bantuan berbagai pihak baik secara moral dan material. Oleh karena itu, pada kesempatan ini tak lupa peneliti menyampaikan terima kasih dan penghargaan yang sedalam-dalamnya kepada : 1. Allah SWT yang telah memberikan kesehatan, kemudahan dan kelancaran selama proses pengerjaan tesis ini 2. Ayahanda dan Ibunda tercinta, adik, kakak, serta keluarga yang senantiasa memberikan kasih sayang, perhatian, dukungan, serta doa pada peneliti 3. Dr. Isnaeni, MS., Apt. selaku pembimbing utama dan Prof. Dr. Djoko Agus Purwanto, M.Si., Apt. selaku pembimbing serta atas segala waktu, kesabaran, ketelitian, bimbingan serta masukan selama peneliti menyelesaikan tesis ini 4. Prof. Dr. H. Mohammad Nasih, MT., SE., Ak. selaku Rektor Universitas Airlangga yang telah memberikan kesempatan untuk menyelesaikan program pendidikan pascasarjana di Universitas Airlangga 5. Dr. Umi Athiyah, Dra., MS., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Airlangga yang telah memberikan kesempatan untuk menyelesaikan program pendidikan pascasarjana prodi Ilmu Farmasi 6. Prof. Dr. Bambang P.E.W., M.S., Apt. selaku Ketua Prodi Ilmu Farmasi, Program Pascasarjana Fakultas Farmasi Universitas Airlangga yang telah memberikan kesempatan untuk menyelesaikan program pendidikan pascasarjana prodi Ilmu Farmasi 7. Prof. Dr. Sudjarwo, Apt., MS. selaku Ketua Minat Analisis Farmasi, Prodi Ilmu Farmasi, Program Pascasarjana, Fakultas Farmasi Universitas Airlangga yang telah memberikan bimbingan dan nasehat selama masa pendidikan vi

8 8. Prof. Dr. Noor Erma Nasution, MS., Apt., Dr. Riesta Primaharinastiti, M.Si., Apt., dan Prof. Dr. Mangestuti Agil, MS., Apt. selaku dosen penguji yang telah memberikan saran dan masukan hingga terselesaikan tesis ini 9. Penanggung jawab Laboratorium Tuberkulosis, Institute of Tropical Disease, Universitas Airlangga, Prof., Dr. Ni Made Mertaniasih, dr., MS., Sp.MK. dan Penanggung Jawab Laboratorium Kimia Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Airlangga, Febri Annuryanti, S.Farm., Apt. yang telah memberikan ijin, kesempatan dan fasilitas untuk bekerja di laboratorium serta segala bantuan selama penelitian 10. Karyawan Prodi Ilmu Farmasi, Mas Arie, serta karyawan Departemen Kimia Farmasi dan Laboratorium Tuberkulosis di ITD Universitas Airlangga, Bu Wati, Pak Bakir, Pak Kusairi, Pak Sugeng, Mba Agnes, Desak, serta staf-staf yang lain atas semua bantuan waktu dan tenaga selama penyelesaian tesis ini 11. Seluruh dosen Fakultas Farmasi Universitas Airlangga atas segala bimbingan dan bekal ilmu yang diberikan selama masa pendidikan 12. Sahabat dan teman seperjuangan di Fakultas Farmasi Universitas Airlangga, Ranny, Ita, Mba Engrid, Putri, tempat berbagi suka dan duka, terima kasih atas dukungan dan semangatnya. 13. Teman-teman kos di Jl. Gubeng Kertajaya 7E/34 Surabaya, tempat berkeluh kesah selama ini, terima kasih atas dukungan dan semangatnya. 14. Rekan kerja di Apotek Farmasi Airlangga, Ayek, Ishma, Endah, Bu Anik, Mba Vita, Mas Andik, Pak Tanto, dan Mas Budi, terima kasih atas dukungan dan semangatnya. 15. Semua pihak yang secara langsung maupun tidak langsung membantu terselesaikannya tugas akhir ini. Tidak ada satupun kebenaran dan kesempurnaan kecuali milik Allah SWT. Akhirnya, tesis yang masih banyak kekurangan ini peneliti persembahkan kepada almamater Fakultas Farmasi Universitas Airlangga dengan harapan semoga bermanfaat bagi kita semua. Surabaya, Februari 2016 Peneliti vii

9 RINGKASAN KOMBINASI (-)- EPIGALLOCATECHIN-GALLATE (EGCG) DAN OBAT ANTITUBERKULOSIS LINI PERTAMA Anggita Mirzautika Tuberkulosis (TB) merupakan penyakit infeksi yang disebabkan Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). Jutaan orang di dunia terserang infeksi TB tiap tahun. Estimasi terakhir menunjukkan terdapat 8,6 juta kasus TB baru pada tahun 2012 dan 1,3 juta meninggal dunia (WHO 1, 2013). Durasi pengobatan TB minimal enam bulan. Regimen fase inisiasi selama dua bulan yaitu pemberian Isoniazid (INH), Rifampicin (RIF), Pyrazinamid (PZA), dan Ethambutol (EMB) setiap hari. Walaupun regimen selama enam bulan (fase inisiasi dua bulan dengan fase kontinuasi INH dan RIF selama empat bulan) merupakan pilihan yang banyak digunakan, regimen fase kontinuasi alternatif juga dapat digunakan. Fase kontinuasi alternatif yaitu pemberian INH dan EMB selama enam bulan, sehingga durasi pengobatan keseluruhan menjadi delapan bulan (Tuberculosis Coalition for Technical Assistance, 2006). Mekanisme penghambatan M. tuberculosis oleh RIF yaitu menghambat DNA-dependent RNA polymerase dari mikobakteria dengan menekan mula terbentuknya rantai dalam sintesis RNA, sehingga M. tuberculosis tidak bisa memperbanyak diri (Sulistia, 2007). Mekanisme penghambatan M. tuberculosis oleh INH yaitu setelah diaktivasi oleh enzim catalase/peroxidase, INH dapat mengganggu sintesis asam mikolat penting dengan menghambat enzim NADHdependent enoyl-acp reductase, sehingga tidak terbentuk dinding sel M. tuberculosis (Silva dan Palomino, 2011). Mekanisme penghambatan M. tuberculosis oleh PZA yaitu setelah diubah menjadi bentuk aktifnya, pyrazinoic acid, oleh enzim pyrazinamidase/nicotinamidase (PZase), PZA mengganggu pembentukan membran bakteri dan menghambat transportasi membran (Silva dan Palomino, 2011). Selanjutnya mekanisme penghambatan M. tuberculosis EMB yaitu mengganggu biosintesis arabinogalactan pada dinding sel (Silva dan Palomino, 2011). Masalah yang timbul berikutnya yaitu sebagian M. tuberculosis ternyata telah resisten terhadap obat antituberkulosis (OAT) disebabkan oleh faktor-faktor tertentu (WHO 2, 2013). Pengobatan yang tidak adekuat merupakan salah satu faktor resiko multidrug-resistance TB (MDR-TB). Jika M. tuberculosis menjadi resisten terhadap OAT, akan sulit untuk menyembuhkan penyakit TB. Oleh karena itu, diperlukan terapi yang lebih efektif untuk pengobatan TB. Terapi tersebut diharapkan mampu mencegah dan menangani resistensi obat. Terapi untuk mencegah dan menangani resistensi obat, salah satunya yaitu dengan mengkombinasikan senyawa tertentu dengan OAT lini pertama (INH, RIF, PZA dan EMB). Tujuan kombinasi tersebut adalah untuk meningkatkan aktivitas OAT, sehingga efektivitas pengobatan TB meningkat dan resistensi dapat dicegah. viii

10 Pada penelitian ini digunakan senyawa polifenol yang telah diisolasi dari ekstrak teh hijau (Camellia sinensis) untuk dikombinasikan dengan OAT yaitu (-)- epigallocatechin-gallate (EGCG) yang merupakan senyawa polifenol dominan. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Anand et al. (2006), EGCG memiliki kemampuan inheren untuk menurunkan aktivitas transkripsi gen host tryptophanaspartate containing coat protein (TACO) dalam makrofag manusia melalui kemampuannya menghambat faktor transkripsi SP1. Penurunan ekspresi gen TACO oleh EGCG dibarengi dengan penghambatan hidup mycobacterium dalam makrofag, sehingga disarankan untuk menggunakan EGCG sebagai anti infeksi tuberkulosis (Anand et al., 2006). Jika dikombinasikan dengan OAT lini pertama, EGCG diharapkan memberikan peningkatan aktivitas antituberkulosis. Penentuan minimum inhibitory concentration (MIC) masing-masing OAT lini pertama dan kombinasinya dengan EGCG dilakukan untuk membuktikan bahwa EGCG dapat meningkatkan potensi masing-masing OAT lini pertama (INH, RIF, PZA dan EMB) terhadap M. tuberculosis. Mycobacterium tuberculosis yang digunakan untuk penelitian ini adalah M. tuberculosis strain H37Rv karena diharapkan hasil yang diperoleh dapat menggambarkan aktivitas antituberkulosis kombinasi EGCG dengan OAT terhadap M. tuberculosis yang sensitif. Penentuan MIC yang dilakukan pada penelitian ini menggunakan metode broth dilution dengan medium cair Middlebrook 7H9, setelah diinkubasi lalu dilihat angka kekeruhannya dengan alat nephelometer pada hari ke-0, 7, 14, 21 dan 28. Minimum inhibitory concentration (MIC) masing-masing OAT sebelum dan setelah kombinasi yang telah ditentukan, kemudian dibandingkan, sehingga dapat diamati bahwa penambahan EGCG dapat menurunkan MIC masing-masing OAT lini pertama. Hasil yang didapatkan dari penentuan MIC masing-masing OAT sebelum dikombinasikan dan MIC EGCG yaitu 5 ppm, 0,5 ppm, 50 ppm, 5 ppm, dan 150 ppm,secara berurutan untuk RIF, INH, PZA, EMB dan EGCG. Nilai MIC EGCG yaitu 150 ppm, selanjutnya merupakan konsentrasi yang dikombinasikan dengan masing-masing OAT lini pertama. Penentuan MIC OAT yang telah dikombinasikan dengan EGCG 150 ppm memberikan hasil yaitu 0,5 ppm, 0,25 ppm, 20 ppm, dan 2 ppm, secara berurutan untuk RIF, INH, PZA, dan EMB. Berdasarkan hasil tersebut, dapat dilihat bahwa MIC OAT setelah dikombinasikan dengan EGCG menurun dibandingkan sebelum dikombinasikan, dengan persentase penurunan MIC sebesar 90%, 50%, 60% dan 60%, secara berurutan untuk RIF, INH, PZA, dan EMB. Hal ini disebabkan karena mekanisme EGCG dalam menghambat pertumbuhan M. tuberculosis berbeda dengan mekanisme OAT menghambat, sehingga memberikan efek sinergis. Kesimpulan dari penelitian ini yaitu EGCG meningkatkan aktivitas OAT. Maka jika terapi penyakit TB menggunakan EGCG sebagai komplemen, diharapkan dapat menurunkan dosis OAT serta meminimalkan efek samping dan toksisitas OAT tersebut serta dapat mencegah terjadinya MDR-TB. ix

11 ABSTRACT Anti-Mycobacterium tuberculosis Activity of (-)-Epigallocatechin-gallate (EGCG) and First-line Antituberculosis Drugs Combination Tuberculosis (TB) is a global health issue, and moreover there are increasing cases of multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) in the world. So the researchers have been trying to find new tuberculosis therapy that is more effective. In this study, the therapy that has been chosen is (-)-epigallocatechingallate (EGCG), from tea leaves (Camellia sinensis), used in combination with each of the first line antituberculosis drugs. The aim of this study is to find whether EGCG can increase the activity of the first line antituberculosis drugs against M. tuberculosis. If EGCG can increase their activity, it can be new alternative tuberculosis treatment that is more effective. The minimum inhibitory concentration (MIC) of each antituberculosis drug was determined by broth dilution method using Middlebrook 7H9 medium, the MIC result was 5 ppm, 0.5 ppm, 50 ppm and 5 ppm for rifampicin, isoniazid, pyrazinamide and ethambutol, respectively. Then the MIC of EGCG combination with each antituberculosis drug was also determined by the same method. The MIC after combination was 0.5 ppm, 0.25 ppm, 20 ppm and 2 ppm for rifampicin, isoniazid, pyrazinamide and ethambutol, respectively. The result shows that the MIC of each first line antituberculosis drug was decreased due to the combination of EGCG. It shows that EGCG gives synergism effect when combined with those drugs, so it can be concluded that EGCG can be used as a complement of antituberculosis drugs for more effective tuberculosis therapy. Keywords: EGCG, First-line antituberculosis drugs, Anti-Mycobacterium tuberculosis, synergism. x

12 DAFTAR ISI Halaman SAMPUL DALAM... i Prasyarat Gelar Magister... ii Lembar Persetujuan... iii Penetapan Panita Penguji Tesis... iv PERNYATAAN ORISINALITAS KARYA ILMIAH... v UCAPAN TERIMA KASIH... vi RINGKASAN... viii ABSTRACT... x DAFTAR ISI... xi DAFTAR TABEL... xiv DAFTAR GAMBAR... xv DAFTAR LAMPIRAN... xvi DAFTAR SINGKATAN... xvii BAB 1 PENDAHULUAN Latar Belakang Masalah Rumusan Masalah Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA Penyakit Tuberkulosis (TB) Patofisiologi Penyakit TB Epidemiologi Penyakit TB Drug-resistance Tuberculosis (DR-TB) Terapi Penyakit TB Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) Obat Antituberkulosis (OAT) Lini Pertama Rifampicin (RIF) Isoniazid (INH) Pyrazinamid (PZA) xi

13 2.3.4 Ethambutol (EMB) (-)-Epigallocatechin-Gallate (EGCG) Sifat Fisikokimia EGCG Mekanisme EGCG sebagai Antimikroba Metode Penentuan Minimum Inhibitory Concentration (MIC) Metode Dilusi Agar (Agar Dilution) Metode Dilusi Cair (Broth Dilution) Metode Difusi Cakram (Disk Diffusion) BAB 3 KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPO PENELITIAN Kerangka Konseptual Penelitian Hipotesis BAB 4 MATERI DAN METODE PENELITIAN Rancangan Penelitian Sampel Penelitian Variabel Penelitian Bahan Penelitian Instrumen Penelitian Lokasi dan Waktu Penelitian Prosedur Pengambilan atau Pengumpulan Data Pembuatan Inokulum Bakteri M. tuberculosis Uji Identifikasi Bakteri M. tuberculosis dengan Uji BTA Ziehl-Neelsen Pembuatan Larutan Baku Induk Pembuatan Larutan Baku Kerja Larutan Baku Kerja RIF Larutan Baku Kerja INH Larutan Baku Kerja PZA Larutan Baku Kerja EMB Larutan Uji EGCG Tahap I: Penentuan MIC OAT Lini Pertama Tahap II: Penentuan MIC Kombinasi OAT Lini Pertama dan EGCG xii

14 4.8 Cara Pengolahan dan Analisis Data BAB 5 HASIL PENELITIAN Penentuan MIC OAT Lini Pertama dan EGCG Penentuan MIC Kombinasi OAT Lini Pertama dan EGCG Perbandingan MIC OAT Lini Pertama Sebelum dan Setelah Kombinasi dengan EGCG BAB 6 PEMBAHASAN BAB 7 KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN LAMPIRAN LAMPIRAN LAMPIRAN LAMPIRAN xiii

15 DAFTAR TABEL Halaman Tabel 2.1 Komposisi Senyawa Polifenol pada Daun Teh Tabel 5.1 Rerata Angka Pertumbuhan dan Persentase Hambatan Pertumbuhan M. tuberculosis pada Penentuan MIC RIF (n=2) Tabel 5.2 Rerata Angka Pertumbuhan dan Persentase Hambatan Pertumbuhan M. tuberculosis pada Penentuan MIC INH (n=2) Tabel 5.3 Rerata Angka Pertumbuhan dan Persentase Hambatan Pertumbuhan M. tuberculosis pada Penentuan MIC PZA (n=2) Tabel 5.4 Rerata Angka Pertumbuhan dan Persentase Hambatan Pertumbuhan M. tuberculosis pada Penentuan MIC EMB (n=2) Tabel 5.5 Rerata Angka Pertumbuhan dan Persentase Hambatan Pertumbuhan M. tuberculosis pada Penentuan MIC EGCG (n=2). 50 Tabel 5.6 Rerata Angka Pertumbuhan dan Persentase Hambatan Pertumbuhan M. tuberculosis pada Penentuan MIC Kombinasi RIF dan EGCG 150 ppm (n=2) Tabel 5.7 Rerata Angka Pertumbuhan dan Persentase Hambatan Pertumbuhan M. tuberculosis pada Penentuan MIC Kombinasi INH dan EGCG 150 ppm (n=2) Tabel 5.8 Rerata Angka Pertumbuhan dan Persentase Hambatan Pertumbuhan M. tuberculosis pada Penentuan MIC Kombinasi PZA dan EGCG 150 ppm (n=2) Tabel 5.9 Rerata Angka Pertumbuhan dan Persentase Hambatan Pertumbuhan M. tuberculosis pada Penentuan MIC Kombinasi EMB dan EGCG 150 ppm (n=2) Tabel 5.10 Hasil MIC OAT Lini Pertama Sebelum dan Setelah Kombinasi dengan EGCG 150 ppm Tabel 6.1 Perbedaan MIC OAT pada Penelitian ini dibandingkan dengan Literatur xiv

16 DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 2.1 M. tuberculosis dengan Pewarnaan Ziehl-Neelsen Gambar 2.2 M. tuberculosis pada Medium Lowenstein-Jensen Gambar 2.3 Struktur RIF Gambar 2.4 Struktur INH Gambar 2.5 Struktur PZA Gambar 2.6 Struktur EMB HCl Gambar 2.7 Struktur EGCG Gambar 3.1 Bagan Kerangka Konseptual Penelitian Gambar 4.1 Bagan Kerangka Operasional Penelitian Gambar 5.1 Grafik Persentase Hambatan Pertumbuhan M. tuberculosis pada Penentuan MIC RIF sebelum dan setelah kombinasi dengan EGCG 150 ppm Gambar 5.2 Grafik Persentase Hambatan Pertumbuhan M. tuberculosis pada Penentuan MIC INH sebelum dan setelah kombinasi dengan EGCG 150 ppm Gambar 5.3 Grafik Persentase Hambatan Pertumbuhan M. tuberculosis pada Penentuan MIC PZA sebelum dan setelah kombinasi dengan EGCG 150 ppm Gambar 5.4 Grafik Persentase Hambatan Pertumbuhan M. tuberculosis pada Penentuan MIC EMB sebelum dan setelah kombinasi dengan EGCG 150 ppm Gambar 5.5 Grafik MIC OAT sebelum dan setelah kombinasi dengan EGCG 150 ppm xv

17 DAFTAR LAMPIRAN Halaman LAMPIRAN 1 Tabel Pengukuran Kekeruhan (Turbidity) LAMPIRAN 2 Tabel Angka Pertumbuhan LAMPIRAN 3 Spesifikasi Standar OAT LAMPIRAN 4 Spesifikasi EGCG LAMPIRAN 5 Komposisi Media Middlebrook 7H xvi

18 DAFTAR SINGKATAN BSC : Bio Safety Cabinet BTA : Bakteri tahan asam DMF : Dimethyl Formamide DMSO : Dimethyl Sulfoxide DR-TB : Drug-resistance Tuberculosis EC : epicatechin ECG : epicatechin-gallate EGC : epigallocatechin EGCG : (-)-epigallocatechin-gallate EMB : Ethambutol FKUI : Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia GC : gallocatechin HIV : Human Immunodeficiency Virus INH : Isoniazid M. tuberculosis : Mycobacterium tuberculosis MDR-TB : Multidrug-resistance Tuberculosis MIC : Minimum Inhibitory Concentration OADC : Oleic acid-albumin-dextrose-catalase OAT : Obat Antituberkulosis p.a. : Pro analisis PAS : para-aminosalicylic acid PCR : Polymerase Chain Reaction PZA : Pyrazinamide RIF : Rifampicin TACO : Tryptophan-Aspartate containing Coat Protein TB : Tuberkulosis WHO : World Health Organization WS : Working Standard XDR-TB : Extensively drug-resistance Tuberculosis xvii